专利名称：用于RNAi试剂同时递送的多启动子表达盒的制作方法
用于RNAi试剂同时递送的多启动子表达盒本申请是申请日为2005年3月4日、申请号为200580013979. 5、发明名称为“用于RNAi试剂同时递送的多启动子表达盒”的发明专利申请的分案申请。相关申请的交互参考本申请得益于系列号为60/553，920，提交日为2004年3月17日的美国临时专利申请，以及系列号为60/550，504，提交日为2004年3月5日的美国临时专利申请，这两篇文献在此引用作为参考。
背景技术：
使用双链RNA通过序列特异性的方式来抑制基因表达已经给药物发现工业带来了变革。在哺乳动物中，RNA干扰，或者RNAi，是由19到29的核苷酸长的、双链RNA分子调控的，该双链RNA分子指的是体内细胞中的长双链RNA分子经酶促裂解而衍生出的小干扰RNA。RNAi试剂可以在细胞外化学或酶学合成并进而递送到细胞中(参见，例如Fire，等.,Nature, 391 :806-11 (1998) :Tuschl,等.，Genes and Dev. , 13 :3191-97 (1999);和Elbashir,等 ，Nature, 411 :494-498 (2001));或者可以通过细胞内适当的载体在体内表达(参见，例如 McCaffrey,等.Nature Biotech. 21 (6):639-644 (2003))。然而，在人体内递送未修饰的RNAi以作为有效地治疗用途面临着许多的技术障碍。首先，由于细胞和血清中的核酸酶，注入体内的RNA的半寿期只有大约70秒(参见例如，Kurreck, Eur. T. Bioch. 270 1628-44 (2003))。已经采取了努力通过化学修饰来增加注入RNA的稳定性；然而，已经出现了一些由于化学改变导致毒性效果的增加例子。在一个具体的例子中，细胞无法耐受双链 中每两个磷酸被硫代磷酸酯替换的RNAi的剂量(Harborth，等.,Antisense Nucleic Acid Drug Rev. 13 (2):83-105 (2003))。其它的障碍包括提供组织特异性递送，以及能够递送足够引发治疗反应但没有毒性的RNAi试剂剂量。为了 RNAi的递送已经发现了许多选择，包括使用可以感染目标细胞，并且在原位递送和表达RNAi分子的基于病毒的载体系统。一般地,大约70个核苷酸的小RNA从病毒载体骨架上转录为短发夹前体(shRNA)。一旦被转录，shRNA被切丁酶(Dicer)加工成为合适的活性RNAi种。基于病毒的递送途径试图开发病毒的靶向属性以产生组织特异性，一旦正确地靶向定位，便依赖于内源细胞机器以产生足够的RNAi种水平进而获得治疗有效的剂量。现在，最普遍使用的用于递送目标序列的病毒是那些基于逆转录病毒、单纯疱疹病毒(HSV)或者腺病毒(Ad)演化而来的系统。所有这些载体能够容纳相当大的插入并且能够以治疗性相关滴度生产。然而，所有的系统，都有和癌症的发展相关的担心(Cavazzana-Calvo,等 ，Science, 288 :669-72 (2000)),并且伴随有不希望的宿主免疫反应且在患者中造成毒性。另外一种可用于递送RNAi的病毒是腺伴随病毒(AVV)。RNAi治疗的一个有效的应用是作为抗病毒试剂。总的来说，RNA病毒依赖于RNA/DNA依赖的RNA聚合酶来进行复制。这样的RNA/DNA聚合酶以比较低的严谨度复制病毒基因组，其功能性后果是产生了具有异常多数突变的基因组。其结果是具有了迅速演化后代病毒颗粒的能力以逃避一般免疫和化学抗病毒试剂。因此，和已观察到的小分子治疗的效果相似，RNAi治疗的相对潜能和效力可能会由于在长期治疗过程中的病毒演化而减小。在一例研究中，将表达的shRNA递送入体内35天之后出现了包含有单一核苷酸变化的HIV逃擗突夺体(Boden,等.，T. Virol. 77 (21) :11531-11535 (2003))。在另一例研究中，在使用预先合成的RNAi转染的细胞中转染后仅54小时就能够检测到脊髓灰质炎病毒逃避突变体。然而，同时递送两种针对病毒中多重目标序列的RNAi能够显著地延迟逃避突变体的出现(见 Gitlin，等.,Nature. 418 :430-434 (2002))。因此，本技术领域需要发展稳定、有效的RNAi治疗。本发明满足了本技术领域的这一需要。发明概述本发明涉及用于向靶细胞递送RNAi种或试剂的创新的组合物和方法。RNAi种是优选通过病毒递送系统而进行递送的多启动子表达构建体的一部分。因为三种或更多的RNAi试剂被用在每个构建体上，本发明可特别有效地用于使用具有变体间序列差异性(SNPs)的靶基因定位生物体，其中每一种导入的RNAi试剂能够靶向一种或多种的变体亚型。相似地，本发明的组合物和方法也可有效地用于治疗由迅速突变的病原导致的疾病，例如由基于RNA的病毒试剂导致的疾病；这就是说，病毒逃避突变体不太可能避开三种或更多的不同RNAi序列的作用。因此，本发明的实施方案提供了一种多启动子表达盒包括至少三种启动子/RNAi /终止子组分 ，其中每种启动子/ RNAi /终止子组分包含启动子元件、终止子元件和可操作地连接启动子元件和终止子元件的RNAi种，其中每个RNAi种的序列彼此不相同。在这个实施方案的另一优选方面，在多启动子表达盒中每个启动子元件的序列彼此不相同。在这个实施方案的另一方面，在多启动子表达盒中每个终止子元件的序列彼此不相同和/或每个终止子元件和相应的启动子元件来自于相同的基因而相互天然成对。另外，在这个实施方案的一方面，本发明提供了一个包含有将治疗载体包装入感染性病毒颗粒的必需元件的多启动子表达构建体。在本发明的另一个实施方案中，提供了一个处理在一个细胞中表达的一或多个核酸目标的方法，包括将一个表达三个或多个RNAi试剂来抑制一或多个核酸目标的多启动子RNAi表达盒掺入病毒载体以便制造病毒的RNAi递送构建体；包装病毒RNAi递送构建体入病毒颗粒；递送该病毒颗粒到细胞；并且表达来自该多启动子表达盒中三个或多个的RNAi试剂。在本发明这个实施方案的另一方面，所表达的一个或多个的核酸目标是引发或者维持疾病状态所必需的基因，例如在细胞中的癌症状态。在本发明这个实施方案的其它方面，所表达的一个或多个的核酸目标是病原体传染细胞或者维持传染所必需的基因。或者，多启动子RNAi表达盒可以非病毒载体提供，并且通过本领域已知的非病毒方法递送至细胞。附图简述为了便于详细地理解以上所述的本发明的特征、优点和目的，本发明更详细的说明书、上面的简要总结，可以引证在附图中举例说明的实施方案。然而，应该注意到，那些
仅仅用于确证本发明的实施方案并因此不能被认为限制了本发明的范围，因为本发明可以包括其他同样有效的实施方案。图1是用于递送本发明RNAi种的方法的一个实施方案的简化框图。
图2A和2B是代表本发明多启动子RNAi表达盒的实施方案的示意图。图3A和3B显示了以shRNA前体递送RNAi试剂的多表达载体的两个实施方案。图3C显示了一个包含插入在启动子/RNAi/终止子组分之间之填充区域的多表达载体的实施方案。图3D和3E显示递送不带shRNA前体的RNAi的多启动子RNAi表达盒的实施方案。图4A是制造包装入病毒颗粒中的多启动子RNAi表达盒的一种方法的简要示意。图4B是制造包装入病毒颗粒中的多启动子RNAi表达盒的另一种方法的简要示意。图5是试验重组体AAV (rAAV)表达构建体和萤光素酶报告构建体的一个实施方案的示意图。图6是根据本发明的一个实施方案的自身互补(scAAV) RNAi表达载体的示意图。图7是一个代表性启动子测试构建体和报告构建体的示意图。图8A是显示本发明描述的实验中检测的RNAi试剂位置的HCV基因组的示意图。SB是包含用于非结构蛋白的遗传元件的萤 光素酶HCV融合复制子的示意图。SC是包含用于结构和非结构蛋白的HCV遗传元件的萤光素酶HCV融合复制子的示意图。图9是用于检验RNAi试剂的两个萤光素酶HCV融合报告质粒的示意图。在左边的构建体包括一个融合到萤光素酶基因上的IOObp HCV序列；而在右方的构建体包括3个不同的融合到萤光素酶基因上的IOObp HCV序列。靶向至一个包含在该IOObp区域内的序列的RNAi试剂将(如果有效的)降解该HCV萤光素酶转录产物，因而降低(也许消除)萤光素酶的表达。图10是一个显示出具有用于多种RNAi试剂、启动子元件和终止子元件的模块装配的独特限制性位点的三重启动子载体的实施方案之一的图解说明。图1lA是在图3B中显示的三重启动子载体的序列(SEQ ID N031)的例子。图11B/11C是在图3C中显示的三重启动子载体的序列(SEQ ID N032)的例子。图12显示在相对光单位(RLU)下测量由靶向至五种不同的HCVlOObp区域的不同的RNAi试剂抑制萤光素酶表达的结果。图13显示了表示为抑制百分比值的由不同RNAi试剂抑制萤光素酶表达的结果。图14显示了检验靶向至来自于HCV5’区域IOObp序列的多个节段的四种不同RNAi试剂之试验结果的再现性。