专利名称：一种plga纳米纤维支架的制备及其在组织工程中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程领域，涉及一种组织工程支架，特别涉及一种PLGA纳米纤维支架的制备方法及其在组织工程中的应用。
背景技术：
组织工程学是目前修复人体器官和组织缺损的常用方法，其核心是构建细胞和支架结合而成的复合体。将组织细胞在由生物材料制备的与所修复的组织或器官具有相同构形的支架上进行体外培养，然后再植入体内的病损区域，使之继续增殖分化，最终达到组织或器官的修复、重建和功能恢复。因此，由生物材料制备而成的支架，在组织工程中起着至关重要的作用。组织工程支架不仅为细胞的增殖分化提供了营养环境、气体交换和排除废物的三维空间场所，更重要的是，三维多孔细胞支架具有生物降解性，且适当的降解速度能 和细胞、组织的生长速度相匹配，其降解产物同时也不会对细胞的增长和繁殖产生不利的影响，最终引导细胞分化和形成为具有与病损器官大小和形状相同的新生组织和器官。因此，简而言之，组织工程用的细胞支架必须具备有一定的三维空间结构，良好的生物相容性，良好的细胞亲和性，可降解性，适当的降解速度，一定的力学性能和可消毒性等几个重要的要求。目前通常在制备组织工程用细胞支架的过程中，常采用的有冷冻干燥法、溶液浇铸法、热塑成型法、溶剂挥发法、静电喷涂法、致孔剂法等。采用这些方法制备了多种组织工程支架，用于组织修复取得了一定的效果。但是目前组织工程支架普遍存在细胞支架孔径分布不均匀，大部分细胞支架的孔径太小，在体外培养细胞过程中，细胞无法渗透进入支架的内部，难以实现真正的贯穿三维支架诱导的细胞分化，从而限制了支架/细胞的体内修复效果。因此，组织工程中制备孔径稍大的细胞支架以及实现细胞在三维支架中的均匀接种对于组织工程细胞的分化繁殖和最终实现病损器官修复具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，利用静电纺丝纳米纤维制备技术，提供一种PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)纳米纤维支架的制备方法。本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的PLGA纳米纤维支架。本发明的再一目的在于提供上述PLGA纳米纤维支架在组织工程中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种PLGA纳米纤维支架的制备方法，包括如下步骤(I)配制质量浓度为5% 20%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶液和质量浓度为5% 20%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，搅拌后备用。(2)分别用注射器吸取O. 5 15mL上述两种溶液,安装于两个注射泵中；裁剪一块锡纸，将其固定于静电纺丝接收靶的滚筒中；调节滚筒的转动速度为20 lOOr/min、电压强度为15 25KV、PLGA溶液的注射速度为O. 5 15mL/h、PVP溶液的注射速度为O. 5 15mL/h，然后进行静电纺丝混纺，纺丝沉积在滚筒中的锡纸上，即得到含PLGA和PVP的网络
结构纤维膜。(3)将上述纤维膜从锡纸上取下置于水中，浸泡10 30min，得到具有一定微结构的PLGA纳米纤维支架。步骤(I)中所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液优选为以六氟异丙醇为溶剂进行配制，配制好后再加入5 IOppm罗丹明B溶液。步骤(I)中所述的聚乙烯吡咯烷酮溶液优选为以乙醇为溶剂进行配制，所述的乙醇优选为无水乙醇。步骤(I)中所述的搅拌优选为通过磁力搅拌器充分搅拌。
步骤(2)中所述的注射器为无菌注射器，优选为医用注射器。步骤(2)中所述的锡纸为矩形锡纸，锡纸能够完全覆盖滚筒内壁。一种PLGA纳米纤维支架通过上述制备方法制备得到。上述PLGA纳米纤维支架在组织工程中的应用，包括如下步骤将种子细胞种植到PLGA纳米纤维支架上，体外培养3 7天，待细胞充分粘附、铺展后，将薄膜状的细胞/PLGA纳米纤维支架复合物进行折叠，得到细胞/PLGA纳米纤维支架复合体；将细胞/PLGA纳米纤维支架复合体采用转瓶培养方式继续培养7 14天，得到细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质，该细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质可作为具有特定组织修复功能的组织工程材料。所述的种子细胞为人来源的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞或骨髓间充质干细胞等。所述的种子细胞种植的方法为直接接种法或负压吸引接种法。所述的转瓶培养方式的方法优选为将细胞/PLGA纳米纤维支架复合体用针悬挂在IOOmL转瓶中，加入80mL的培养基，使培养基浸没细胞_材料复合物。设定转速为40r/min,于CO2培养箱中培养，每3天更换培养基。