专利名称：智能型纳米递送系统、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物大分子和有机小分子(包括药物)细胞输送的一个智能型纳米递送系统，其制备方法及在药物细胞输送中的应用。本发明进一步提供一个细胞输送的纳米技术平台。
背景技术：
人类端粒酶逆转录酶(hTert)是一个催化亚基或催化分子实体。已经证明这个催化亚基能够同时组合成端粒酶全酶，即在人类细胞内组合成的全酶和另一个RNA成份(hTert)的复合体。人类端粒酶逆转录酶的蛋白成份(hTert)是一个催化分子亚基。实验表明，这个亚基可以同时和RNA成份(hTert)组成一个全酶。在自然 界，端粒酶可以通过延长染色体末端的端粒修复染色体DNA。不正常长度的端粒或端粒加速缩短在一系列与年龄有关的疾病中扮演着重要的病理角色，比如原因不明的肺部纤维化、先天性角化不良、皮癣、动脉硬化、骨质疏松、眼睛视网膜黄斑退行性病变。正常的端粒变短在人类和动物衰老过程中扮演着重要的角色。科学家认为端粒酶可以减缓某些疾病的病情，如上述疾病。可见，投递端粒酶作一个药物分子对减缓以上病理现象具有很大的潜力，开发端粒酶药物有望带来一个新的药物研发方向，可能会导致新药物的开发，第一次能够治疗一些以往认为的不治之症。端粒酶被普遍认为是一个非常有用的治疗疾病的生物大分子，是治疗性药物蛋白质。同时，临时性/短暂性的细胞稳定态(无细胞凋亡)是在hTert端粒酶蛋白亚基在培养皿细胞中观察到的，细胞的永久性生存可以安全的转移到活体内(美国专利6，358，739)。后来科学家还建议这个细胞不老化概念可以用于人体组织、器官、系统甚至整体。尽管投递端粒酶来治疗疾病的前景令人向往并具潜力，但由于目前基因投递的局限性限制了实际使用端粒酶治疗疾病的可能性。从药物研发和创新的角度来看，一种安全有效投递端粒酶或端粒酶催化亚基(hTert)进入细胞的实用方法急需开发，这种创新的投递方法将有助于减缓与年龄有关的严重疾患。一种安全、有效投递这些特殊类别的酶可能通过使用具生物降解、生物兼容特点的纳米粒来实现。研究已经观察到在投递大分子和酶到细胞内时由乳酸和羟基乙酸双聚合而成的生物降解性纳米粒(PLGA)能携带这些酶迅速(少于10分钟)逃离溶酶体，从而保护酶分子不被溶酶体消化和破坏。生物降解性纳米粒实验表明能用于以一种慢速率向细胞内投递一系列有疗效的生物大分子，如蛋白质和小分子量的药物，如地塞米松，可带来持续性的治疗效果。相反，投递的分子可以通过生物工程的手段来实现快速释放。尽管多肽能穿透细胞，如VP22已经在细胞水平证明可作为一个有效地投递端粒酶亚基(hTert)基因(美国专利6，358，739)的方法。在药物和基因投递方面，与其它聚合物载体相对比，聚乳酸_羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒载体具有诸多优势，包括生物降解性、生物兼容性，并被美国食品和药物管理局批准用于人体药物投递。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒在科学界、医疗和药物开发领域已经被广泛、深入地研究过，被认为是一种非常可靠的方法来持续性向细胞内投递生物大分子。蛋白质被包封在纳米粒内的过程还没有变成一个非常简单和容易重复的科学过程，蛋白质的投递在成功之前需要大量的研发工作和优化工作，因为每一个蛋白质的分子量、疏水性和稳定性都不一样。本质上来讲，每一类蛋白质以纳米粒方式投递需要特定的研发手段，从小规模到大规模，最后到临床试验，以验证纳米粒的可行性，同时研究和开发出合适的配置方法。—个蛋白质是否代表一种新的药物，主要是由其分子大小而决定。正确的纳米粒配置方法，主要是由蛋白质的稳定性、分子量和水溶性来决定。端粒酶(hTert)的蛋白成份有1，132个氨基酸，分子量是126，997道顿，从生物学的角度的说是一个异乎寻常大的分子，而完整的端粒酶总和的分子量将近翻倍。端粒酶通常认为非常不稳定，并且仍不知道端粒酶是否能够成功地包裹在PLGA纳米粒里，以活性功能状态下投递到细胞内。基于端粒酶的不稳定性，尤其是需要穿透细胞核的核膜，目前还没有足够科学研究能把有活性功能的端粒酶投递到细胞内的过程简单化。必须能够证实一旦投递到细胞核内，一定能够延长人类染色体末端的端粒。