图15显示了针对靶向至来自于HCV5’区域IOObp序列的多个节段的五种不同RNAi试剂在转染后24小时和48小时的萤光素酶表达抑制百分比的改变。图16显示了靶向至HCV5’区域IOObp序列的多个节段的两个不同RNAi试剂、靶向至HCV3’区域IOObp序列的多个节段五个不同RNAi试剂和祀向至HCV开放读码框之外的IOObp序列的节段的RNAi试剂在转染后44小时和72小时的萤光素酶表达抑制百分比的改变。图17A和17B显示了评价三个Pol III启动子强度的数据。将一个特异针对于荧火虫萤光素酶mRNA (McCfrey等，2002)的shRNA序列插入至上述Pol III启动子的控制之下。产物质粒DNA和萤光素酶报告质粒共转染至Huh7细胞(图17A)或者293细胞(图17B)。转染72小时后测量萤光素酶水平。在来自于图3B(每个图区右侧的三个构建体)的三重启动子构建体中显示出启动子驱动shRNA。图18显示在萤光素酶HCV融合报告质粒试验分析中不同的SiRNA试剂对萤光素酶表达的抑制。萤光素酶HCV报告质粒和每一种siRNA试剂共转染至huh7细胞，并且在48小时以后测量萤光素酶活性。图19显示针对亚基因组萤光素酶HCV融合复制子的所选siRNA试剂的活性。试验过的siRNA试剂和痕量的pGL3对照DNA (用于转染效率的对照)一起转染至29 E细胞。48小时后测量雷尼利亚(renilla)和突火虫萤光素酶的水平。图20显示了在用包含并具有一或两个活性的启动子的启动子/shRNA盒的质粒共转染之后来自于萤光素酶HCV报告质粒的萤光素酶信号的抑制百分比。图21显示了来自于使用包含一个、两个或三个活性启动子/shRNA盒的质粒共转染之后的包含C12编码区(顶端)、C-9 (中间的)编码区、或者5’ 6区域(底端)的萤光素酶HCV报告质粒的萤光素酶信号的抑制百分比。发明详述在描述本发明的组 合物和方法之前，应该理解本发明不局限于所描述的详细的方法、产品和因素，因为这样的方法、仪器和制剂当然可以改变。同时也应该理解在这里使用的术语仅仅是为了描述详细的实施方案，而并不想限制本发明的范围，此范围仅仅由权利要求书所限定。正如在这里使用的，单数形式的“一”、“ 一个”和“这个”包括复数对象，除非上下文清楚地另外规定。因而，例如，所说的〃 一个因素〃是指一个或者多个混合因素，并且所说的生产方法包括那些已经为本领域所公知的等同步骤和方法等等。除非另外有定义的，在这里使用的所有技术和科学名词具有和本发明所属的技术领域中普通技术人员通常所理解的意义。所有提到的出版物在此引用作为参考，没有任何限制，以用于描述和披露装置、组成和方法，出版物中这些内容可能于本申请所描述的发明相关。在下面的描述中，阐述了许多细节以对本发明的更彻底的了解。然而，显而易见地即使没有这些细节中的一个或多个本领域技术人员也可能实现本发明。在另一方面，本领域技术人员已经熟知的内容就不在这里描述。本发明涉及利用单一表达构建体同时递送至少三个不同的RNAi试剂至细胞的创新的、稳定的遗传组合物和方法。该组分和方法提供对目标核酸的稳定、持续的抑制。一般地，本发明使用了本领域惯用的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、细胞生物学和病毒学方法。这样的技术已经在文献中充分地阐明，参见,例如ManiaisFritsch&Sambrook,分子克降实骀室指南(1982) :DNA克降实用件方法,卷I和11(D. N. Glover, ed. 1985):寡聚核昔酸合成(M. J. Gait, ed. 1984):核酸杂交(B. D. Hames&S.J. Higgins, eds. (1984)):动物细朐培养(R.1. Freshney, ed. 1986):和 RNA 病毒实用件方法,(Alan, J. Cann, Ed. , Oxford University Press, 2000)。“载体”是一个复制子，例如质粒、噬菌体、病毒构建体或者粘粒，其中可以装配另外的DNA节段。载体通常用来在细胞中转化和表达DNA节段。“启动子”或者“启动子序列”是一段在细胞中能够结合RNA聚合酶并启动转录的DNA调节区，转录的对象是多核苷酸或者多肽编码序列诸如信使RNA、核醣体RNAs、核仁RNAs的小核或者由RNA聚合酶1、II或者III任何一种所转录的任何种类的RNA。当这样的核酸已经导入细胞时此细胞就已经被外源的或者异源的核酸或者质粒所“转化”、“转导”或者“转染”，例如，作为一个带有转染试剂的复合体或者包装在病毒颗粒中。该转化的DNA可能或者不能整合(共价连接)至细胞的基因组中。对于真核细胞而言，稳定转化的细胞中，转化DNA已经整合至寄主细胞染色体中或者是维持在染色体外，以便该转化DNA在细胞复制期间由子细胞继承或者该转化DNA是非复制的、分化的细胞其中存在持久的游离基因。术语"RNA干扰〃或者“RNAi” 一般是指这样的过程，其中双链RNA分子或者短的发夹RNA改变了核酸序列的表达，它们具有基本的或者完全的同源性。术语“RNA种”或者“RNAi试剂”是指一段独特的引发RNAi的RNA序列；并且术语"RNAi表达载体〃是指根据本发明实施方案的包含三个以上RNAi种的载体。图1是简化流程图，它显示了方法100的步骤，其中可以使用根据本发明的多启动子RNAi表达构建体。首先，在步骤200中，构造了一个靶向至特定疾病目标的多启动子RNAi表达盒。其次，在步骤300中，多启动子RNAi表达盒被连接至适当的病毒递送构建体中。在步骤400中该病毒RNAi表达递送构建体继而被包装至病毒颗粒中，并且在步骤500中该病毒颗粒被递送至需要治疗的靶细胞中。这些步骤包括的细节和组成在下面详述。根据本发明的基于病毒的多启动子RNAi表达构建体可以利用许多的本领域熟知的操作规程通过合成或酶学手段来生产，并且利用标准重组DNA技术来纯化，这些技术记载在，例如，sambrook等人,分子克隆实验室指南第二版，冷泉港出版,冷泉港,NY (1989),和依照在例如美国HHS部，国家健康研究中心(NIH)的关于重组DNA研究指南所描述的规程而进行。在一个优选的实施方案中，该多启动子RNAi表达盒是利用亚磷酰胺或类似物依照本领域熟知的操作规程合成的。图2A和2B是根据本发明实施方案的多启动子RNAi表达盒的简图。图2A显示了具有三个启动子/RNAi/终止子组分(显示在20)的多启动子表达盒(10)的一个实施方案，并且图2B显示具有五个启动子 /RNAi/终止子组分(显示在20)的多启动子表达盒(10)的一个实施方案。P1、P2、P3、P4 和 P5 代表启动子元件。RNAil、RNAi2、RNAi3、RNAi4 和 RNAi5代表五个不同的RNAi种序列。Tl、T2、T3、T4、和T5代表终止元件。根据本发明的多启动子RNAi表达盒可以包含三个或多个启动子/RNAi/终止子组分，其中在任何多启动子RNAi表达盒包含的启动子/RNAi/终止子组分的数目受限于，例如，所选择的递送系统(例如，一些病毒，诸如AAV，有相对严格的大小限制)的包装大小；细胞毒性，和最大有效量(例如，当四个RNAi序列的表达以用作治疗时的有效性和十个RNAi序列表达的效果相同)。在包含有启动子/RNAi/终止子组分的盒中三个或更多的RNAi种都具有不同的序列；也就是说RNAilRNAi2、RNAi3、RNAi4和RNAi5彼此各不相同。然而，在任意盒中的启动子元件可能是一样的(也就是说，例如，两个或更多的P1、P2、P3、P4和P5的序列可能是一样的)；任意盒内部的所有的启动子可彼此各不相同；或者可能有在任一盒内部仅仅出现一次的启动子元件与出现两次或者以上的启动子元件的集合。同样地，在任一盒中的终止子元件可能是一样的(也就是说，例如，Tl、T2、T3、T4和T5中两个或更多的序列可能是一样的，诸如4或更多T残基的连续的伸展区)；任一盒内部的所有终止子元件可彼此不同；或者可能有在任一盒内部仅仅出现一次的终止子元件与出现两次或者以上的终止子元件的集合。优选地，在每一包含任意盒的启动子/RNAi/终止子组分中的启动子元件和终止子元件全部不同以减少在组分和/或盒之间发生DNA重组事件的可能性。此外，在一个优选的实施方案中，用于每一启动子/RNAi/终止子组分的启动子元件和终止子元件是彼此相匹配的；也就是说，启动子和终止子取自于它们天然地存在于其中的同一基因。图3A，3B和3C显示多启动子RNAi表达构建体载体，其中包含有可表达短shRNAs的多启动子RNAi表达盒的选择性实施方案。shRNAs是短短的双链形式其中有义和反义链是由发夹环连接的。一旦表达，shRNAs被加工成为RNAi种。图框A、B和C代表三个不同的启动子元件，并且箭头标明了转录的方向。TERM1、TERM2和TERM3代表三个不同的终止序列，并且shRNA-1、shRNA-2和shRNA_3代表三个不同的shRNA种。在该实施方案中的多启动子RNAi表达盒从标记为A的图框中伸出到标记为TERM3的箭头。