专利名称：一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于兽药技术领域，涉及一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法，一种免疫增强型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一种严重危害偶蹄动物的病毒性疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的烈性传染病，中国将其列为一类动物传染病。该病主要侵染猪、牛、羊等偶蹄动物，传播途径多、传播速度快，曾多次在世界范围发生大流行。 FMD的致病因子是口蹄疫病毒(FMDV)，归属于小RNA病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。FMDV有七个血清型，分别为O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3，每个血清型又可产生很多基因亚型，也因流行区域而分为很多的拓扑型；不同血清型之间无交叉保护反应，同一血清型的不同谱系病毒之间的交叉免疫保护性也有差异，因而经常需要根据流行毒与疫苗毒株的抗原关系分析，来确定用于预防流行毒株的适宜的疫苗毒株。FMDV核酸分子为单股正链的RNA分子，基因组全长约8500个碱基，只含有一个大的开放阅读框，表达产生的聚蛋白逐级裂解产生病毒的结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非结构蛋白(Lab，2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)，结构蛋白组装产生病毒的衣壳结构，非结构蛋白则参与病毒与宿主的相互作用、抑制宿主细胞的转录翻译机制、参与病毒的复制过程。病毒衣壳蛋白是诱导产生中和抗体的主要免疫原，在结构蛋白上存在多个构象性的与线性的中和表位。早期通过单克隆抗体与免疫逃逸突变株的序列分析研究表明，在O型FMDV至少存在5个功能独立的中和性抗原表位，组成抗原位点的区段主要包括VPl的G-H环以及其C端氨基酸，VP2的31，70 73，75和77位氨基酸，VPlB-C环的43和44位点氨基酸；VP3的58位氨基酸，VPl 149位氨基酸等参与构成五个中和表位。这5个中和表位除了由VPlG-H环构成的位点I为线性表位外，其余均为构象表位。利用合成肽免疫实验动物和牛的试验似乎证明位点I是最优势的抗原表位，但是有的试验结果显示疫苗免疫后针对位点2的抗体应答水平高于位点I ;其中针对G-H环位点的免疫显然是最重要的，因为不同血清型病毒，在G-H环附近的变异幅度最大，而且G-H环是病毒结合细胞受体的部位。VPlG-H环也是研制口蹄疫表位肽疫苗的主要基因对象，但是单独合成G-H环研制表位肽疫苗并不能诱导免疫动物产生有效的保护性免疫应答，还需要有T细胞表位的参与才能诱导产生较好的保护性免疫应答。T细胞表位对于诱导产生更高水平的中和抗体、尽早的清除病毒具有重要的作用，有学者综合分析了不同血清型病毒抗原位点区域的差异，结果显示B-细胞与T-细胞抗原位点区域显示出很明显的血清型特征，已经发现在FMDV的结构蛋白以及非结构蛋白3A与3D上均存在T-细胞表位，有些T-细胞表位在血清型间比较保守，有些在毒株之间差异较大；其中VP4，VPl，3A，3D蛋白中均含有保守的T细胞表位，这些表位可能更易被宿主细胞表达的MHC分子识别，因而在分子疫苗设计中受到更多的关注。现在使用的口蹄疫疫苗主要为全病毒抗原灭活疫苗，在疫苗的制造过程中需要动用活病毒，因而，需要达到生物安全三级标准的GMP生产车间来防止病毒的扩散。同时、高效疫苗的生产过程中，要对病毒抗原进行浓缩，因而疫苗的生产与制备成本较高。基因工程疫苗的研制与应用，将为解决这些问题提供方法。目前，已经有合成肽疫苗被批准用于猪口蹄疫的免疫预防，美国也核准了口蹄疫病毒基因重组腺病毒活载体疫苗新兽药注册申请，说明未来口蹄疫基因工程疫苗替代传统灭活疫苗将是一种趋势。基因工程疫苗的应用也有助口蹄疫感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗及 其制备方法，利用该方法制备的BI与TI混合表位疫苗免疫猪，能够产生同等或优于全病毒灭活疫苗的保护性免疫效果，而且对三个谱系的病毒都具有交叉保护作用，是一种新型的免疫增强型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。其技术方案为一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗，由四部分组成，由中国型(Cathay)、泛亚、緬甸98三个谱系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位组成的串联B细胞表位重组蛋白BI，其基因序列为SEQ ID NO :1，氨基酸序列为SEQ ID NO :2 ;由通用T细胞表位与多个口蹄疫病毒特异性T细胞表位串联组成的T细胞表位重组蛋白TI，其基因序列为SEQ ID N0:3，氨基酸序列为SEQ ID NO :4 ;添加Toll样受体3激动剂-聚肌苷酸-聚胞苷酸〔Polyinosinic :polycytidylic acid, Poly (1: C)〕和 / 或 Toll 样受体 7/8 剂动剂-R848 为免疫增强剂；201油佐剂。进一步，对于免疫猪，所述疫苗的用量为仔猪lmL，成年猪2mL每头份，耳后部深部肌肉注射。