一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽及基因疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽，该多肽的氨基酸序列为：Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。本发明构思巧妙，利用Aβ1-42羧基端多肽Aβ31-42作为抗原，既避免了Aβ16-30诱发的Th1型免疫细胞介导的自我免疫性炎症反应，又能有效的诱导机体产生识别Aβ1-42羧基端的抗体，阻止Aβ寡聚，有效的抑制Aβ寡聚体的神经毒性，达到治疗AD的目的。
【专利说明】一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽及基因疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多肽及基因疫苗，特别涉及一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽及基因疫苗。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(Alzheim`er’ s Disease, AD)即所谓的老年痴呆症,是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。
[0003]AD多起病于老年期，潜隐起病，病程缓慢且不可逆，临床上以智能损害为主。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见β淀粉样蛋白(Amyloid β, Aβ )斑块，神经原纤维缠结等病变，胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。其中β淀粉样蛋白斑块与神经原纤维缠结是AD的两大核心病理特征，其核心成分分别是β淀粉样蛋白(Αβ)及过磷酸化τ蛋白。AD的发病机制存在多种假说，由于β淀粉样斑块是所有AD患者脑内最为突出的病理特征，其主要由Αβ构成以及寡聚Αβ呈现显著的神经毒性作用，目前居于学术主流地位的AD病理损害机制是A β假说。该假说认为，淀粉样前体蛋白(Amyloid Precurso`r Protein, APP)通过β分泌酶及Y分泌酶剪切生成Αβ多肽(40_42aa)，Ai3多肽可以通过疏水相互作用形成Aβ寡聚体，Αβ寡聚体又可以通过进一步聚集形成Αβ沉积。Αβ寡聚体可以引起突触功能障碍，同时，Αβ的寡聚体及沉积可以促进τ蛋白的过磷酸化及小胶质细胞活性化炎症反应从而促进神经原纤维缠结的形成，所以Αβ寡聚体被认为是造成AD的主要原因。
[0004]基于Αβ假说，科学家提出了利用A β多肽片段对AD病人进行主动免疫治疗的治疗方案。Schenk等人发现，利用全长过表达的转基因小鼠(PDAPP小鼠)进行主动免疫，可以清除转基因鼠脑内的Αβ沉积并提高其记忆能力。爱尔兰Elan公司与美国Wyeth-Ayert实验室共同开发了 Ai^42多肽加佐剂QSl组成的疫苗ΑΝ-1972，可是在II临床研究中，发现其可以在6%的病人中引起无菌性脑炎，所以临床试验被迫中止。在随后的研究中发现，T细胞表位主要位于A β 16_3(|，可以诱发Thl型免疫细胞介导的自我免疫性炎症反应,而B细胞表位主要在A β卜15，可以诱导Th2型免疫细胞介导的体液免疫反应。为了避免T细胞表位诱发的不良反应，新一代的AD疫苗多利用A β卜15中的B细胞表位作为抗原对机体进行主动免疫，如，诺华开发了基于A β η的多肽疫苗。近期研究发现，的寡聚主要依靠于位于12-24,30-40位的氨基酸残基，因此能够与这两段肽段结合的抗体可以有效的阻止A β寡聚化，有效降低其神经毒性，达到减缓、阻止或逆转AD病情进展的目的，而识别Ai^_42氨基端的抗体无法达到有效阻止A β寡聚的效果。也有研究证明，Αβ37_42*
最短的B细胞表位，可以在小鼠内引发体液免疫反应。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽及基因疫苗。[0006]为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽，是如下任一所述的多肽:
1)氨基酸序列如SEQID NO:1所示的多肽；
2)由SEQID NO:1进行1_6个的取代和/或缺失和/或添加的由SEQ ID NO:1衍生的多肽。
[0007]作为优选方式，是如下任一所述的多肽:
1)氨基酸序列如SEQID N0:2所示的多肽；
2)由SEQID NO:2进行1_6个的取代和/或添加的由SEQ ID NO:2衍生的多肽。
[0008]本发明多肽还包括在上述氨基酸序列上增加或减少1-10个氨基酸的多肽。
[0009]上述多肽在制备用于阿尔兹海默症治疗药物或疫苗中的用途。
[0010]一种含有上述多肽的多肽疫苗。
[0011]作为优选方式，多肽疫苗还包括一种载体和/或佐剂。
[0012]进一步优选，所述佐剂选自福氏佐剂、氢氧化铝佐剂、琥珀酰化钥孔慽血兰蛋白、牛血清白蛋白、热休克蛋白、霍乱毒素B亚单位或糖甙Quil A0
[0013]进一步优选，所述载体选自琥珀酰化钥孔慽血兰蛋白、牛血清白蛋白、热休克蛋白、霍乱毒素B亚单位、白细 胞介素-4 (白介素-4，Interleukin-4, IL-4)、白细胞介素-6(白介素 _6，Interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10 (白介素 _10，Interleukin-10,IL-10)或 PEDI 假单胞菌外毒素 A 受体结合域(receptor-binding domain (Ia) ofPseudomonas exotoxin A)。