图3A显示三个启动子/RNAi终止子组分(20)中的每一个在该盒内都处于同样的方向上，同时图3B显示对shRNA-1和shRNA-2而言启动子/RNAi/终止子组分在一个方向上，对shRNA_3而言启动子/RNAi/终止子组分在相反的方向上(例如，转录发生在载体的两条链上)。图3C显示由DNA区域分隔以增加启动子/RNAi终止子组分之间的距离的每一种盒。该插入的DNA，被称为“填充"DNA，可以是在5-5000个核苷酸之间的长度。在启动子之间可以有一或多个填充片段。对于多重填充片段，它们可以是同样的或者不同的长度。该填充DNA片段优选地是不同的序列。该填充DNA片段可以用于增加本发明多启动子盒的大小以便允许它适合于成为相应的递送载体。该填充片段的长度是由与多启动子载体相关的特定载体的尺寸需要所规定的。例如，在一个实施方案中填充片段总计长4000核苷酸(nt)以便恰当地满足AAV载体的大小需要。在另外的实施方案中，填充片段总计2000nt以便恰当地满足自身互补的AAV载体的大小需要。其它的变体也可以使用。图3D和3E显示了多启动子RNAi表达构建体，其包含有可表达不带有发夹环的RNAi种的多启动子RNAi表达盒的选择性实施方案。在两幅图中，PU P2、P3、P4、P5和P6代表启动子元件(箭头标明了转录方向)；并且T1、T2、T3、T4、T5和T6代表终止元件。同样在两幅图中，RNAil有义链 和RNAil反义链(a/s)是互补的，RNAi2有义链和RNAi2反义链(a/s)是互补的，并且RNAi3有义链和RNAi3反义链(a/s)是互补的。在图3D显示的实施方案中，所有三个RNAi有义序列是从一个链转录而来(通过PU P2和P3)，同时这三个RNAia/s序列是从互补链转录而来的(通过P4、P5、P6)。在这一特定的实施方案中，RNAiI a/s (T4)的终止元件落在启动子Pl和RNAil有义序列之间；而RNAil (Tl)的终止元件落在RNAi la/s序列和它的启动子P4之间。这些基序是重复的以致于如果图3D中显示的顶端链称为(+ )链并且底端称为(_)链，元件该从左至右移动将依次遭遇 Pl ( + )、T4 (-),RNAil (有义和 a/s)、Tl (+)、P4 (_)、P2 ( + )、T5 (_)、RNAi2 (有义和 a/s)、T2 ( + )、P5 (_)、P3 ( + )、T6 (_)、RNAi3 (有义和 a/s)、T3 ( + )和 P6 (_)。在图3E所显不的另一个实施方案中，所有的RNAi有义和反义序列是从同一链转录的。对于本领域技术人员而言图3A到3E所显示的任意一种多启动子RNAi表达盒的实施方案都可以用于特定应用，而且也可以是组物或者变体。在一些实施方案中，可以使用强度可变的启动子。例如，三个或多个的强启动子(诸如Pol III型启动子)的使用可能会对细胞造成负担，通过例如耗尽转录所必需的可用的核苷酸或者其它的细胞的组分。此外或另外，数个强启动子的使用可在细胞中引起RNAi试剂表达的毒性水平。因而在一些实施方案中在多启动子RNAi表达盒中的一个或多个启动子可能弱于盒中的其它启动子，或者这一盒中所有的启动子可以在低于最高率的水平上表达RNAi试剂。启动子也可以被或者不被分子技术进行修饰,或者相反,例如,通过调控元件获得较弱的水平的转录。启动子可以是组织特异性的或者细胞特异性的。术语“组织特异性的”应用于启动子时是指启动子能够指导目标核苷酸序列向特定类型组织(例如肝脏)进行选择性表达，而另一方面在另一种特定类型组织(例如脑)中缺少同样的目标核苷酸序列的表达。这样的组织特异性启动子包括诸如Ick、肌细胞生成素或者thyl。术语〃细胞特异性〃应用于启动子时是指启动子能够指导目标核苷酸序列在特定类型的细胞中的选择性表达，而另一方面在同一组织内的另一种特定类型细胞中缺少同样的目标核苷酸序列的表达(参见，例如，Higashibata,等.，.T. Bone Miner. Res. Tanl9 (1):78-88 (2004) Hoggatt,等.，Circ.Res. , Dec. 91 (12) :1151-59 (2002) ;Sohal，等.，Circ. Res. Tu189 (1):20-25 (2001);和Zhang,等.，Genome Res. Tan 14 (1):79-89 (2004))。术语“细胞特异性”用于启动子时也指启动子能够促进目标核苷酸序列在单一组织内部的一个区域内的选择性表达。另外地，启动子是组成型的和可调控的。另外，启动子可以被修饰以便具有不同的特异性。术语“组成型”用于启动子时是指该启动子在缺乏刺激的条件下(例如、热休克、化学的、光等等)仍能够指导一段可操作性连接的核酸序列的转录。一般地，组成型启动子能够指导基本上任意细胞和组织的编码序列的表达。用于转录RNAi种的启动子优选的是组成型启动子，诸如针对泛素、CMV、^肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1alfa或pgk基因的启动子，其由RNA聚合酶II控制，或者由RNA聚合酶I控制的启动子元件。在优选的实施方案中，使用由RNA聚合酶III控制的启动子元件，诸如U6启动子(U6-l、U6-8、U6-9等)、H1启动子、7SL 启动子、人类 Y 启动子(hYl、hY3、hY4 (参见 Maraia,等，Nucleic Acids Res22
(15):3045-52 (1994))、和 hY5 ((参见 Maraia,等.，Nucleic Acids Res24 (18) :3552-59(1994))、人类MRP-7-2启动子、腺病毒VAl启动子、人类tRNA启动子、5s核糖体RNA启动子、和上述任意启动子的功能性杂交和组合。另外地在一些实施方案中，也许优选那些允许RNAi种诱导型表达的启动子。本领域已经熟知许多用于诱导型表达的系统使用这样的启动子，包括然而并非限于四环素应答的系统和Iac操纵子-阻遏子体系(参见W003/022052A1 ;和US2002/0162126A1 )，蜕皮激素调节体系，或者由糖皮质激素、孕酮、雌激素、RU-486、留体、甲状腺激素、环腺苷酸、细胞因子、钙化醇族的调控子、或者金属硫因启动子(由无机的金属调节)调节的启动子。一或多个增强子也可能存在于该病毒多启动子RNAi表达构建体中以增加目标基因的表达。适合于在本发明实施方案使用的增强子包括那些最近已经描述的Apo E HCR增强子、CMV增强子(参见，Xia等，Nucleic Acids Res31~17 (2003))，及其它本领域熟知的增强子。在本发明的一个实施方案中，ApoE增强子元件可以被加到本发明的多启动子盒上。ApoE增强子是一大约155个碱基对(bp)的来源于载脂蛋白E或者ApoE的增强子元件。一或多个拷贝的ApoE增强子可以加在本发明的多启动子盒的第一个、第二个和/或第三启动子的上游或者下游(或者超过三个启动子的上游或者下游)。ApoE是载脂蛋白，可以调控脂蛋白粒子的结合、内化作用和降解代谢并且是针对低密度脂蛋白(ApoB/E)受体和针对肝组织ApoE受体的配基。与ApoE 基因相关的遗传增强子是真核的控制元件，可以增加肝脏特异性核酸的转录。ApoE增强子可能位于肝脏特异性启动子上游或者下游2000核苷酸的位置，并且可能存在一或多个拷贝。由本发明的多启动子RNAi表达盒编码的RNAi序列导致小干扰性RNAs(也就是说在哺乳动物细胞没有毒性的短的、双链RNAs)的表达。只要它们没有显示细胞毒性，本发明的RNAi种的长度没有特定限制的。RNAi可以是，例如，15到49bp长度，优选的15到35bp长度，并且更优选的19到29bp长度。RNAis的双链RNA部分可以完全的同源，或者由于序列错配(在每一链上的相应核苷酸不是互补的)、凸出(一个链上缺少相应的互补核苷酸)等等而导致可能包含非配对部分。这样的非配对部分在它们没有显著地与RNAi形成或者发挥功效相抵触的前提下是可以容忍的。只要RNAi能有效地沉默目标基因，根据本发明的RNAi种的终点可以是平端或者粘端(悬臂式的)。粘端(悬臂式的)的末端结构并不仅仅限制于3’悬臂，但是只要产物RNAi能够诱导RNAi效果，5’悬臂式的结构可以包括在内。另外，悬臂式核苷酸数目可以是任何数量只要产物RNAi能够诱导RNAi效果。例如，如果有的话，悬臂可能由I到8个核苷酸组成；优选地它由2到4个核苷酸组成。本发明使用的的RNAi种可以具有茎-环结构前体(shRNA)其中双链RNA的末端由单链接头RNA所连接。shRNA的单链环部分的长度可以是5到20bp，并且优选的是5到9bp。任意一个转录的核酸序列可以是针对本发明多启动子RNAi表达盒的靶目标。