专利名称：一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种皮肤用槲皮素柔性脂质体及其制备方法。
背景技术：
目前，随着空气污染的日益严重，过强紫外线照射对地球表面生物体的威胁日趋加剧，紫外线引起的皮肤损伤也日益严重。当臭氧层减少10%时，到达地面的紫外线辐射就增加2%，而皮肤病的发病率将增加25% 32%。根据“World Cancer r印ort”报道，世界上每年新诊断的癌症中有30%是皮肤癌，其中90%的皮肤癌是由日光中的紫外辐射引起的。紫外线引起的皮肤损伤主要与UVA及UVB有关，其中UVB是造成皮肤损伤的主要原因。紫外线等多种污染物通过直接福射、产生活性氧簇(reactive oxygenspecies, R0S)导致氧化应激。ROS所致的氧化损伤在多种皮肤病的发病中起着重要的作用。过量的ROS等氧化物引起的氧化损伤主要有以下几点:①致细胞前氧化状态形成，抗氧化防御系统受损。②破坏皮肤的酶及非酶性抗氧化防御系统，使机体易受损而处于各种病理状态，发生皮肤老化、免疫抑制、皮肤肿瘤等皮肤相关性疾病。③引起细胞外基质成分的降解及炎症反应。④氧化构成细胞组织的各种物质破坏细胞的结构、功能和代谢。⑤ROS在UVR引起的肿瘤发生和免疫抑制中都起着促进作用。懈皮素(4H-l-Benzopyran-4_one，2_(3，4-dihydroxyphenyl)-3,5, 7-trihydroxy-Flavone),异名栎精,槲皮黄素。来源为壳斗科植物伊比利亚栎(Quercus iberica)皮和叶，小檗科植物红八角莲(Dysosma veitchii (Hems1.et ffils.) ) Fu,金丝桃科植物红旱莲(湖南连翅)(Hypericum ascyron L.)全草,夹竹桃科植物红麻(Apocynum IancifoliumRus.)叶。广泛分布于自然界各种植物的花、果实、种子中。近年来，研究人员发现蚕豆、甘蓝型油菜、Malus domestica苹果等植物在接受强紫外线照射情况下,植物体内的槲皮素的生物合成量相应增加，从而开展了基于槲皮素防护紫外损伤方面的研究。研究发现槲皮素对超氧阴离子、羟基自由基和单线态氧均有良好的清除作用，且量效关系明显。与其它黄酮类物质相比，槲皮素表现出了较高的对抗辐射的能力。目前，研究者正致力于将槲皮素作为一种ROS清除剂来对抗皮肤的氧化损伤。槲皮素对ROS的清除作用主要表现在两个方面:槲皮素能够直接清除R0S，另外，槲皮素也能作用于与自由基产生有关的酶，间接清除R0S。不仅如此，槲皮素还能鳌合金属离子，即槲皮素分子中的邻苯二酚结构能够鳌合Fe2+和Cu2+，从而发挥其抗氧化作用。本发明中所涉及的槲皮素的功效即为预防和修复紫外线对皮肤的辐射所造成的损伤，近而防治由紫外辐射引起的皮肤癌症。限制槲皮素应用的主要因素是槲皮素的溶解性，槲皮素几乎不溶于水，在水中的溶解度为0.166 μ g *ml-l-7.7 μ g.ηι1-1。因此，目前对槲皮素制剂的研制多集中于提高药物溶解性，延长静脉给药体内循环时间等特性，治疗功效主要为降血脂，扩张冠状动脉、抗肿瘤等药理作用。CN101904820A公开了一种 槲皮素纳米混悬剂冻干组合物及其制备方法和应用，此发明将槲皮素在磷脂和表面活性剂的存在下利用机械力制备成纳米混悬液用于改善槲皮素的溶解性。CN102058536A公开了槲皮素羟丙基β -环糊精包和物脂质体及其制备方法和用途，用于静脉给药显著延长了槲皮素在小鼠的体内循环时间。CN100370968授权了一种槲皮素长效脂质体粉针剂及其制备方法，利用聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)制备槲皮素长循环脂质体粉针剂用于静脉给药，长效脂质体与普通脂质体相比可以显著延长槲皮素在小鼠体内的循环时间，增加AUC。上述专利发明内容都是针对静脉注射给药途径的，针对槲皮素皮肤外用制剂的研究和发明却没有。本发明针对槲皮素抵抗紫外辐射损伤、防治皮肤癌这一功效，将槲皮素制备成皮肤给药柔性脂质体，同时解决槲皮素溶解性差，难以应用的问题，进而提高槲皮素对角质层的渗透量和渗透速度，并增强药物在表皮和真皮中的滞留量，更好地发挥药效。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新型的以天然植物提取物槲皮素为有效成分，与现有同类产品相比具有安全、高效等特点的，并且具有较好溶解性的外用制剂。为达到上述目的，发明人进行深入研究，发明提供一种槲皮素皮肤外用柔性脂质体及其冻干粉，该制剂大大增加了槲皮素在水性介质中的分散浓度，解决了槲皮素应用上的不便。本发明提供的一种新型的以天然植物为提取物槲皮素外用制剂是每IOOmL的脂质体溶液是由下列物质制备而成:槲皮素0.0lg-0.lg，两亲性脂质0.lg-1.2g，胆固醇0.025g-0.6g，表面活性剂