所述的特定组织为皮肤、软骨或骨等。本发明提供的聚乳酸纳米纤维支架，其突出特点是以PLGA和PVP为原料，采用静电纺丝混纺技术，制备PLGA/PVP纤维膜。PVP无细胞毒性，对支架材料无不良影响，PVP在混纺纤维膜中去除后，得到只含目标材料的纳米纤维支架，孔隙率大，孔径大，分布均匀。通过改变PVP的浓度和注射速度，可以得到具有特定微结构(孔径、孔隙率等)的PLGA纳米纤维多孔支架。本发明将聚乳酸纳米纤维支架用于制备组织工程材料，计出了一种“先接种、后成型”的组织工程支架/细胞复合基质的构建方式，完全不同于之前常用的细胞支架“先成型、后接种”的方式；因而克服了由于支架材料成型工艺条件所涉及的苛刻环境，如高温、高压、低温、紫外线等，对于种子细胞的不利影响以及先成型、后接种模式导致细胞在支架上分布不均匀以及细胞无法深入支架内部造成养分及代谢物难以输送等问题。通过改变培养过程中的各种条件，如种子细胞种类，种植方法，折叠次数，可以有效控制所得到多孔支架的功能。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明提供的PLGA纳米纤维支架孔隙率大、孔径大、分布均匀，细胞在支架内可以均勻分布，充分粘附、增殖、分化。(2)本发明利用聚乳酸纳米纤维支架制备组织工程材料采用“先接种、后成型”的构建方式，对支架材料成型工艺条件没有苛刻要求，对种子细胞没有不利影响。(3)通过改变培养过程中的各种条件，如种子细胞种类，种植方法，折叠次数，可以有效控制所得到多孔支架的功能。(4)通过聚乳酸纳米纤维支架制备的组织 工程材料可以广泛地应用于皮肤、软骨、骨等多种组织或器官的重建与再生。
图I是PLGA/PVP静电纺丝混纺支架SEM图。图2是PVP去除后的PLGA纳米纤维支架SEM图。图3是体外培养3天后骨髓间充质干细胞/PLGA复合基质的CLSM图。图4是体外培养7天后骨髓间充质干细胞/PLGA复合基质折叠后的CLSM图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I以六氟异丙醇为溶剂配制质量分数为5%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，LA/GA=75/25,Mv=5000,山东医疗器械研究所)溶液，加入5ppm罗丹明B溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；以无水乙醇为溶剂配制质量分数为5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；分别用25mL注射器吸取O. 5mL PLGA溶液和15mL PVP溶液，安装于两个注射泵中；根据静电纺丝接收靶的滚筒裁剪一块锡纸，将其固定于滚筒中；开启滚筒，使之转动，调节滚筒的转动速度为20r/min ;开启高压电，调节电压强度为15KV，分别调节PVP溶液的注射速度为15mL/h，PLGA溶液的注射速度为O. 5mL/h，使得两者分别在静电场中喷射出细丝，沉积在滚动的滚筒接收靶中；经静电纺丝得到含PVP和PLGA交错纤维网络结构的纤维膜(SEM图如图I所示);轻轻地将沉积在锡纸上的纤维膜取下，用剪刀剪成宽度约为1cm，长度为IOcm的长条状；将此长条状纤维膜片置于盛有水的培养皿中浸泡lOmin，至PVP纤维溶于水后，轻轻地将长条状纤维膜揭起，即得到PLGA纳米纤维支架。从小儿包皮的真皮层分离得到成纤维细胞，并进行传代培养，培养基为含有10%(V/V) FBS (胎牛血清)的DMEM。构建人工皮肤的细胞采用第6 15代人成纤维细胞。将人成纤维细胞采用直接接种法种植于PLGA纳米纤维支架上，体外培养3天后，用镊子操作将长条状纤维支架折叠成长宽约为1cm，厚约为2mm的成纤维细胞/PLGA纳米纤维支架复合体，将该复合体用针悬挂在IOOmL转瓶中，加入80mL的含有10% (V/V) FBS的DMEM培养基，使培养基浸没细胞-材料复合物。设定转速为40r/min，于CO2培养箱中培养，每3天更换培养基，培养7天，得到成纤维细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质，该复合基质可以作为组织工程皮肤用于缺损创面的修复。实施例2以六氟异丙醇为溶剂配制质量分数为20%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，LA/GA=75/25,Mv=5000,山东医疗器械研究所)溶液，加入8ppm罗丹明B溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；以无水乙醇为溶剂配制质量分数为20%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；分别用25mL注射器吸取15mL PLGA溶液和O. 5 mL PVP溶液，安装于两个注射泵中；根据静电纺丝接收靶的滚筒裁剪一块锡纸，将其固定于滚筒中；开启滚筒，使之转动，调节滚筒的转动速度为100r/min。