针对该RNAi的可能靶目标是这样的基因，例如然而并非限于发育性基因(例如，粘着分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、fct家族成员、Pax家族成员、翼状螺旋家族成员、细胞因子/淋巴因子和它们的受体、生长/分化因子和它们的受体、神经介质和它们的受体)；肿瘤基因(例如 ABLl、BCLl BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFl R、ERBA、ERBB, EBRB2、ETSl、ETSl、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS, JUN, KRAS, LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLU MYCN, NRAS, PIMUPML、RET、SRC、TAL1 、TCL3 和 YES);肿瘤抑制基因(例如 APC，BRCAl，BRCA2，MADH4, MCC, NFl，NF2，RBl，TP53，和WTl);和酶(例如ACC合酶和氧化酶、ACP去饱和酶和羟化酶、、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATPases、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、查耳酮合酶、壳多糖酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、颗粒结合淀粉合酶、GTPase、解旋酶、半纤维素酶、整合酶、菊粉酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧合酶、溶菌酶、胭脂碱合酶、章鱼碱合酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、肌醇六磷酸酶、植物生长调节剂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支链淀粉酶、重组酶、逆转录酶、RUBISC0、拓扑异构酶、和木聚糖酶)；病毒的结构基因诸如壳体和包膜蛋白质；细菌的基因诸如那些涉及复制或者结构特征，或者来自其它的病原体的涉及复制或者结构特征的基因；另外，本发明的多启动子RNAi表达盒可以用于靶向至特异性序列，所述特异性序列是在常染色体支配的疾病(诸如SCA)中导致病状等位基因，导致Huntington病变的等位基因，或者导致成骨不全的胶原基因等位基因所特有的。本发明的一个重要的方面是由siRNA清除的病毒感染不会导致对感染细胞的任何伤害(Gitlin,等.Nature418 :430-434 (2002))。本发明的这个特征区别于现有技术中的方法，其中清除来自于哺乳动物宿主病毒会在免疫系统或者由病毒引起的细胞凋亡的作用下导致受感染细胞的破坏(Guidotti等.Annu. Rev.1mmunol. 19 :65_91(2001))。因而本发明的这个方面提供了一个有效的RNAi试剂可在非细胞致病条件下清除病毒。
以靶向靶目标核酸序列的遗传序列为基础选择RNAi种的序列；并且优选的以靶目标核酸序列保守区域为基准。例如，选择针对治疗病毒感染或者针对构建RNAi疫苗的RNAi序列时，优选的序列是那些在该病毒种间甚至亚种之间保守的序列。如本领域所公知病毒变异很快，保守序列的选择要尽可能在一段时间内保留RNAi的功效。在选择RNAi序列以治疗癌症或者其它的疾病时，优选的序列是那些在基因或者肿瘤基因变体之间保守的序列。本领域已经熟知用于序列同源性比对和RNAi序列选择的方法。两个或更多序列之间同一性百分比的确定可以通过数学算法完成。优选的，非限制性的例子是Myers和Miller的算法(1988) ；Pearson和Lipman的搜索相似性方法(1988)；以及Karlin和Altschul的算法(1993)。优选的，使用计算机执行这些数学算法。这样的例子包括但是不局限于个人计算机上的CLUSTAL基因程序(可以从Intelligenetics, Mountain View,Calif 中获得 );ALIGN程序(版本 2. 0)、GAP、BESTFIT、FASTA，Megalign、(使用 Jotun Hein,Martinez,Needleman-Wunsch 算法)，DNAStar Lasergene (seewww. dnastar. com)和威斯康星遗传学软件包中的 TFASTA,版本 8(可以从 Genetics Computer Group(gcg), 575ScienceDrive Madison Wis. , USA中获得)。使用这个程序的同源比对可以使用缺省参数或者操作员选择的参数来执行。CLUSTAL程序已经由Higgins详细描述过。ALIGN程序以迈尔和Miller的为基准；并且BLAST程序以Karlin和Altschul的算法为基准；执行BLAST分析的软件可通过 the National Center for Biotechnology Information 获得(http ://www.ncb1. nim. nih. gov/)。为了进行序列比对，一个序列作为基准序列，待检验序列与其进行比对。在使用一个序列比对算法时，待检验和基准序列输入电脑，如有必要指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。接着，以指定的程序参数为基准，序列比较算法计算待检验序列(S)相对于基准序列的序列同一性百分率。
一般地被RNAi抑制的目标序列需要在目标序列和RNAi分子有义链之间很高的序列同源性。在一些实施方案中，这样的同源性高于大约70%，并且可以是高于大约75%。优选地，同源性高于大约80%，并且高于大约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在使用多启动子RNAi表达构建体靶向病毒感染的实施方案中，病毒不同的亚种基因组一一甚至在保守的区域一一之间15到30个连续的核苷酸序列的同源性可能没有到达超过90%甚至80%的水平。在这种情况下针对一些亚种的目标序列和RNAi有义链之间的序列同源性可以是80%或者更低。另一方面，当生物的靶基因没有显示出种、亚种或者变体之间的高度序列同源性时，本发明的多启动子RNAi表达构建体特别的有用，此时多启动子RNAi表达盒中的每一个RNAi种都可用于定位靶基因(s)或者变体或者亚种集合的不同部位。除了以目标序列的保守区域为基准选择的RNAi序列之外，选择RNAi序列可以其它的因子为基准。尽管已经有许多努力来设计针对鉴别序列一该鉴别序列是基于目标序列的特征(例如，GC含量百分比、翻译起始密码子位置、或者基于用于搜索建议的RNAi同源性的序列数据库的序列相似性)并在RNAi中是有效的一的选择标准，目前还不能以很高的可信度预言无数可能的相应于靶目标的RNAi候选序列能够引发实际的RNA沉默反应。相反的，通常，生产并检测特异的候选RNAi多核苷酸序列以确定对靶目标表达的干扰是否被引发出来。当前的抗病毒的疗法的一个主要的问题是出现抗药性变体，一般地称为逃避突变体(Gitlin等.T.of Virol. 79 ;1027_1035，(2005))。本发明的一方面可压制出现的逃避突变体。在本发明的一些实施方案中对治疗病毒感染的多RNAi序列的选择是基于来自被单链RNAi序列感染的细胞中的逃避突变体。出现的逃避突变体是由在细胞被病毒感染后使用包含RNAi单链序列的表达构建体进行的治疗来确定的。包含有抗性病毒的细胞被收集起来并且对病毒基因组进行测序。测序结果显示出现的主要突变体是用于抵抗病毒抑制的。产生本发明的多启动子RNAi表达构建体，其包含有基于靶目标基因序列之RNAi序列以及附加的用于抵抗RNAi治疗的点突变序列。如所述，多启动子RNAi表达盒的RNAi编码区域可操作的连接至终止子元件。在一个实施方案中，终止子包括具有四个或更多胸苷残基的伸展区域。在一个优选的实施方案中，所有使用的终止子元件都是不同的，而且是和启动子元件相匹配的，两者源于同一基因。这样的终止子包括SV40poly A、Ad VAl基因、5S核糖体RNA基因以及人类t_RNA的终止子。另外的，启动子和终止子可以混合并匹配，正如通常使用RNA polll启动子和终止子那样。另外的，可以配置多启动子RNAi表达盒使得多克隆位点和/或特定限制性位点可按一定的策略而定位，比如启动子、RNA i和终止子元件可以轻易的移走或替换。而且多启动子RNAi表达盒可以由小寡核苷酸组分装配而来，该组分使用有策略地定位的限制性位点和/或互补粘末端。根据本发明实施方案的基础载体之一包括了具有多重连接子的质粒，其中所有的位点都是特定的(虽然这并不是绝对的要求)。接着，每一个启动子都插入到设计好的特定位点中形成了一个具有三个或更多启动子的基础盒，所有的启动子可以具有不同的方向。然后，退火引物对插入到每个启动子下游的特定位点上，形成了三重表达载体构建体。这样的插入可以移动到，例如，使用在三重表达载体插入位点侧翼的两个特定酶切位点(相同或不同)的AAV骨架上。在图1的步骤300中，多启动子RNAi表达盒连接到递送载体上。多启动子RNAi表达盒所插入的并用于在多种细胞中有效地转导并表达RNAi试剂的构建体是来源于病毒的并且可以容纳病毒递送。