本发明展示了一种包封人类端粒酶的纳米粒方法及其组成成份，端粒酶蛋白质亚基(hTert)和它的RNA亚基(hTR)，以及一些其它的变种，能被包封在有生物降解性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒内，从而投入到细胞内部，包括培养皿内的细胞和活体动物细胞。由于纳米粒的降解性，投递之后纳米粒能释放出端粒酶出来，并以一种持续性疗效方式能成功地延长细胞核内的端粒区。心肌梗塞或大脑中风是一种心脏或大脑功能的突然丧失，是由通向心脏或大脑的血流受阻而导致的心脏或大脑突然缺血而造成的。心脏或脑缺血后，心脏和大脑的破坏有多种因素参与。研究表明，在这些因素中，“氧化压力”在心脏或大脑缺血过程中扮演着 非常重要的角色。氧化压力通常是由于细胞内过量产生的超氧化物离子，过氧化氢或其它含氧自由基导致的，这些超氧化物离子或过氧化氢可转化成具有对细胞具有强破坏能力的氧化剂。例如轻基自由基和过氧化氮自由基。通常情况下，体内自由基的生产非常有限，通过超氧化物歧化酶和过氧化氢酶这些自由基清道夫将自由基代谢或中和。但是，在一些病理情况下，氧自由基会累积，这种累积可以破坏细胞，比如在脑部缺氧、缺血的状态下，自由基大量累积可以达到对脑细胞的损害。另外，脑缺血之后的再灌注也产生自由基，即血栓去除后血液恢复供应会产生过多的自由基，从而导致对脑部的损害。大脑对氧化压力引起的破坏是非常敏感的，因为在大脑内含有大量的不饱和脂肪酸，相对低的神经组织中的抗氧化酶来抵抗或中和自由基造成的危害。科学研究表明，自由基和相关反应活性的氧气分子参与了大脑组织的破坏，这些破坏是在暂时性大脑缺血后产生的。同时，过氧化物歧化酶和谷胱甘肽的活性在脑中风的病人中相对于对照组显著下降，缺氧面积的大小、大脑受破坏程度、短期的预后都与这些酶的活性有直接关系。这些研究表明，过氧化物离子、过氧化氢和一些其它过氧离子是主要有反应性的氧化自由基，在缺氧造成的脑组织损伤中扮演重要角色。天然的自由基清道夫如过氧化物歧化酶或过氧化氢酶，它们的特点是在对抗氧化剂方面有非常高的稳定性和效率。这两种酶以天然形式已经使用来预防氧化性破坏，但是研究发现只有重复地给予这些酶或对局部细胞、组织投递这些酶才有治疗效果。一般的靶向投递或不太理想的药物动力学限制了这些酶的使用。向大脑投递过氧化物歧化酶，通过使用原(前)药或载体系统如抗体、微脂囊和表面修饰，如聚乙二醇与过氧化物歧化酶结合体(SOD-PENG)等方法均已经尝试过。但是，脑部缺血和血液再灌注造成的损伤治疗一直受到限制，因为这些物质对大脑细胞的穿透力太差。基因疗法是另外一种投递方法，但是基因投递到脑细胞组织后，基因的表达速度较慢，并不能立即发挥作用。是一种抑制肿瘤生长的基因。在人类可染的癌症中，出现该基因突变的临床比例已经过半。经过这种基因编码的蛋白质(p53蛋白)是一种转录因子，控制着细胞周期的启动。P53蛋白是接收许多有关细胞代谢信号的重要生物分子。例如关于是否开始细胞分裂就由P53蛋白来决定。如果细胞内DNA受损，且不能得到修复，p53蛋白将参与启动过程使该受损细胞进入凋亡和死亡。有P53蛋白分子缺陷的细胞则没有这种控制能力，甚至在细胞不应繁殖和生长的情况下继续进行细胞分裂。正如其它抑癌因子一样，P53在正常情况下对细胞分裂起着监视的作用。细胞中抑制癌变的P53能判断DNA变异的大小，如果变异较小，P53促使细胞自我修复；若DNA变异较大，p53诱导细胞凋亡。
蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。现已认识至IJ，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能。而野生型/7%基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。基因疗法”是中国和世界创新药物发展历史上的一个重要里程碑，但与其不同的是，本发明通过使用抑癌蛋白分子，如P53蛋白，(而不是DNA)作为药物，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)或其它聚合物纳米粒(而不是基因工程改造过的活病毒)作为P53或其它蛋白分子药物输送载体，提供了一种全新的“抑癌蛋白纳米粒疗法”，用于治疗恶性肿瘤和其它与抑癌因子基因突变或功能低下有关的疾病。以商品名立普妥由辉瑞公司营销的阿托伐他汀药品属众所周知的他汀类药物，用于降低血液胆固醇浓度。