专利名称：人诱导多能干细胞的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤靶向显像技术领域，具体涉及一种人诱导多能干细胞的制备方法及其用途。
背景技术：
肿瘤被认为是目前最难治愈的疾病之一，基因治疗是治疗肿瘤的一种有前景的手段。已经有研究报道间充质干细胞(MSCs)可以作为基因载体实现肿瘤治疗，MSCs 一般是从骨髓、脂肪、真皮等组织中分离得到，从这些组织中分离MSCs需要选择合适的供体并进行侵入性操作。而且从单个供体中取得MSCs是有限的，并且不能进行长期的增殖，这些都影响了 MSCs作为载体进行基因治疗的可操作性。胚胎干细胞是一种来自于囊胚的内细胞团的全能干细胞，能够在体外无限增值而不丧失其分化的潜能，并且胚胎干细胞(ESCs)相对于其他细胞，易于进行基因改造，更适合作为基因载体，但是胚胎干细胞具有来源受限、伦理道德及操作技术等因素的限制，发展较为缓慢，而诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotent stem cells, iPSCs)是使体细胞重编程获得的具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞，现在iPSCs已经可以取代ESCs，从而克服了 ESCs来源受限、伦理道德限制等问题，因此应用iPSCs作为“载体”细胞将为肿瘤研究带来了治疗希望。到目前为止，经对现有技术的文献检索，发现Hannon等在《Nature》(自然)杂志 2004 年第 431 卷第 7006 期 371-378 页上发表文章 “Unlocking the potential ofthehuman genome with RNA interference”,该文报道了通过转基因技术，向人类胚胎干细胞中添加了一个基因，该基因可以控制干细胞表达一种名为TRAIL的抗癌分子，当将这种转基因干细胞注入长有脑瘤的老鼠体内时，转基因干细胞便附着到脑瘤细胞上，并释放出TRAIL分子。实验结束后，这些老鼠脑瘤的体积平均缩小了 50%，最多的甚至缩小了 70%。2012年崔大祥等人又在《Theranostics》(诊疗)杂志第2卷第6期618-628页发表了文章“DiR-labeled Embryonic Stem Cells for Targeted Imaging of in vivoGastric Canc erCells”，该文报道了小鼠胚胎干细胞具有主动靶向识别体内胃癌细胞的作用，并且这种迁移作用可能是由于体内趋化因子CXCL12与CXCR4配对作用所导致。以上研究都发现了 ESCs具有靶向识别与治疗肿瘤的效果，但是，至今为止，还没有关于iPSCs靶向识别体内肿瘤细胞方面的报道。实际上iPSCs具有来源方便、实现个体化治疗、抗免疫排斥性、提高患者自身免疫力等优点，在肿瘤的早期预警与治疗方面具有很好的应用前景，是一种有应用前景的干细胞基治疗肿瘤的工具。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种人诱导多能干细胞的制备方法及其用途。本发明的人诱导多能干细胞能够靶向体内肿瘤病灶，人诱导多能干细胞通过标记荧光磁性纳米探针后，能够通过静脉注射后特异性富集于肿瘤病灶部位，同时还具有分子影像功能，示踪细胞在活体状态下在体内的分布。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明的第一个目的在于提供一种人诱导多能干细胞的制备方法，包括如下步骤将慢病毒转染人成纤维细胞，得到人诱导多能干细胞。优选地，所述人成纤维细胞为人真皮成纤维细胞或人包皮成纤维细胞。优选地，所述慢病毒为携带有0ct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子的慢病毒。优选地，所述人成纤维细胞是通过原代培养的方法从肿瘤病人体内获得的人成纤维细胞。本发明的第二个目的在于提供前述人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶 制剂中的用途。优选地，所述用途包括如下步骤将人诱导多能干细胞的制剂注射入人体，人诱导多能干细胞能够主动识别体内肿瘤病灶。优选地，所述肿瘤为胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或脑胶质瘤。优选地，所述用途包括如下步骤通过荧光标记人诱导多能干细胞，注射入人体，体内示踪，显示人诱导多能干细胞在体内的分布，进而显示体内肿瘤病灶的位置。优选地，所述荧光标记使用的材料为无机荧光纳米材料。优选地，所述无机荧光纳米材料为量子点、荧光磁性纳米粒子、二氧化硅包覆的荧光纳米粒子或上转换材料。现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明提供了一种人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的用途，本发明的人诱导多能干细胞能够靶向体内肿瘤病灶，人诱导多能干细胞通过标记荧光磁性纳米探针后，能够通过静脉注射后特异性富集于肿瘤病灶部位，同时还具有分子影像功能，示踪细胞在活体状态下在体内的分布。
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显图I为实施例I中的人iPSCs的碱性磷酸酶染色图；图2为实施例I中的人iPSCs的免疫荧光染色图；图3为实施例I中悬浮培养形成类胚体(EB)的形态图(A)和RT-PCR定量分析人iPSCs和EB中各胚层特异性基因的表达(B)；图4为实施例2中未标记的人iPSCs细胞(A)和荧光磁性纳米粒子标记的人iPSCs细胞(B)的可见光与荧光成像复合图；图5为实施例2中未标记的人iPSCs细胞(A)和荧光磁性纳米粒子标记的人iPSCs细胞(B)的普鲁士蓝-核固红复染照片图；图6为实施例2中FMNPs (A)和FMNPs标记的iPSCs (B)在尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内之后Ih和6h时间点小鼠活体荧光成像图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I、人iPSCs的制备本实施例涉及一种人iPSCs的制备，包括如下步骤步骤一，细胞制备小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)购自上海斯丹赛生物技术有限公司，传代培养至第三 