该构建体的生产可以本领域公知的任意基因工程技术实现，包括但不限于，标准PCR技术、寡核苷酸合成、限制性内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序。构建体优选包括，例如，将多启动子RNAi表达构建体包装至病毒颗粒所需的序列和/或允许多启动子RNAi表达构建体插入至靶细胞基因组的序列。病毒构建体也可以包含允许病毒复制和增殖的基因，尽管在优选实施方案中这样的基因是顺式的。另外的，病毒构建体可以包括任意已知生命体中天然的或经修饰的基因组中的基因或遗传序列。例如，优选的病毒构建体包括了用于在细菌中复制的序列。该构建体也可以包含附加的遗传元件。可包括在构建体中的元件种类不受任何限制并且可由本领域技术人员选择。例如，附加的遗传元件可以包括报告基因，诸如一个或多个荧光标记蛋白(如GFP或RFP)，一个易于检测的酶如￠-半乳糖苷酶、萤光素酶、￠-葡糖醛酸糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或者分泌的胚胎碱性磷酸酶；或者可用于免疫分析的蛋白如激素或者细胞因子。可用于本发明实施方案的其它遗传元件包括那些编码蛋白质的元件一所述蛋白质可给细胞带来选择性生长优势，例如腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素一 3 —磷酸转移酶，或者编码可提供在营养缺陷型中缺失的生物合成能力的蛋白质。如果包含顺着多启动子RNAi表达盒的报告基因，那么内在核糖体进入位点(IRES)序列也可包含在其中。优选地，附加的遗传元件可操作性地被连接并由独立的启动子/增强子所控制。基于合适病毒的病毒递送系统可以用于递送本发明的多启动子RNAi表达构建体。另外的，可以使用杂交病毒系统。病毒递送系统的选择依赖于多种参数，例如递送的靶组织、系统的转导效率、致病性、免疫和毒性等等。考虑到可使用本发明的多启动子RNAi表达盒所干扰的目标疾病的多样性，没有一个单一的病毒系统可以适合所有的应用。当选择病毒递送系统来应用到本发明中的时候，选择这样系统是很重要的，所述系统中包含多启动子RNAi表达盒的病毒颗粒优选是1)可再生并稳定增殖的；2)可以纯化至很高的滴度；和3)能够调控靶向递送(将多启动子RNAi表达构建体递送至目标组织或器官而不带有大范围的扩散)；4)能够以组成型或可调节型的方式进行表达。总的来说，根据基因组是整合到宿主细胞染色体中(肿瘤逆转录病毒和豆状病毒)还是主要作为染色体外游离基因存在于细胞核中，五种最常见的适用于基因治疗的病毒递送系统被分为两类。这种区分是决定每种针对特定用途载体的适用性的重要因素；非整合型载体可以，在某些情况下，在非增殖细胞中调节持续的基因表达，但如果在分裂的细胞中需要维持稳定的遗传改变，整合型载体就成为选择的工具。
例如，在本发明的一个实施方案中，使用了来自细小病毒科家族的病毒。细小病毒科是一个具有大约5000核苷酸长度基因组的单链、非包膜DNA病毒家族。成员之一是腺伴随病毒(AAV),该病毒是依赖性细小病毒需要和另外的病毒(一般的是腺病毒或者疱疫病毒)协同感染以便引发及维持一个有生产效能的感染周期。缺乏这样的一个辅助病毒的情况下，AAV仍然有能力经过受体调节的结合和内化作用感染或者转导至靶细胞，渗入非分裂和分裂期细胞的细胞核。一旦进入细胞核，病毒打开外壳并且从许多不同的形式表达该转化基因一其中最稳定的是环形的单体。AAV将整合至1-5%的稳定转导的细胞基因组中(Nakai,等.，1-Virol. 76 =11343-349 (2002)。该转化基因的表达可以是特别稳定的并且在一个关于使用AAV递送因子IX的研究中，在该病毒直接侵入5年后犬体模型仍持续表达治疗水平的因子IX蛋白。因为在缺乏辅助病毒的情况下子代病毒不是由AAV传染产生的，转导的程度仅仅受限于感染上该病毒的起始细胞。这一特征使得AAV成为了本发明一个优选的基因治疗载体。而且，不同于反向病毒、腺病毒及单纯疱疫病毒，AAV显不出缺乏对人类的致病性和毒性(Kay,等 ，Nature. 424 :251 (2003)和 Thomas,等 ，Nature Reviews, Genetics4 346-58 (2003))。一般地，AAV的基因组包含仅仅两个基因。“r印”基因编码在DNA复制中使用的至少四个不同的蛋白质。“cap”基因产物被不同地剪接以产生包含该病毒壳体的三个蛋白质。在将基因组包装至初期的病毒的时候，仅仅末端反向重复序列(ITRs)是必需的序列；rep和cap可以从该基因组上删掉并且可被侯选的异源序列替换。然而，为了制造该蛋白质需要复制并将基于AAV的异源构建体包装至初期的病毒颗粒，rep和cap蛋白质必须是顺式的。一般说来通过辅助病毒协同感染来提供该辅助功能，诸如上述的腺病毒或者疱疹病毒也可是以一或多个DNA表达质粒的形式表现为顺式。既然该基因组一般地仅仅编码两个基因，不令人惊讶的是，作为递送工具，AAV限制在4. 5kb单链的包装容量。然而，虽然这一大小限制可能限制了那些可以传递的用于基因治疗的基因，相反地它没有影响较短的序列诸如RNAi的包装和表达。AAV在RNAi应用中的用途在这样的实验中展示，其中AAV用于在体外传递shRNA以抑制p53和胱天蛋白酶8的表达(Tomar等.,Oncogene. 22 :5712_15(2003))。随着克隆适当的序列到易消化的AAV-2载体中，在HEK293细胞中生产了传染性的AAV病毒颗粒并且用于感染HeLa S3细 胞。已经显示出来内生胱天蛋白酶8和p53水平有一个剂量依赖的减少。Boden等人也使用AAV在体外传递shRNA抑制在组织培养系统中的HIV复制(Boden，等.,T. Virol. 77 (21):115231-35 (2003))，正如通过在余下的培养基中存在的p24产品来评价的。然而，在使用AAV作为载体用于多启动子RNAi表达构建体时的技术障碍也必须说明。例如，不同的百分数人类人口可以具有针对某AAV血清型的中和抗体。然而，既然有好几个AAV血清型，对某些类型而言携带有中和抗体的个体百分比急剧的减少，其它的血清型能被使用或者拟类型也可以使用。至少有八种不同的血清型已经被鉴定，而其它许多类型虽然已经被分离但还没有被充分地描述。另一个限制是，作为一个可能的针对AAV免疫反应的结果，基于AAV的治疗仅仅可以执行一次；然而，使用替换的、非人类起源的血清型可以允许重复给药。给药途径、血清型和传递基因组的组成都会影响组织特异性。利用多启动子RNAi表达构建体的未修饰的AAV系统在使用中的另一个限制是转导可能效率低。体内稳定的转导可能限于5-10%的细胞。然而，本领域已经获知不同的方法来促进稳定的转导水平。一个方法是利用拟型，其中使用来源于其它血清型的cap蛋白质包装AAV-2基因组。例如，通过使用AAV-2配对物取代AAV_5cap基因，Mingozzi等人在大约15% 的肝细胞中增加了稳定的转导(Mingozzi，等.,T. Virol. 76 (20):10497-502 (2002))。Thomas等人使用AAV8壳体基因在体内转导了 30%的鼠肝细胞(Thomas，等.，T. Virol, inpress)。virion Grimm 等人(Blood. 2003-02-0495)使用 AAV-1、AAV-3B、AAV-4、AAV-5 和AAV-6穷尽了 AAV-2的拟型以用于组织培养研究。最高的转化基因表达水平是由使用AAV-6的拟型病毒颗粒诱导的；产生了比AAV-2高将近2000%的转化基因表达。因而，本发明打算使用一个拟型化的AAV来实现高度的转导水平，带来RNAi多启动子表达构建体表达的一个相应的增加。使用本发明的启动子RNAi表达构建体的另一个病毒递送系统是一个基于逆转录病毒科(Retroviridae)家族的病毒系统。逆转录病毒包含具有两个独特特征的单链RNA动物病毒。首先，逆转录病毒的基因组是二倍体，由两个拷贝的RNA组成。第二，这个RNA经过病毒颗粒关联的酶逆转录至双链DNA。这一双链DNA或者原病毒能因此整合至宿主基因组并且作为该宿主基因组的稳定的整合元件从母细胞传递到后代细胞。在一些实施方案中，慢病毒是用于本发明的逆转录病毒的优选成员。通常使用泡状滑石病毒糖蛋白(VSV-G)来拟型慢病毒载体，并且已经起源自人类免疫缺陷性病毒(HIV)-人类艾滋病(AIDS)的病原；羊脑炎-慢性进行性肺炎，它可在绵羊中导致脑炎(visna)或肺炎；马传染性贫血病毒(EIAV)，它在马匹中导致自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，它在猫科动物中导致免疫缺陷；在牛中导致淋巴结病和淋巴细胞增多的牛免疫缺陷病毒(BIV);猿的免疫缺陷病毒(SIV)，它在非人类灵长目中导致免疫缺陷和脑病。基于艾滋病病毒的载体一般地保持〈5%的亲本的基因组，并且〈25%的基因组是合并进入包装构建体，最小化了恢复复制能力HIV的产生可能性。