本发明口蹄疫基因工程混合表位疫苗的制备方法，重组B与T细胞表位免疫原均可通过末端融合的6-组氨酸标签进行亲合层析纯化，纯化的B1、TI免疫原与Poly(1:C)分别按终浓度400，300与300 μ g/mL配制于磷酸盐缓冲液，然后按体积比1:1加入201油佐剂进行乳化制备成疫苗。本发明的有益效果猪体免疫试验结果显示，与口蹄疫O型传统灭活疫苗相比单独BI油佐剂疫苗在免疫后产生较高水平的中和抗体，BI免疫原添加Poly(I = C)后中和抗体的水平显著高于未免疫组与灭活疫苗免疫组(P < 0.01);同时，BI免疫原加入TI与Poly(I = C)后，中和抗体的应答水平更加均匀，个体差异缩小，而且对不同谱系病毒的交叉中和作用也有明显提高((P < 0. 05));再用1000个猪半数感染量(PID50)的0/Mya/98系猪体适应毒攻击后，BI+Poly(1:C)与BI+TI+Poly(1:C)组猪均可完全抵抗强毒攻击，攻毒后10天内无一头猪表现出临床症状；而BI单独免疫组与灭活苗免疫组分别有2头与3头猪表现临床症状；对照组五头猪于攻毒后5天内全部发病。说明BI抗原是一种很好的B细胞免疫原，添加TI和Poly(1:C)能够诱导免疫猪产生保护性的免疫应答，其对猪的免疫保护作用优于灭活疫苗，因而，是一种新型的免疫增强型口蹄疫混合表位疫苗。
图1为BI抗原的表达与纯化SDS-PAGE电泳分析图.其中，M为分子质量标准，I为诱导表达产物，2为诱导前对照，3 5显示在洗脱缓冲液D、E和F中的纯化蛋白.；图2为TI抗原的表达与纯化SDS-PAGE电泳分析图，其中M为分子质量标准，I为为诱导前对照，2与3为诱导表达产物，4与5为在洗脱缓冲液E中的纯化蛋白。
具体实施例方式下面结合附图具体实施例来详细描述本发明的技术方案。材料与方法B细胞免疫原BI的设计与表达 根据国内外O型口蹄疫流行病学信息，设计并合成了 B细胞免疫原基因BI，所含有的O型口蹄疫病毒中和抗原表位序列如下表I所示，将表I中的氨基酸序列按下列顺序进行排列组合PADRE-GG-(0/HN/CHA/09)VPl 132-160-GG-VP1 193-211-GG-(0/Tibet/99)VPl132-160-GG-(0/IRN/2010) VPl 193-211-GG-VPl 132-160-GG-(0/Mya98)VP1132-160-GG-VP1 193-211-GG-1nvasin_6 XHis，各表位之间以两个甘氨酸相连，最后加6组氨酸标签序列，有利于表达蛋白的纯化。设计好的序列交由南京GenScript公司进行编码序列的优化与合成，两端分别加入启始密码子与终止密码子，并加入Nco I与Hind III酶切位点，合成的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其蛋白序列为SEQ ID NO. 2 表1. B细胞免疫原基因BI中的表位序列组成
权利要求
1.一种口蹄疫基因工程混合表位疫苗，其特征在于，由四部分组成，由中国型(Cathay)、泛亚、緬甸98三个谱系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位组成的串联B细胞表位重组蛋白BI，其基因序列为SEQ ID NO :1，氨基酸序列为SEQ ID NO 2 ;由通用T细胞表位与多个口蹄疫病毒特异性T细胞表位串联组成的T细胞表位重组蛋白TI，其基因序列为SEQ IDNO :3，氨基酸序列为SEQ ID NO 4 ;添加Toll样受体3激动剂-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll样受体7/8剂动剂-R848为免疫增强剂；201油佐剂。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫基因工程混合表位疫苗，其特征在于，对于免疫猪，所述疫苗的用量为仔猪lmL，成年猪2mL每头份，耳后部深部肌肉注射。
3.根据权利要求1所述口蹄疫基因工程混合表位疫苗的制备方法，其特征在于，重组B与T细胞表位免疫原均可通过末端融合的6-组氨酸标签进行亲合层析纯化，纯化的B1、TI免疫原与Poly (1: C)分别按终浓度400，300与300 μ g/mL配制于磷酸盐缓冲液，然后按体积比1:1加入201油佐剂进行乳化制备成疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种口蹄疫病毒混合表位疫苗及其制备方法，该疫苗由四部分组成，由中国型、泛亚、缅甸98三个谱系O型口蹄疫病毒主要中和性抗原表位组成的串联B细胞表位重组蛋白BI，其基因序列为SEQ ID NO1，氨基酸序列为SEQ ID NO2；由通用T细胞表位与多个口蹄疫病毒特异性T细胞表位串联组成的T细胞表位重组蛋白TI，其基因序列为SEQ ID NO3，氨基酸序列为SEQID NO4；添加Toll样受体3激动剂-聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或Toll样受体7/8剂动剂-R848为免疫增强剂；201油佐剂。利用该方法制备的BI与TI混合表位疫苗免疫猪，能够产生同等或优于全病毒灭活疫苗的保护性免疫效果，而且对三个谱系的病毒都具有交叉保护作用，是一种新型的免疫增强型O型口蹄疫基因工程混合表位疫苗。
文档编号A61P31/14GK103007273SQ201210480120
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者卢曾军, 刘在新, 曹轶梅, 孙普, 李冬, 包慧芳, 李平花, 付元芳, 陈白兴文, 应理, 谢宝霞 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所