该药物通过抗炎症和其他机制具有稳定血栓和预防中风的作用。与所有他汀类药物相似，阿托伐他汀作用于抑制在肝组织内发现的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，该酶在人体胆固醇的合成中起关键性作用。立普妥是治疗异常血脂市场中遥遥领先，2007年的销售量比2006年增加4. 7%，达135亿美元。立普妥的成功主要源于三方面因素倾向用于早期血脂异常，达到积极的治疗性干预；立普妥卓杰的治疗效果；由辉瑞公司以其品牌效应支持下的积极并精良酝酿的市场推广。尽管市面上有几种非专利他汀类药物，但立普妥对重度异常血脂且没有其他高危因素病人更有成本-效果，没有任何一种药物象立普妥那样针对中度到重度病人提供如此宽大的有效剂量范围，也没有象ASCOT试验表明如此快速有效地控制血脂。其结果，立普妥提供医生几乎是单一药物的解决方案，而且被证明相当的普及。
权利要求
1.ー种具有定向专ー递送(靶向性)并可持续、定量释放活性药物的纳米药物释放系统，其特征在干，该系统包括作为活性药物的治疗性活性肽或其它生物大分子或有机小分子(包括药物)，及至少ー种生物降解性多聚物，ー种惰性塑化剂，及用于组织、细胞准确专ー传递的祀向分子定位部分。
2.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述生物降解性多聚物可以是下述中的任何一种物质或几种不同物质之间的组合聚乳酸-羟基こ酸共聚物，聚乳酸，聚亚烷基ニ醇，聚丙烯酸正丁酷，甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸共聚物，聚烷基胺，聚酸酐，聚羟基丁酸和聚原酸酷。
3.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述专一定向递送的革巴向分子定位部分可以是氨基酸序列HIV-ITAT穿透肽YGRKKRRQRRR，YARAAARQARA, YGRKKRRQRRR, YARKARRQARR, YARAARRAARR, YARAARRAARA, YARRRRRRRRR, RQIKIffFQNRRMKffKK,或GffTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL0
4.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述ー种实现持续释放活性物质有效剂量的方法包括给与受治疗者由上述权利要求I定义的纳米药物释放系统，从而在受治疗者体上实现持续释放有效剂量的活性物质。
5.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述一种实现定量释放活性物质有效剂量的方法包括给与受治疗者由上述权利要求I定义的纳米药物释放系统，从而在受治疗者体上接受一定有效剂量的活性物质。
6.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的惰性增塑剂可以是L-酒石酸ニ甲酷、柠檬酸三こ酯或三醋酸甘油酷。
7.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的作为活性药物的治疗性活性肽可以是转录后未化学修饰或已化学修饰的寡肽、多肽、蛋白质、酶分子(包括这些分子的亚基和/或辅基)。
8.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的作为活性药物的治疗性活性其它生物大分子可以是核酸类、多糖类、脂肪类或纤维类。
9.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，其特征在于，所述的作为活性药物的治疗性有机小分子可以是化学合成小分子药物类、天然小分子药物类或天然生物有机小分子。
10.如权利要求3所述的纳米药物释放系统，靶向分子定位部分的氨基酸序列如HIV-ITAT穿透肽YGRKKRRQRRR化学共价偶联于纳米粒上，其特征在于，包含以下步骤 a.40毫克载药纳米粒子分散在4mL的硼酸盐缓冲液中(pH5. 0)，12毫克DENACOじ524(五环氧树脂)溶解在等体积的硼酸盐缓冲液，将两者混合，由四氟硼酸锌作为催化剂，于37° C条件下反应进行30分钟，并轻轻搅拌，未反应DENAC0L8 524用超速离心分离，将之与纳米粒分开，再用硼酸盐缓冲液对纳米粒冲洗一次； b.环氧活化的载药纳米粒首先悬浮于硼酸缓冲液中，然后与TAT短肽混合在4毫升硼酸盐缓冲溶液内，在37° C的条件下，反应进行30分钟，未參与反应的TAT短肽经超速离心分离，分开清除，纳米粒反复用清水洗干净。