通过自我失活载体的发展已经进一步增加了生物安全性，自我失活载体包含了在长末端重复序列下游的调控元件删除，消除了载体动员需要的包装信号的转录。逆转录病毒RNA基因组的逆转录发生在细胞质中。不同于C-型逆转录病毒，和其它的病毒因子复合在一起的慢病毒cDNA—被称为前起始复合物一能越过核膜发生移位并且转导入非分裂细胞。该病毒cDNA的结构特征一DNA副翼一似乎有助于有效率地进入细胞核。这个副翼依赖于位于病毒的聚合酶基因上的中央多嘌呤区域(cPPT)的完整，所以大多数的慢病毒起源的载体保持了这个序列。慢病毒有广泛的向性，低的炎症性潜能，并且导致形成整合载体。主要的 限制是在一些运用中整合可以导致肿瘤生成。使用慢病毒载体主要的优点是在大多数的组织或者细胞类型中基因转移是持续的。用来表达RNAi试剂的基于慢病毒的构建体优选地包含有来自慢病毒长末端重复(LTRs)5’和3’的序列。更加优选地该病毒构建体包含有来自于慢病毒的一个失活或者自我失活的3’LTR。LTR可以根据本领域熟知的任意方法通过自我失活而制造。在一个优选的实施方案中，3’ LTR的U3元件包含增强子缺失的序列，优选的增强子是TATA box.Spl和NF-kappa B位点。作为3’LTR自我失活的结果，整合到宿主基因组的原病毒将包含一个失活的5’LTR。LTR序列可以是来自任意慢病毒种的LTR序列。另外，可以使用病毒构建体中的一个启动子序列替换来自慢病毒5’ LTR的U3序列。这可以增加从包装细胞系中恢复的病毒的滴度。同时也可以包括一个增强子序列。本领域技术人员熟知的其它的病毒或者非病毒系统可以用于传递本发明的多启动子RNAi表达载体到目标细胞，包括然而并非限于通过整合至寄主细胞在体内稳定地维持病毒编码转化基因的基因缺失腺病毒-转座子载体(参见Yant，等.，NatureBiotech. 20 :999-1004 (2002));来源于辛德毕斯病毒(Sindbis virus)或者西门利克森林病毒(Semliki forest virus)的系统(参见 Perri，等.，T. Virol. 74(20):9802-07(2002));来源于新城疫病毒或者仙台病毒的系统；或者缺少细菌的DNA序列的小环状DNA载体(参见Chen,等.，Molecular Therapy. 8 (3):495-500 (2003))。在美国公开 No. 2004/0214329中描述的小环状DNA展示了用于持续高度水平地转录核苷酸的载体。该环状载体的特点在于缺乏表达沉默的细菌序列，并且除表达盒之外可能包括一个单向的位点特异性重组产品序列。此外，杂种病毒系统可以用于组合两个或更多病毒的系统有用特性。例如，野生型AAV的位点特异性整合机器可以耦联腺病毒的高效内化作用及核靶向特性。腺病毒或者疱疹病毒中存在的AAV经历了一个高产的复制循环；然而，在缺乏辅助功能的情况下，AAV基因组整合至染色体19上的特异性位点。AAV基因组的整合需要AAV rep蛋白质的表达。因为常规的AAV载体删除了包括rep在内的所有病毒基因，它们不能特异地整合至染色体19上。然而，这个特征可以在适当的杂交系统中开发出来。此外，非病毒遗传元件可以用于实现在一个病毒的输送系统中所需的特性要求，诸如那些允许位点特异性重组的遗传元件。在图1的步骤400中，多启动子RNAi表达构建体包装至病毒颗粒中。本领域熟知的任意方法可以用于生产传染性病毒颗粒其基因组包含有该病毒多启动子RNAi表达构建体的一个拷贝。图4A和4B显示用于包装本发明多启动子RNAi表达构建体至被递送的病毒颗粒中的另外的方法。在图4A中的方法使用了包装细胞，该细胞按照顺式稳定地表达将病毒多启动子RNAi表达构建体结合至病毒颗粒所需要的病毒蛋白质，以及用于特定的病毒的输送系统的必要的或者优选的其它的序列(例如，复制需要的序列，结构蛋白质和病毒装配)和针对组织进入的或病毒起源的或人工来源的配体。在图4A中，多启动子RNAi表达盒连接到病毒递送载体上(步骤300)，并且产物病毒多启动子RNAi表达构建体用来转染包装中的细胞(步骤410)。包装细胞继而复制病毒序列，表达病毒蛋白质并且包装病毒多启动子RNAi表达构建体至传染性病毒颗粒(步骤420)。包装细胞系可以是能够表达病毒蛋白质的任意细胞系，包括然而并非限于293、HeLa、A549、PerC6、D17、MDCK、BHK、bing cherry、phoenix、Cf2Th或者其它任意的本领域技术人员熟知或制造的细胞系。例如，在美国专利No. 6，218，181中描述的包装细胞系。另外地，不能稳定地表达必要的病毒蛋白质的细胞系可以由两个或更多构建体共转染以实现功能性粒子的有效生产。这样的构建体包含有病毒多启动子RNAi表达构建体，并且另一个质粒(s)包含有编码允许细胞生产功能性病毒(复制并且包装构建体)所必需蛋白质的核酸以及其它的辅助功能。图4B显示的方法使用了用于包装那些没有稳定地表达的病毒复制品和包装基因。在这个例子中，启动子RNAi表达构建体连接到病毒递送载体(步骤300)中然后和一或多个表达复制所需病毒序列以及传染性病毒颗粒产品的载体进行共转染(步骤430)。细胞复制病毒序列，表达病毒蛋白质并且包装病毒多启动子RNAi表达构建体至传染性病毒颗粒中(步骤420)。包装细胞系或者复制及包装构建体可能不表达包膜基因产物。在这些实施方案中，编码包膜蛋白的基因可以在一个单独的构建体上提供也就是说和病毒多启动子RNAi表达构建体共转染。因为包膜蛋白在某种程度上负责病毒颗粒的寄主范围，病毒可以是拟型的。如同在上面描述的，“拟型化”病毒是具有来自于病毒包膜蛋白的病毒颗粒，此病毒并不是该基因组起源的病毒。本领域技术人员可以选择适当的拟型用于使用的输送系统及靶向的细胞。除给予特异性 寄主范围之外，选择的拟型可以准许病毒浓缩至很高的滴度。另外地病毒可以由用于限制向特异性种传染的嗜环境性包膜蛋白质进行拟型(例如，嗜环境性包膜仅仅允许传染鼠科动物细胞，而两向性包膜允许传染人类和鼠科动物细胞)。此外，遗传修饰的配体能用于细胞特异性靶向，诸如用于肝细胞的脱唾液酸糖蛋白，或者用于受体调控结合的铁传递蛋白)。经过在包装细胞系中生产之后，包含多启动子RNAi表达盒的病毒颗粒进行纯化和定量(滴定)。纯化策略包括密度梯度离心，或者，优选的，柱层析法。本发明的病毒多启动子RNAi表达盒可特别适合用作处理疾病的治疗手段或者预防疾病的疫苗。例如，多启动子RNAi表达构建体可以被引入癌症细胞或者肿瘤中以抑制维持致癌症/肿瘤发生表现型所必需的基因的表达。同样地，多启动子RNAi表达构建体可以被引入感染上病原体诸如病毒的细胞中以抑制一个或多个的维持病原体所必需的基因的表达。多启动子RNAi表达构建体可以是用作疫苗来靶向引发或者维持疾病或者病状所需的基因。本发明的病毒多启动子RNAi表达构建体可以用于治疗癌症，包括实性肿瘤及白血病，包括胺前体摄取与脱羧细胞瘤、迷芽瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、良性肿瘤心脏病、恶性肿瘤(例如，Walker、基细胞、嗜碱性鳞状细胞、褐色皮尔斯、导管、Ehrlich肿瘤、原位、Krebs2、Merkel细胞、粘质的、非小细胞肺、燕麦细胞、乳头的、硬癌的、支气管、支气管播散、鳞状上皮细胞、及移行细胞)，组织细胞紊乱，白血病(例如B细胞、混合细胞、裸细胞、T细胞、慢性T细胞、HTLV-1I关联的、急性淋巴细胞、慢性淋巴细胞、肥大细胞及脊髓)，恶性hystiocytosis、霍奇金病、小免疫增生、非霍奇金淋巴瘤、浆细胞瘤、网状内皮组织增殖、黑素瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、颅咽瘤、无性细胞瘤、错构瘤、间叶性肿瘤、中肾瘤、肌肉瘤、造釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋养叶瘤、腺癌、腺瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢恶性肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤(例如,尤因、实验的、考波希、及肥大细胞)，赘生性肿瘤(例如，骨、乳房、消化系统、结肠直肠、肝脏、胰腺、垂体、睾丸、眼眶、头、及颈、中枢神经系统、听觉的、骨盆、呼吸道及泌尿生殖器)神经纤维瘤、及子宫颈非典型增生、及针对其它的情况的治疗其中细胞变成不死的或者改造的。此外，本发明的多启动子RNAi表达构建体可被用于与其它的治疗方式的联合，诸如化学疗法、外科手术、冷冻疗法、闻温、放射治疗等等。参与病原体复制、病原体递送、或者维持传染的基因可以经过病毒多启动子RNAi表达构建体来进行祀向。这 样的病毒多启动子RNAi构建体可以用于治疗处于被病原体传染的危险中的细胞(例如疫苗)或者已经被感染的细胞。