五代的MEF细胞作为滋养层细胞；原代培养人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts, HDF):无菌条件下取患者腹部2 3cm2的皮肤，去除皮下组织和表皮层，用胶原酶消化真皮层，保持温度为37°C，时间为2个小时，然后挤压消化过的皮肤，并用单层纱布过滤，培养液用DMEM培养基添加 10%胎牛血清放在培养箱中培养，一周后原代细胞建立，采用原代培养的方法制备HDF细胞，将原代培养至第三 五代的HDF细胞用于病毒转染制备iPSCs ；步骤二，人iPSCs的建立将第4代HDF细胞接种在直径为IOcm的培养皿中，培养24小时后当细胞达到50%左右的汇合度时，更换无抗生素培养基；将包装48小时后的20mL新鲜的携带有0ct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子的慢病毒液(四种转录因子病毒液各5ml)，此慢病毒液可以通过病毒包装得到，或者从公开的市售渠道购买，加入培养基内，同时加入终浓度为8 ii g/ml的polybrene，转导HDF细胞；24小时后弃掉培养液，根据同样的方法用收集包装72小时后的新鲜病毒混合液再次转导HDF细胞。24小时后更换为正常培养液，继续培养72小时。72小时后用含有筛选剂Puromycin (10 u g/mL)的人胚胎干细胞培养基进行筛选，以后每天更换一次培养液，直至出现初始化的iPSCs克隆；步骤三，人iPSCs的扩增培养显微镜下用机械法剔除边缘弥散的细胞克隆，将中间致密的胚胎干细胞样克隆分割为小块接种在经丝裂霉素C处理过的MEF细胞上，用添加Y-27632 (10 u mol/L, Rho激酶抑制剂)的人胚胎干细胞培养基培养，每天更换人胚胎干细胞培养基培养，密切观察其形态变化，经过5 7天的培养可进行第二次传代；步骤四，人iPSCs的生物学特性和多潜能性鉴定碱性磷酸酶表达鉴定将第三代iPSCs细胞用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定20min，PBS再洗涤2次，25mM Tris-Cl (pH9. 0)漂洗I次，加入新鲜配制的坚牢红AP染色液，室温放置约15-30分钟后阳性细胞即呈现红色，PBS漂洗以终止反应，显微镜下观察，如图I所示。免疫荧光法鉴定iPSCs表面标志物的表达iPSCs用PBS洗3次，再用4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗涤2次，每次3 5分钟；0. 2%Triton X-100透化5分钟，PBS洗三次，5%BSA 室温封闭 30 分钟，用 1%BSA 稀释四种一抗(SSEA-3、SSEA4、Tra-1-60、Tra_l_81)，将稀释好的一抗分别滴加到细胞上，不加一抗的作为实验对照，放在4°C过夜，PBS洗三次，力口二抗(用1%BSA稀释)避光孵育2小时，PBS洗3次，DAPI复染核，置于荧光显微镜下观察，如图2所示。类胚体的形成鉴定细胞用IV胶原酶消化，37°C孵育40min以上，待细胞克隆脱落后，收集细胞团，自然沉降，去上清。换成人类胚胎体(EB)培养基，在无饲养层的低贴附板中悬浮培养7天。培养7天后将形成的EB转入0. 1%明胶处理的培养皿内贴壁培养2周，借助RT-PCR检测EB表达各胚层的标志性基因从EB中提取总RNA，采用TIANGEN公TIANScript RT Kit合成cDNA，然后以cDNA为模板利用如下表I所示的RT-PCR检测各胚层标志性基因表达的引物序列，扩增各胚层的标志性基因，各胚层的标志性基因在人iPSCs中的表达作为阴性对照。结果如图3所示。表I
权利要求
1.一种人诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤将慢病毒转染人成纤维细胞，得到人诱导多能干细胞。
2.如权利要求I所述的人诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述人成纤维细胞为人真皮成纤维细胞或人包皮成纤维细胞。
3.如权利要求I所述的人诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒为携带有0ct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子的慢病毒。
4.如权利要求I所述的人诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述人成纤维细胞是通过原代培养的方法从肿瘤病人体内获得的人成纤维细胞。
5.一种如权利要求I所述的人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步骤将人诱导多能干细胞的制剂注射入人体,人诱导多能干细胞能够主动识别体内肿瘤病灶。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或脑胶质瘤。
8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步骤通过荧光标记人诱导多能干细胞，注射入人体，体内示踪，显示人诱导多能干细胞在体内的分布，进而显示体内肿瘤病灶的位置。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述荧光标记使用的材料为无机荧光纳米材料。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述无机荧光纳米材料为量子点、荧光磁性纳米粒子、二氧化硅包覆的荧光纳米粒子或上转换材料。
全文摘要
本发明涉及一种肿瘤靶向显像技术领域的人诱导多能干细胞的制备方法及其用途，所述制备方法包括如下步骤将慢病毒转染人成纤维细胞，得到人诱导多能干细胞。本发明还涉及所述人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的用途。本发明的人诱导多能干细胞能够靶向体内肿瘤病灶，人诱导多能干细胞通过标记荧光磁性纳米探针后，能够通过静脉注射后特异性富集于肿瘤病灶部位，同时还具有分子影像功能，示踪细胞在活体状态下在体内的分布。
文档编号A61K49/00GK102965393SQ201210440090
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者崔大祥, 阮静, 李超 申请人:上海交通大学