11.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，本发明提供了递送有效剂量端粒酶或其催化亚基或上述两种物质之变种复合物从而治疗人类衰老疾病的方法。
12.如权利要求11所述的端粒酶的纳米颗粒化和细胞递送方法，其特征在于，该方法有以下步骤组成人类重组端粒酶或hTert蛋白的PLGA纳米粒通过使用一种双乳化溶剂蒸发技术制备而成；端粒酶全酶和端粒酶hTert催化蛋白亚基分别被包封在具生物降解性的PLGA聚合物中，制备成纳米粒；转染人类成纤维细胞后端粒酶成份缓释，治疗性地延长细胞染色体端粒的长度。
13.一种治疗人类衰老疾病的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求I制备的纳米粒作为端粒酶分子载体，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，达到逆转或减缓一种或多种与“端粒变短”相关的生命衰老疾病。
14.如权利要求I所述的纳米药物释放系统，本发明提供了向活体递送有效剂量活性超氧化物歧化酶或其它抗氧化酶或若干种抗氧化酶物质的混合物的方法，从而治疗和预防与急性或慢性自由基过量产生有关的人类疾病，包括但不限于心血管疾病、中风、癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、风湿性关节炎、老年痴呆症、帕尔金斯症、过敏、哮喘、红斑狼疮、皮肤癣和白癜风。
15.如权利要求14所述的向活体递送抗氧化酶大分子的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求I制备的纳米粒作为抗氧化酶分子载体，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，达到治疗或预防一种或多种与“自由基过量产生”相关的炎症疾病或人体衰老。
16.向活体递送一种或几种有效剂量抑癌蛋白，如p53，pl6，pRb，PTEN，WTl蛋白，等，从而治疗癌症或其它细胞繁殖失控疾病的方法。
17.如权利要求16所述的向活体递送抑癌蛋白的方法，其特征在于，纳米粒的制备步骤是 a.聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)(30毫克；50:50，固有粘度I. 30)溶解于I毫升氯仿中，3毫克酒石酸二甲酯(DMT的或酒石酸二酯，密度I. 2克/毫升)溶解在上述聚合物溶液，10毫克大鼠血清白蛋白(RSA)和20微克p53蛋白溶解于300微升水中； b.在下列实验条件下涡旋I分钟，超声分散2分钟，能量输出55瓦，用探针超声仪将蛋白质溶液和PLGA溶液乳化在一起，由此产生的乳液，在与上述完全相同的实验条件下，进一步乳化在12毫升的2% PVA溶液中(PVA平均分子重量30，000-70, 000)，PVA溶液在使用之前，要通过O. 22微米注射器的过滤和用氯仿饱和；往PVA溶液中加入几滴氯仿，摇动，上清液用于纳米粒的制备，P53蛋白纳米粒的冷冻干燥过程、包封率、纳米直径大小测定、Zeta电位均与本发明权利要求I相同。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，通过口腔服用，动脉或静脉注射，皮肤表面涂用或其它常见的普通药物投递方法向需要治疗的患者提供，已达到逆转或减缓一种或多种疾病与“细胞繁殖失控”相关的恶性肿瘤、冠心病等。
19.向活体递送辅酶QlO从而治疗或预防因辅酶QlO缺少造成的疾病的方法，辅酶QlO纳米粒是通过使用乳化扩散蒸发技术来制备完成的，其步骤是50毫克PLGA (50:50)和5毫克辅酶QlO溶于2. 5毫升乙酸乙酯在室温搅拌30分钟，有机相逐滴(I. O毫升/分钟)力口入5毫升含有稳定剂的水相。乳液的液滴体积缩小由高速均质机(转速10000rpm,时间15分钟)均质化完成，由此产生的乳液倒入25毫升的水中，并不断搅拌，从而产生纳米沉淀物和纳米粒的形成。纳米粒悬浮液在不同的离心速度和离心时间条件下(15000g,5分钟；25000g,40000g, 15分钟)重新收集水洗涤过的纳米粒，然后再悬浮在水中，此过程重复3次以去除多余的表面活性剤，然后冷冻干燥最后收集辅酶QlO纳米粒。