开启高压电，调节电压强度为20KV，调节PVP溶液和PLGA溶液的注射速度分别为15mL/h和O. 5mL/h,使得两者分别在静电场中喷射出细丝,沉积在滚动的滚筒接收靶中；经静电纺丝得到含PVP和PLGA交错纤维网络结构的纤维膜；轻轻地将沉积在锡纸上的纤维膜取下，用剪刀剪成宽度约为1cm，长度为IOcm的长条状，将此长条状纤维膜片置于盛有水的培养皿中浸泡30min ;待PVP纤维溶于水后，轻轻地将长条状纤维膜揭起，即得到PLGA纳米纤维支架(SEM图如图2所示)。以手术中获得的人关节软骨为材料，通过改良二步酶消化法进行人关节软骨细胞的提取，采用含10% (V/V)新生牛血清的高糖型DMEM培养基进行培养。将第3代人软骨细胞采用直接接种法种植于PLGA纳米纤维支架上，体外培养7天后，用镊子操作将长条状纤维支架折叠成长宽约为1cm，厚约为6mm的软骨细胞/PLGA纳米纤维支架复合体，将该复合体用针悬挂在IOOmL转瓶中，加入80mL的含10% (V/V)新生牛血清的高糖型DMEM培养基， 使培养基浸没细胞-材料复合物。设定转速为40r/min，于CO2培养箱中培养，每3天更换培养基，培养7天，得到软骨细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质，该复合基质可以用于软骨缺损的修复。实施例3以六氟异丙醇为溶剂配制质量分数为10%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)(PLGA, LA/GA=75/25, Mv=5000,山东医疗器械研究所)溶液，加入IOppm罗丹明B溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；以无水乙醇为溶剂配制质量分数为15%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；分别用25mL注射器吸取15mL PLGA溶液和3mL PVP溶液，安装于两个注射泵中；根据静电纺丝接收靶的滚筒裁剪一块锡纸，将其固定于滚筒中；开启滚筒，使之转动，调节滚筒的转动速度为50r/min ;开启高压电，调节电压强度为25KV，调节PVP溶液和PLGA溶液的注射速度均为10mL/h，使得两者分别在静电场中喷射出细丝，沉积在滚动的滚筒接收靶中；经静电纺丝得到含PVP和PLGA交错纤维网络结构的纤维膜；轻轻地将沉积在锡纸上的纤维膜取下，用剪刀剪成宽度约为1cm，长度为IOcm的长条状，将此长条状纤维膜片置于盛有水的培养皿中浸泡20min ;PVP纤维溶于水后，轻轻地将长条状纤维膜揭起，即得到PLGA纳米纤维支架。以人工髋关节置换术中切下的股骨头和膝关节置换术中切下的股骨髁的松质骨作为成骨细胞来源，分离培养和鉴定。将第3代人成骨细胞采用负压吸引种植技术种植于PLGA纳米纤维支架上，体外培养3天后，用镊子操作将长条状纤维支架折叠成长宽约为Icm,厚约为的5mm成骨细胞/PLGA纳米纤维支架复合体，将该复合体用针悬挂在IOOmL转瓶中，加入80mL的培养基(该培养基为含10% (V/V)胎牛血清的DMEM与F12按I: I比例配制的混合培养基)，使培养基浸没细胞-材料复合物。设定转速为40r/min，于CO2培养箱中培养，每3天更换培养基，培养14天，得到成骨细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质，该复合基质可用于骨缺损的修复。实施例4
以六氟异丙醇为溶剂配制质量分数为10%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)(PLGA，LA/GA=75/25,Mv=5000,山东医疗器械研究所)溶液，加入几滴罗丹明加入5ppm罗丹明B溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；以无水乙醇为溶剂配制质量分数为15%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀；分别用25mL注射器吸取O. 8mL PLGA溶液和2mL PVP溶液，安装于两个注射泵中；根据静电纺丝接收靶的滚筒裁剪一块锡纸，将其固定于滚筒中；开启滚筒，使之转动，调节滚筒的转动速度为50r/min ;开启高压电，调节电压强度为25KV，调节PVP溶液和PLGA溶液的注射速度均为10mL/h，使得两者分别在静电场中喷射出细丝，沉积在滚动的滚筒接收靶中；经静电纺丝得到含PVP和PLGA交错纤维网络结构的纤维膜；轻轻地将沉积在锡纸上的纤维膜取下，用剪刀剪成宽度约为1cm，长度为IOcm的长条状，将此长条状纤维膜片置于盛有水的培养皿中浸泡15min ；PVP纤维溶于水后，轻轻地将长条状纤维膜揭起，即得到PLGA纳米纤维支架。用单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年人骨髓间充质干细胞，将第3代骨髓间充质干细胞采用负压吸引种植技术种植于PLGA纳米纤维支架上，体外培养3天后，用镊子操作将长条状纤维支架折叠成长宽约为I. 