0.05g-3g，抗氧剂0.0Olg-0.5g，其余为水性介质。进一步的，所述的两亲性脂质混合物是指蛋磷脂、豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1，2- 二油酰氧丙基-N，N, N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂一种或一种以上。进一步的，所述的表面活性剂包括胆酸、胆酸钠、Tween20、Tween60、Tween80、Span20、Span60、Span65、泊洛沙姆中的一种或一种以上。进一步的，所述的抗氧剂亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸二钠、维生素E —种或一种以上。进一步的，所述的水性介质是由纯水和水溶性物质组成的。更进一步的，所述的水溶性物质包括有机酸、有机盐、无机酸、无机盐、单糖、二糖及其组合物。有机酸包括有诸如羧酸，磺酸，亚磺酸，硫羧酸，比如甲酸，乙酸，柠檬酸，酒石酸。有机盐包括有诸如羧酸盐，磺酸盐，亚磺酸盐，硫羧酸盐，烷基盐等，比如胆酸钠，醋酸钠，甲基钠，乙醇钠。单糖包括有诸如糖，戊糖，己糖，麦芽糖、乳糖，乳糖等。本发明的第二个目的为提供一种制备上述外用制剂的方法，通过优选所用原料及用量，优化制备参数、提供一种操作简便、适于大规模生产的制备工艺:(I)将槲皮素和两亲性脂质溶解于一种或多种有机溶剂中作为有机相， 用超声波使之充分溶解，然后将抗氧剂加入有机相溶液中。(2)使表面活性剂充分溶于水性介质中作为水相；
(3)将有机相与水相混合之前或之后除去有机溶剂，形成分散均一的脂质体溶液，然后加入冻干保护剂。(4)对步骤(3)所得的脂质体溶液用0.22 μ m的滤膜过滤3_5次，加入适量的冻干保护剂充分溶解，-80°C预冻24h，放入减压冷冻干燥机进行干燥48h后即得脂质体冻干粉。进一步的，所述的抗氧剂可以步骤(I)后加入有机相中，也可以在步骤(2 )后加入水相中。进一步的，所述的冻干保护剂的加入方法可以步骤(2)后加入到水相中，也可以在步骤(3)后加入到制备好的脂质体溶液中，优选前者。进一步的，所述的步骤(3)所述的除去有机溶剂，即可以在有机相和水相混合之前，也可以在机相和水相混合之后。进一步的，所述的步骤(3)所述的除去有机溶剂方法有蒸发、冷冻干燥、超声波等。蒸发是指将有机相与水相混合之前或之后，将有机相或有机相与水相混合液置于水浴锅中加热，搅拌，除去有机溶剂。冷冻干燥又称升华干燥，是指将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。进一步的，所述的冻干使 用的方法包括冷冻干燥法和喷雾干燥法。冷冻干燥法又称升华干燥。将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。喷雾干燥法即通过机械作用，将需干燥的物料，分散成很细的像雾一样的微粒，与热空气接触，在瞬间将大部分水分除去，使物料中的固体物质干燥成粉末。进一步的，所述的冻干使用冻干保护剂包括有葡聚糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、甘氨酸、海藻糖、山梨醇、甘油、果糖、木糖醇、半乳糖中的一种或几种。更进一步的，所述的冻干使用冻干保护剂的用量为2-10g/100m。更进一步的，所述的冻干保护剂可以在制备脂质体溶液时加入到水相中，也可以在冻干前加入到制备好的脂质体溶液中，优选前者。进一步的，根据该工艺生产的脂质体和冻干粉为皮肤外用制剂，如软膏、乳膏、凝胶、乳液、喷雾等。进一步的，根据该工艺生产的脂质体和冻干粉适宜用于抗氧化、抗炎、抗紫外辐射损伤、抗皮肤癌，尤其是紫外线辐射弓I起的水肿、红斑、色素沉着、炎症、免疫抑制等症状。本发明所制的槲皮素脂质体为外用型制剂，用于防护紫外线辐射、修复辐射损伤、预防皮肤癌。槲皮素柔性脂质体的制剂学性质评价:(I)粒径:利用NicompTM380/ZLS动态光散射粒度分析仪对实施例(1)_ (5)的粒径进行测量，可得本制剂的平均粒径为148nm。(2)包封率:使用微柱离心法分离游离槲皮素和脂质体，使用HPLC测定槲皮素药物含量，按照下述公式计算包封率。可得本制剂的包封率为85.41 ±5.77%。E%= (CVC2) X 100%C1为过凝胶柱样品的浓度；C2为未过凝胶柱样品的浓度。(3)体外释放行为:在(37 + 0.5) °C恒温下以浆板法测定体外释药性能(25rpm搅拌)，HPLC法测定药物含量，计算不同时间药物的释放量，计算累计释放量，释放曲线结果见