[0014]进一步优选，所述载体与多肽通过共价键偶联方式或其他方式功能性相结合。
[0015]上述多肽疫苗在制备用于阿尔兹海默症治疗药物中的用途。
[0016]表达上述多肽疫苗的DNA疫苗，所述载体和/或佐剂与多肽通过DNA质粒共表达。
[0017]上述DNA疫苗在制备用于阿尔兹海默症治疗药物的用途。
[0018]表达如上述多肽疫苗的基因疫苗，所述载体和/或佐剂与多肽通过病毒载体共表达。
[0019]作为优选方式，所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒或仙台病毒。
[0020]上述的基因疫苗在制备用于阿尔兹海默症治疗药物中的用途。
[0021]本发明多肽及疫苗可以诱导机体产生针对Αβ羧基端的抗体，阻止了 Αβ羧基端肽段之间的疏水相互作用，所以可以有效的阻止A β的寡聚。
[0022]综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:
本发明构思巧妙，利用Αβ卜42羧基端多肽Αβ 31_42作为抗原，既避免了 Αβ 16_3(|诱发的Thl型免疫细胞介导的自我免疫性炎症反应，又能有效的诱导机体产生识别A β卜42羧基端的抗体，阻止A β寡聚，有效的抑制A β寡聚体的神经毒性，达到治疗AD的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中:
图1是实施例1中C57BL/6J小鼠特异抗体结果图；
图2是实施例1中APP/PS1鼠特异抗体结果图；
图3是实施例1中体液免疫降低脑脊液中Aβ浓度结果图；图4是实施例1中定位导航实验结果图；
图5是实施例1中空间探索实验结果图。
【具体实施方式】
[0024]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0025]本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0026]实施例1:
1、实验用品如下:
抗原:Αβ31_42，A β 34-42, Αβ37_42多肽，使用Fmoc固相合成法直接合成，然后与牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA),琥拍酰化钥孔慽血兰蛋白(keyhole limpethemocyanin, KLH)偶联形成蛋白-多肽复合物。
[0027]KLH:Α β 31-42, KLH:Α β 34_42，KLH:Α β 37_42 多肽:琥珀酰化钥孔慽血兰蛋白(keyholelimpet hemocyanin, KLH)偶联 Aβ 3卜42，Aβ 34-42? Αβ37_42 多妝。
[0028]BSA: Αβ31_42 多妝:牛 血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)偶联 A β 31_42 多肽。
[0029]2、受试动物:
免疫小鼠:10只十周龄C57BL/6J小鼠或AD模型鼠APPswe/PSlΔΕ9 (下称APP/PS1鼠)，分别于0，2，4周时使用经不完全福氏佐剂(Incomplete Freund Adjuvant , IFA)乳化的KLH:Α β 31-42, KLH:Α β 34_42，KLH:Α β 37_42多肽经肌肉注射进行免疫，每只每次使用10 μ g抗原。对照组使用KLH。
[0030]实验方法:
酶联免疫吸附测定(ELISA):用PBS (中性磷酸盐缓冲溶液)将与BSA:Αβ 31_42多肽稀释至2yg / ml，每孔加60μ 1，4°C温度下放置10小时至12个小时，弃去孔内溶液，用PBS洗3次，每次3分钟。75 μ I 15%使用胎牛血清(FBS)于37°C封闭I小时。用含0.05%(v/V) Tween20的PBS洗4次.使用含15% FBS, 0.05% Tween20的PBS将待检样品稀释，然后在上述已包被的反应孔待检样品，每孔50 μ I。同时做空白、阴性及阳性孔对照。置37°C孵育lh，洗涤。于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗IgG抗体)100 μ 1,37°C孵育30-60分钟，洗涤，最后一遍用双蒸水洗涤。于各反应孔中加入临时配制的邻苯二胺(O-Phenylenediamine Dihydrochloride, 0PD)底物溶液 100 μ I, 37。。30 分钟。然后于各反应孔中加入100 μ I IM HCl中止反应。使用酶标仪读取反450nm处的OD值作为反应结果。
[0031]脑脊液(Cerebro-Spinal Fluid，CSF)中Aβ浓度的测定:取小鼠小脑延髓池中的脑脊液。首先使用戊巴比妥将小鼠麻醉，然后剥离其头骨基部至第一椎骨的肌肉组织，使用微型针头穿刺蛛网膜进入小脑延髓腔抽取脑脊液。使用ELISA检测脑脊液中A β浓度。