可以由本发明的多启动子RNAi表达构建体及方法治疗的病原体包括来自细小病毒科家族的病毒、乳多空病毒科(包括乳头状瘤病毒等等)，腺病毒科、疱疹病毒科(包括疱疹病毒类型I到7)，痘病毒科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒科、小核粮核酸病毒(柯萨基A和柯萨基B病毒及艾柯病毒)，萼状病毒科、呼肠孤病毒科、toga病毒科、(脑炎病毒)，黄素病毒科(脑炎病毒)、沙粒病毒科、逆转录病毒科、布尼亚病毒科、冠状病毒科、正粘液病毒科、副粘液病毒科、弹状病毒科及丝状病毒科，一般的细菌，分枝杆菌、真菌、疟疾、锥虫血吸虫属等等。在图1的步骤500中，多启动子RNAi表达构建体被递送至需要治疗表达细胞。本发明的多启动子RNAi表达构建体可以在体外引入细胞然后接着放入动物中以影响治疗过程，或者通过体内给药直接地给药至有机体、器官或细胞。通过病毒感染的递送是优选的递送方法；然而，可用于多启动子RNAi表达构建体的任意适当递送方法都是可使用的。利用任意适当的操作规程包含有多启动子盒的载体可以给药至哺乳动物宿主，本领域已经熟知许多这样的操作规程。核酸可以通过许多途径被引入组织或者寄主细胞中，包括病毒感染、显微注射、或者囊泡融合。注射也可能用于肌肉给药，如同Furth等Anal. Biochem. 115 (205) :365-368(1992)描述的。核酸可以覆盖在金颗粒上，并且通过文献中描述的颗粒轰击装置或者“基因枪”(参见落入，Tang等.，Nature. 356 :152-154 (1992))递送至真皮内，其中金颗粒被DNA所包装，继而轰击至皮肤细胞。另一个可用于本发明的递送方法包含了使用如Daviset等在美国专利No. 6,509,323中描述的Cyclosert 技术。Cyclosert 技术平台是基于被称为环糊精的葡萄糖杯状周期重复分子。环糊精分子的"杯"可以与其它分子形成“内含物复合物”，使得对Cyclosert 聚合体与其它部分进行组合以提高稳定性或者增加靶向配体成为可能。此外，一般地环糊精已经被认为对人类是安全的(单独的环糊精普遍地提高FDA批准和IV药物的溶解度)。
包含多启动子盒的载体可以通过在水性或非水性溶液中溶解、悬浮和乳化制备成用于注射或者给药的制品，非水性溶液可以是例如油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯、或者丙二醇；并且如果需要，可以使用常规的添加剂例如增容剂、等渗剂、悬浮剂、乳化齐U、稳定剂和防腐剂。此外，包含多启动子盒的载体可以和适当的、药学上可接受的载体或稀释液一起制备成药物组合物。在制药学剂型中，包含多启动子盒的载体可以单独给药或者和其它药学活性成分联合或组合给药。本领域技术人员可以很容易理解包含多启动子盒的载体的剂量水平可以作为递送系统天然性质、靶目标细胞转化的相对难易性、靶目标细胞中RNAi种的表达水平等等的函数而变化。
实施例丙型肝炎病毒(HCV)是一种可以使用本发明多启动子RNAi表达构建体治疗的疾病。根据疾病控制预防中心汇编的统计资料，几乎2%的美国人一将近4百万一现在已经感染了 HCV。起初，大部分的HCV个人感染没有显示出任何症状；然而，超过80%的将发展成慢性和逐步发展的肝脏疾病并最终导致肝硬化或肝细胞癌。在美国HCV是导致肝移植的最主要原因并且每年导致8000到10000名美国人的死亡。世界卫生组织估计在全球有超过I亿七千万的感染者，在某些国家感染率高达总人口的10-30%。HCV是正义单链包膜RNA病毒，属于黄素病毒科家族。HCV的感染周期一般地开始于受体介导的结合及内化作用后病毒颗粒进入细胞。在细胞质中打开外壳之后，包含基因组的RNA正义链可以和宿主细胞翻译机器直接相互作用。缺少5’ cap的甲基化，RNA在5’非翻译区(UTR)形成了一个充分的二级结构，其中UTR提供了内在核糖体进入位点(IRES)并允许40S亚基的直接结合以作为翻译程序的起始步骤。HCV基因组，大约9600个核苷酸的长度，编码了名为多聚蛋白(在图8A中显示)的一个长开放读码框。病毒蛋白质从多聚蛋白上以连接的前体形式生产出来，多聚蛋白随后由多种病毒和细胞中的酶切割为成熟产品。这些基因中编码了结构蛋白，包括核心与包膜糖蛋白，这样命名是因为它们在后代病毒颗粒中是完整的结构组分。非机构性蛋白质，提供了不可缺少的功能例如依赖RNA的RNA聚合酶，也被生产出来。病毒颗粒复制机器在被感染细胞的细胞质内建立起来并可以将正义RNA转录成为负链中间体。因此，HCV基因组细胞同时作为自身复制的模板以及用于翻译病毒编码蛋白的信使RNA。负链被转录回正链RNA，因此增加了细胞中正链拷贝的数量。在这个阶段，正链RNA可以和宿主细胞翻译机器再一次相互作用或者，如果已经有足够的结构蛋白质的积累，被包装成病毒颗粒。随着从细胞中的释放，病毒在整个感染周期中重复。实施例1 :用于体内递送shRNA序列的AAV-2表达载体的开发在对经由感染性粒子的shRNA递送进行检验之前，合适的表达质粒被构建并验证。在设计多启动子RNAi表达构建体时 至少有两个特征需要考虑1)构建体必须能有效地包装进入后代病毒颗粒；和2)质粒必须提供高水平的shRNA表达。此外，为了检测多启动子RNAi表达构建体，必须有评估转染和转导效率的手段。已经被rep和cap序列掺入(gut)的AAV-2载体提供了用于病毒RNAi表达构建体的骨架(在下文中指的是rAAV载体)。这一载体已经广泛应用于AVV研究中并且对高效率包装的需要已经有了很好的理解。U6和Hl启动子已用于shRNA序列的表达，虽然有报道显示针对每一启动子独立驱动的同一 shRNA有非常不同程度的抑制。然而，如果这样的变异存在的话载体构建中的启动子可以很容易地替换。事实上和任何病毒递送系统一样，rAAV载体必须满足特定的标准大小以便被有效地包装。总的来说，rAAV载体长度必须是4300-4900个核苷酸(McCarty,等Gene Ther8 1248-1254 (2001))当rAAV载体低于此限制时，必须加入填充片段(Muzyczka,等.Curr.Top. Microbiol.1mmunol. 158 :970129 (1992))。另外地，rAAV 多启动子 RNAi 表达构建体必须加载两个或更多的多启动子RNAi表达盒。在这里所描述的rAAV载体的实施方案中，每一个启动子/ RNAi /终止子组件长度大约400个核苷酸，留下了足够的空间用于在每个表达盒中容纳多个启动子/ RNAi /终止子组件。另外地，可以在rAAV多启动子RNAi表达构建体中加入一个或多个选择性标记盒以便用于评估rAAV表达构建体的转染效率，并允许使用经感染的病毒颗粒递送的rAAV表达构建体来对靶目标细胞的转导效率进行量化。初始的检验表达载体驱动了 shRNA种的表达，该shRNA种根据已证明具有抑制来自报告构建体的萤光素酶活性能力的序列而设计(参见，Elbashir,等.Embo.1. 20 (23)6877-6888 (2001))。RNAi盒 的元件，包括启动子、shRNA和终止子序列，是短的并且利用长、互补寡核苷酸独立地从新装配，该寡核苷酸继而使用多克隆位点克隆入病毒载体中。商业可得的表达载体编码萤光素酶功能产物作为报告物以便于证明shRNA向下调控靶目标序列(如在图5中所显示的)的能力。虽然针对萤光素酶的shRNA先前已经被验证，由rAAV所递送的shRNA的功效首先在体外进行评估。利用标准技术将检测和报告构建体转染至许可的细胞。使用不相关的shRNA序列替换萤光素酶特异性shRNA的rAAV表达构建体在试验中被用作负对照。通过荧光显微技术评估选择性标记物的水平并由此直接估计转染效率的相对百分比。为了评估shRNA的抑制活性，使用标准的商业试剂盒测量萤光素酶的活性。另外地，使用定量实时PCR分析(Q-PCR)技术分析从平行实验板中收获并纯化的RNA。相对于从使用不相关shRNA种处理过的细胞裂解液中测得的活性，超过90%的活性减少显示了 shRNA是具有高度功能的。执行后续实验以评估shRNA对于萤光素酶报告系统的影响，该系统被转染至小鼠肝脏，与McCaffrey等人在Nature. 418 38~39 (2002)上发表的工作相似。通过水动力转染法递送至小鼠的核酸主要定位在肝脏。与在细胞培养中支配共转染的原理非常类似，来自于混合物的多质粒的同时注射通常所有的表达构建体渗透进入相同的细胞。因此，即使已经证明尾静脉注射程序只能转染肝脏中5-40%的肝细胞(McCaffrey,等.NatureBiotech. 21 (6) :639-644 (2003))，共转染也允许将报告系统和表达构建体递送至相同的细胞中。携带有针对与萤光素酶的shRNA序列的rAAV表达构建体和编码萤光素酶基因的报告构建体一起共注射。在接受了阴性对照的动物中，携带不相关shRNA的表达构建体和报告构建体一起共注射。基于产生于肝脏一部分的溶解产物来测量萤光素酶的活性。肝脏的剩余部分用于Q-PCR测量和组织学分析以确定标记蛋白质的表达从而获得标准化数据。评估转染效率的其它方法包括对来自小鼠的血清进行的ELISA测量，其中使用第三个用于分泌蛋白质诸如人类a I 一抗胰岛素(hAAT) (Yant,等 Nature Genetics. 