5cm，厚约为的4mm骨髓间充质干细胞/PLGA纳米纤维支架复合体(CLSM图如图3所示)，将该复合体用针悬挂在 IOOmL转瓶中，加入80mL的培养基(该培养基为含10%(V/V)胎牛血清的低糖DMEM中加10_8地塞米松、2. 16g/L β-磷酸甘油、10_8mol/L维生素D3)，使培养基浸没细胞-材料复合物。设定转速为40r/min，于CO2培养箱中培养，每3天更换培养基，培养7天，得到骨髓间充质干细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质(CLSM图如图4所示)，该复合基质可作为修复骨组织的材料。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种PLGA纳米纤维支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)配制质量浓度为5% 20%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和质量浓度为5% 20%的聚乙烯吡咯烷酮溶液，搅拌后备用； (2)分别用注射器吸取0.5 15mL上述两种溶液，安装于两个注射泵中；裁剪一块锡纸，将其固定于静电纺丝接收靶的滚筒中；调节滚筒的转动速度为20 lOOr/min、电压强度为15 25KV、聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的注射速度为O. 5 15mL/h、聚乙烯吡咯烷酮溶液的注射速度为O. 5 15mL/h，然后进行静电纺丝混纺，纺丝沉积在滚筒中的锡纸上，即得到含聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯吡咯烷酮的网络结构纤维膜； (3)将上述纤维膜从锡纸上取下置于水中，浸泡10 30min，得到PLGA纳米纤维支架。
2.根据权利要求I所述的PLGA纳米纤维支架的制备方法，其特征在于 步骤(I)中所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液以六氟异丙醇为溶剂进行配制，配制好后再加入5 IOppm罗丹明溶液； 步骤(I)中所述的聚乙烯吡咯烷酮溶液以乙醇为溶剂进行配制； 步骤(I)中所述的搅拌为通过磁力搅拌器充分搅拌。
3.根据权利要求2所述的PLGA纳米纤维支架的制备方法，其特征在于所述的乙醇为无水乙醇。
4.根据权利要求I所述的PLGA纳米纤维支架的制备方法，其特征在于 步骤(2)中所述的注射器为无菌注射器； 步骤(2)中所述的锡纸为矩形锡纸，锡纸能够完全覆盖滚筒内壁。
5.根据权利要求4所述的PLGA纳米纤维支架的制备方法，其特征在于所述的注射器为医用注射器。
6.一种PLGA纳米纤维支架，其特征在于由权利要求I 5任一项所述的制备方法得到。
7.权利要求6所述的PLGA纳米纤维支架在组织工程中的应用。
8.根据权利要求7所述的PLGA纳米纤维支架在组织工程中的应用，其特征在于包括如下步骤将种子细胞种植到PLGA纳米纤维支架上，体外培养3 7天，待细胞充分粘附、铺展后，将薄膜状的细胞/PLGA纳米纤维支架复合物进行折叠，得到细胞/PLGA纳米纤维支架复合体；将细胞/PLGA纳米纤维支架复合体采用转瓶培养方式继续培养7 14天，得到细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质，该细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质可作为具有特定组织修复功能的组织工程材料。
9.根据权利要求8所述的PLGA纳米纤维支架在组织工程中的应用，其特征在于 所述的种子细胞为人来源的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞或骨髓间充质干细胞； 所述的种子细胞种植的方法为直接接种法或负压吸引接种法； 所述的转瓶培养方式的方法为将细胞/PLGA纳米纤维支架复合体用针悬挂在IOOmL转瓶中，加入80mL的培养基，使培养基浸没细胞-材料复合物。设定转速为40r/min，于CO2培养箱中培养，每3天更换培养基。
所述的特定组织为皮肤、软骨或骨。
全文摘要
本发明公开了一种PLGA纳米纤维支架的制备及其在组织工程中的应用，属于组织工程领域。该方法以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为原料，采用静电纺丝混纺制备含两种材料的纤维薄膜，在水溶液中将PVP溶解去除，获得具有一定微结构的PLGA纳米纤维支架。将种子细胞接种PLGA纳米纤维支架上，体外培养，将细胞/PLGA纳米纤维支架复合物进行折叠，再采用转瓶培养方式培养7～14天，得到细胞/PLGA纳米纤维支架复合基质，该复合基质可作为具有特定组织修复功能的组织工程材料植入动物模型。本发明所制备工艺简单可行，重复性好，可广泛地应用于组织工程领域。
文档编号A61L27/16GK102886068SQ20121035602
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者谢德明, 郭瑞 申请人:暨南大学