[0032]Morris水迷宫实验:设计特制的水迷宫主要由一圆柱型水池和一可移动位置的站台组成。水池高70cm,直径100cm,站台直径15cm,水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。预先在水池中注入清水，水深15cm，加入炭素墨水使池水变为不透明的黑色，站台表面为黑色，使小鼠不能看到，水面高出站台表面0.5cm。水温控制在22±0.5°C。站台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保持站台位置不变。定位航行实验:每次实验以60s为限，纪录动物从入水点到达站台所需时间以及在这段时间内的游泳路程和速度，以所需时间作为学习和记忆成绩(逃避潜伏期)，若设定时间内未找到站台，计算机停止跟踪，记录时间为60s。每次实验在隔音的房间内进行，水池，光源，鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。连续测量五天，每天测一次，每次从不同的入水点将小鼠面向池壁放入水中，入水点半随机，每次测量所有动物入水点相同。测试前先将小鼠置于平台上15s (适应)，测试结束无论寻台是否成功都适应15s。空间探索实验:定位航行实验结束以后，拆除平台，记录小鼠在60s内穿过原平台位置的次数。
[0033]实验结果:
1、KLH:Α β 31-42, KLH:Α β 34_42， KLH:Α β 37_42 多肽免疫 C57BL/6J 小鼠产生 A β 31_42 特异
抗体
使用 KLH:Α β 31-42, KLH:Α β 34_42， KLH:Α β 37_42 多肽及 KLH 免疫 C57BL/6J 小鼠，然后检测其血液中可以识别Αβ 31_42的特异抗体。结果如图1所示。
[0034]2、KLH:Αβ 31_42，KLH:Αβ 34_42， KLH:Αβ 37_42 多肽免疫 AD 模型鼠 APP/PS1 鼠产生A β 31-42特异 抗体
使用 KLH:Α β 31-42, KLH:Α β 34_42， KLH:Α β 37_42 多肽及 KLH 免疫 AD 模型鼠 APP/PS1 鼠，然后检测其血液中可以识别Αβ 31_42的特异抗体。结果如图2所示。
[0035]3、KLH:Αβ 31_42，KLH:Αβ 34_42，KLH:Αβ 37_42多肽诱导的体液免疫反应可以降低AD模型鼠脑脊液(CSF)中Αβ浓度
使用KLH:Α β 31-42, KLH:Α β 34_42，KLH:Α β 37_42多肽免疫APP/PS1鼠以后，测量其脑脊液中Αβ水平的变化。结果如图3所示。
[0036]4、KLH:Α β 31_42多肽诱导的体液免疫反应可以提高AD模型鼠的记忆能力
利用Morris水迷宫实验检测使用KLH:Αβ 31_42多肽免疫之后对APP/PS1鼠认知能力的改善。定位导航实验结果(如图4所示)显示，使用KLH:Αβ 31-42多肽免疫APP/PS1鼠以后可以有效的降低其逃避潜伏期。空间探索实验结果(如图5所示)显示，使用KLH:Αβ 31-42多肽免疫APP/PS1鼠以后可以有效的提高其经过原平台的次数。从而证明了 KLH:Ai331_42多肽诱导的体液免疫反应提高了 APP/PS1鼠的记忆能力。
[0037]本发明并不局限于前述的【具体实施方式】。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
【权利要求】
1.一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽，其特征在于，是如下任一所述的多肽: 1)氨基酸序列如SEQID NO:1所示的多肽； 2)由SEQID NO:1进行1_6个的取代和/或缺失和/或添加的由SEQ ID NO:1衍生的多肽。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽，其特征在于，是如下任一所述的多肽: 1)氨基酸序列如SEQID N0:2所示的多肽； 2)由SEQID NO:2进行1_6个的取代和/或添加的由SEQ ID NO:2衍生的多肽。
3.含有如权利要求1或2所述的一种用于治疗阿尔兹海默症多肽的多肽疫苗。
4.根据权利要求3所述的多肽疫苗，其特征在于:还包括一种载体和/或佐剂。
5.根据权利要求4所述的多肽疫苗，其特征在于:所述佐剂选自福氏佐剂、氢氧化铝佐剂、琥珀酰化钥孔慽血兰蛋白、牛血清白蛋白、热休克蛋白、霍乱毒素B亚单位或糖甙QuilA0
6.根据权利要求4所述的多肽疫苗，其特征在于:所述载体选自琥珀酰化钥孔慽血兰蛋白、牛血清白蛋白、热休克蛋白、霍乱毒素B亚单位、白细胞介素_4、白细胞介素-6，白细胞介素-10或PEDI假单胞菌外毒素A受体结合域。
7.根据权利要求4所述的多肽疫苗，其特征在于:所述载体与多肽通过共价键偶联相
8.根据权利要求1所述的多肽在制备用于阿尔兹海默症治疗药物或疫苗中的用途。
9.含有根据权利要求3所述的多肽疫苗在制备用于阿尔兹海默症治疗药物中的用途。
10.表达如权利要求3所述多肽疫苗的DNA疫苗，其特征在于:所述载体和/或佐剂与多肽通过DNA质粒共表达。
11.表达如权利要求3所述多肽疫苗的基因疫苗，其特征在于:所述载体和/或佐剂与多肽通过病毒载体共表达。
12.根据权利要求11所述的基因疫苗，其特征在于:所述病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒或仙台病毒。
13.根据权利要求10所述的DNA疫苗在制备用于阿尔兹海默症治疗药物的用途。
14.根据权利要求11或12所述的基因疫苗在制备用于阿尔兹海默症治疗药物中的用途。
【文档编号】A61P25/28GK103450347SQ201210403802
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】朱义 申请人:四川百利药业有限责任公司