25 :35-41(2000),也参见 McCaffrey,等.Nature Biotech. 21 (6):639-644 (2003))的标记质粒共转染小鼠。一旦确认了表达构建体在体外细胞培养系统和使用裸露DNA质粒共转染的小鼠模型中同样具有功能，从rAAV表达构建体包装成为感染性病毒颗粒开始进行检验。从商业可得的AAV无辅助子系统制造感染性粒子，该无辅助子系统需要三个单独的表达构建体进行共转染，包括I)表达针对萤光素酶的shRNA (侧翼是AAV ITRs)的rAAV构建体；2)编码AAV rep和cap基因的构建体；和3)包含有生产高滴度病毒所需的辅助腺病毒基因的表达构建体。在标准纯化程序之后，病毒颗粒可用于实验。在小鼠被注入rAAV颗粒之前，小鼠肝脏中已经建立了一套报告系统。水动力的转染被用来递送萤光素酶报告构建体和为了对照动物之间转染效率差异的针对hAAT的表达质粒。小鼠被允许恢复几天以便产生足够水平的报告物活性。在肝脏中确证了萤光素酶报告活性之后，通过门静脉或者尾静脉将rAAV粒子注入正常C57B1/6小鼠。携带有不相关shRNA表达构建体的rAAV粒子被用作阴性对照。起初，使用较高的剂量(2xl012载体基因组(vg))注入小鼠，在随后的实验中降低剂量以产生剂量一反应曲线。经过七到十天后，处死小鼠，收集肝脏和血清的样本。从分离的肝脏中利用萤光素酶分析和前面描述的QPCR程序来决定肝脏萤光素酶活性与RNA的相关水平。另外地，通过测量肝脏组织连续切片中的标记蛋白质来评估转导的效率。实验的结果可能有很宽的范围。前面已经证明水动力的转染程序可能导致5-40%肝细胞的转染。使用AAV-2递送程序转导肝细胞的结果显示了 5-10%的转导效率。虽然AAV可能优先地转导通过初始尾静脉注射程序转染的同样的肝细胞库，每一种技术影响的细胞子集可能是不重叠的。如果发生前者情况，可以看到相对于由不相关shRNA种转导的小鼠而言有一个萤光素酶活性的减少。如果发生后者的情况，那么不会观察到萤光素酶活性的降低。
必须要证明由三重表达构建体递送的AAV粒子在体外抑制了萤光素酶一HCV融合蛋白报告物。许可的组织培养细胞被图9详述的报告构建体所转染。此外，每一种共转染混合物都具有编码hAAT的质粒。培育48小时之后，使用携带有针对HCV的三重启动子shRNA表达质粒的感染性粒子对细胞进行给药。包含表达三种不相关shRNA种的三重启动子构建体的AAV颗粒被用作阴性对照。测量萤光素酶的活性以验证AAV递送的shRNA是高度有功能的。实施例2 :增强AAV转导肝脏组织效率的修饰虽然已经证明基于AAV的载体能够递送需要的序列至肝细胞，一般而言发生在那些组织中的转导的相对水平是相当的低。当前使用AAV-2以递送和表达血液因子IX的血友病临床研究中，未取得有重大意义的结果。为了治疗血友病，关键的因素仅仅是补充分泌蛋白使其达到可发挥疗效的水平。这样的补充可能发生在少数能够表达大量所需蛋白的转导细胞中。然而，因为RNAi作用机制是细胞内的并且其效果并不能直接在细胞间传播，必须增加转导的效率以便AAV能表达shRNA并用于治疗。McCarty等人能够生产自身互补AAV载体(scAAV)，该载体在其衣壳中同时具有同一表汰盒的if链和负链(Gene Ther. 8 1248-1254 (2001))。这是通过突变5’ITR并且保留3’ ITR不变而完成的。通过突变或者删除末端分离位点其它非基本AAV序列，因而消除了野生型AAV和这个构建体之间可能的重组，创造了一个DNA模板其中复制在3’ ITR起始。一旦复制机器到达5’ ITR，不会发生分离并且复制持续到3’ ITR0结果产物具有正链和互补负链，仍然可有效地包装。使用scAAV载体，转导的肝脏细胞增加到总肝细胞的30% (Fu,等.Molec Therapy. 8 (6):911-7. (2003))。当在内质网液泡间递送时,超过50%的小脑梨状神经元被sckkN粒子转导。Thomas等人报道自身互补载体能够在小鼠肝脏中产生比以相同剂量注入小鼠肝脏中的相应的单链AAV表达载体高50倍的萤光素酶转基因表达水平(Thomas,等.，J. Virol, (in press))。虽然略微下降,注射后将近一年在载体之间表达的相对差异度维持在20倍。此处使用了相似的策略。由于与包装rAAV多启动子RNAi表达构建体关联的大小限制，可用于递送治疗性序列一同其它病毒递送系统相比已经相当的小一的空间数量由于使用scAAV而减半。因此，大小的限制被降低到2250个核苷酸而不是能够包装4500个核苷酸。不管这些，多启动子RNAi表达h盒的大小允许这样的构建体。图6显示了 ScAAV内部主要元件的图解。AAV递送系统的其它修饰也被用于极大地增加转导的效率，包括使用来自其它血清型的Cap蛋白包装rAAV-2载体基因组以生产拟型化的病毒颗粒。即使有经过使用拟型化策略而获得的优点，对肝细胞转导效率的极限可能仅仅增加到总人口的15%。然而，12个其它的AAV血清型已经被分离并鉴别，但还没有能够具体描述至可评估的程度。例如，其中之一的是AAV-8，它最初从恒河猴心脏组织中分离出来。在测定新的cap蛋白对转导所具有的作用时，拟型化的病毒被创造出来，其中单链AAV-2基因组是用AAV-Scap拟型的。载体携带LacZ基因以便评估注射增加剂量的感染性颗粒后对小鼠肝脏转导的相对效率。对结果的总结(Thomas,等.T Virol. 78 (6) =3110-22. (2004))显示在下面的表I中表1AAV-2/2和AAV-2/8的剂量反应(％ beta-gal阳性的肝细胞)
权利要求
1.包含多启动子表达盒的遗传构建体，所述多启动子表达盒包含至少三个启动子/RNAi/终止子组分，其中每个启动子/RNAi/终止子组分包含启动子元件、终止子元件和与启动子元件和终止子元件可操作地连接的编码RNAi种的序列，并且其中每个RNAi种彼此各不相同，且其中所述RNAi种中的至少一个由SEQ ID N0:19编码。
2.根据权利要求1的遗传构建体，其中所述RNAi种中的至少一个由SEQID NO 6或SEQ ID NO :8 编码。
3.根据权利要求1的遗传构建体，其中所述RNAi种由SEQID NO :8、19和22编码。
4.根据权利要求1至3中任一项的遗传构建体，其中所述遗传构建体还包含将该构建体包装进入感染性病毒颗粒中所必需的元件。
5.根据权利要求1至3中任一项的遗传构建体，其中存在有在任一盒内部出现一次的终止子元件与出现两次或者以上的终止子元件的集合。
6.根据权利要求1至3中任一项的遗传构建体，其中存在有在任一盒内部出现一次的启动子元件与出现两次或者以上的启动子元件的集合。
7.根据权利要求1至3中任一项的遗传构建体，其中所述RNAi种靶向至具有变体之间序列单核苷酸多态性(SNP)的基因，并且每个RNAi种可以靶向至一或多个变体的亚型。
8.根据权利要求1至3中任一项的遗传构建体，其中所述RNAi种靶向经历快速突变的病毒序列。
9.根据权利要求1至3中任一项的遗传构建体，其中所述RNAi种的序列靶向基因的一个或多个变体。
10.根据权利要求1的遗传构建体，其中所述RNAi种基于靶基因的序列，以及附加地基于具有用于抵抗RNAi治疗的点突变的序列。
11.权利要求1至10中任一项的遗传构建体在制备用于治疗丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
12.权利要求1至10中任一项的遗传构建体在制备用于修饰在细胞中表达的一或多个核酸靶的药物中的用途，包括 a)将权利要求1至10中任一项的遗传构建体包装进入病毒颗粒； b)将该病毒颗粒递送至细胞；和 c)在待修饰的核酸靶足以表达的条件下表达来自权利要求1至10中任一项的多启动子表达盒中的三个或更多个RNAi种， 其中所述核酸靶基本上与在病毒中发现的基因相同，并且所述病毒是丙型肝炎病毒。
13.权利要求1至10中任一项的遗传构建体在制备用于修饰在细胞中表达的一或多个核酸靶的药物中的用途，包括 a)将权利要求1至10中任一项的遗传构建体包装进入非病毒颗粒； b)将该非病毒颗粒递送至细胞；和 c)在待修饰的核酸靶足以表达的条件下表达来自权利要求1至10中任一项的多启动子表达盒中的三个或更多个RNAi种， 其中所述核酸靶基本上与在病毒中发现的基因相同，并且所述病毒是丙型肝炎病毒。
14.权利要求1至10中任一项的遗传构建体在制备用于抑制在细胞中表达的一或多个丙型肝炎病毒核酸靶的药物中的用途，其中每个RNAi种基本上与所述核酸靶或所述核酸靶的变体 的序列相同。
全文摘要
本发明提供一种用于RNAi同时递送，优选地在体内向哺乳动物细胞递送的多启动子表达盒。
文档编号A61K38/28GK103060324SQ201210556628
公开日2013年4月24日 申请日期2005年3月4日 优先权日2004年3月5日
发明者P·W·罗尔温克, D·A·苏海, A·A·科雷哈洛夫 申请人:贝尼泰克生物制药有限公司