20.一种递送有效剂量向活体递送阿托伐他汀(Atorvastatin — Lipitor)用于降低血液胆固醇浓度，通过抗炎症和其他机制，稳定血栓和预防中风的方法，阿托伐他汀纳米粒是通过使用乳化扩散蒸发技术来制备完成的。
21.如权利要求20所述的的方法，其特征在于，纳米粒的制备步骤是 a.其步骤是牛血清白蛋白-FITC(BSA-FITC标记)被选定为代理蛋白封装物质是因其具备优异的理化性质和荧光信号，用FITC荧光标记的蛋白质与PLGA包封在一起的纳米粒是通过ー种新型的双重乳化溶剂蒸发技术来制备完成的； b.FITC荧光标记的蛋白质溶于200uLPBS缓冲溶液或0. 0IN盐酸溶液中，然后，将其加到聚合物溶液(含30毫克PLGA 50 50，固有黏度I. 32dL/g (Lactel 产品)/ImL ニ氯甲烷(DCM)或27毫克PLGA和3毫克酒石酸ニ甲酯(DMT) /DCM的I毫升)，涡旋混合，使用超声仪3000和微探针进行乳化，在冰上乳化2分钟，探针设置位置为3 (Misonix)； c.乳液加入6毫升用DCM饱和过的聚こ烯醇(PVA)溶液(2%w/v PBS缓冲溶液)，涡旋形成双乳液，在冰上用超声波能量(设置强度为3)处理5分钟，由此产生的双重乳液在化学通风柜内室温下搅拌18小时，然后在真空状态下搅拌I小时，最終蒸发掉DCM残留物； d.由此形成的PLGA纳米粒通过超速离心分离获得样品(100，000RCF，20分钟，4°C，WX80超速离心机，使用转子T-865)，相应的上清液保留，为后续蛋白质包封效率分析使用； e.纳米粒子通过吸管和超声波使之悬浮于IOmlPBS缓冲溶液中，重复两次以上超速离心和悬浮步骤以便清除PVA残留物和未能包裹到纳米粒中的蛋白质； f.纳米颗粒溶解在5毫升无菌、无核酸酶的水中，分装到预先称重、无菌试管中进行冷冻(-80° C)和冻干，获得干粉制备产物并称重。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，通过口腔服用或静脉注射向需要治疗的患者提供，已达到逆转或减缓与人体血液胆固醇超标有关的ー种或多种疾病。
23.如权利要求1_3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为端粒酶。
24.如权利要求1_3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为抗氧化酶。
25.如权利要求1_3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为抑癌蛋白。
26.如权利要求1_3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为阿托伐他汀。
27.如权利要求1_3、6任一项所述的药物释放系统，其所述活性药物为辅酶Q10。
全文摘要
本发明公开了一种可以向细胞输送生物大分子和有机小分子的智能型纳米粒药物释放系统、其制备方法及其在生物大分子和有机小分子(包括药物)细胞输送的应用。通过递送药物分子、细胞营养及细胞排毒的生物化学物质,达到干预生理和病理代谢的目的。应用本发明投递分子的实施例包括但范围不限于以下分子:(1)端粒酶(Telomerase)细胞投递；(2)抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(HPX)，等]细胞投递；(3)抑癌蛋白(如p53、PTEN,等)细胞投递；(4)有机化学和生物化学小分子[如阿托伐他汀(Atorvastatin－立普妥)、辅酶Q-10,等]细胞投递。本发明涉及的纳米粒药物输送系统的分子缓释和控制具有独特性和靶向性，故称“智能型纳米粒”。
文档编号A61P25/28GK102861340SQ201210379879
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年3月15日
发明者翟国堂 申请人:杨文莉, 朱文元