图1。从图中可以看出槲皮素柔性脂质体可以在48h缓慢释放药物，释放行为符合一级动力学。(4)皮肤渗透行为:为研究脂质体的行为，我们做了如下实验:鼠皮的制备:取健康雄性SD大鼠(180_220g)，拉颈处死，用电动剃毛刀剔去腹部皮肤上的毛，剥离腹部皮肤。用止血镊小心剔除皮下脂肪组织，仔细检查鼠皮的完整性，不得有任何破损。实验方法:用Parafilm将大鼠腹部皮肤固定于Frans扩散池上，角质层朝上，供给室加入样品溶液，接收室为PH7.4的PBS溶液，循环水温度为32 士 TC，搅拌转速为600r.min'供给室封闭式给药，分别于l，2，3，4，5，6，7h定时取样ImL，并立即补充在32°C下保温的接收液lmL，取样液用0.22 μ m微孔滤膜过滤，取20 μ L，HPLC法测定含量。计算单位面积累计透过量Q( μ g.cm-2)，以单位面积累计渗透量Q为纵坐标，时间t为横坐标作图，可以得到累计渗透曲线图2，同时得到药物的稳态渗透速率(Js，μ g.cm-2.IT1)和时滞(h)如下表。从图中可以看出，经脂质体包裹后，槲皮素的皮肤透过速率显著提高，时滞明显减少，说明脂质体增加了药物与皮肤的亲和性，使得药物进入皮肤深层的能力增加。
权利要求
1.一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，其特征在于，每IOOmL的脂质体溶液是由下列物质制备而成: 槲皮素0.0lg-0.1g,两亲性脂质0.lg-1.2g，胆固醇0.025g-0.6g，表面活性剂0.05g-3g，抗氧剂0.0Olg-0.5g，其余为水性介质。
2.根据权利要求1所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，其特征在于，所述的两亲性脂质混合物是指蛋磷脂、豆磷脂、脑磷脂、氢化卵磷脂、1，2-二油酰氧丙基-N，N, N-三甲基溴化铵、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂一种或一种以上。
3.根据权利要求1所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，其特征在于所述的表面活性剂包括胆酸、胆酸钠、Tween20、Tween60、Tween80、Span20、Span60、Span65、泊洛沙姆中的一种或一种以上。
4.根据权利要求1所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，其特征在于述的抗氧剂亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸二钠、维生素E —种或一种以上。
5.根据权利要求1所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，其特征在于所述的水性介质是由纯水和水溶性物质组成的。
6.根据权利要求5所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，其特征在于所述的水溶性物质包括有机酸、有机盐、无机酸、无机盐、单糖、二糖及其组合物。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤: (1)将槲皮素和两亲性脂质溶解于一种或多种有机溶剂中作为有机相，用超声波使之充分溶解，然后将抗氧剂加入有机相溶液中。
(2)使表面活性剂充分溶于水性介质中作为水相； (3)将有机相与水相混合之前或之后除去有机溶剂，形成分散均一的脂质体溶液，然后加入冻干保护剂。
(4)对步骤(3)所得的脂质体溶液用0.22 μ m的滤膜过滤3_5次，加入适量的冻干保护剂充分溶解，-80°C预冻24h，放入减压冷冻干燥机进行干燥48h后即得脂质体冻干粉。
8.根据权利要求7所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的抗氧剂可以步骤(I)后加入有机相中，也可以在步骤(2 )后加入水相中。
9.根据权利要求7所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂的加入方法可以步骤(2)后加入到水相中，也可以在步骤(3)后加入到制备好的脂质体溶液中。
10.根据权利要求7所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中除去有机溶剂，即可以在有机相和水相混合之前，也可以在机相和水相混合之后。
11.根据权利要求7所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的除去 有机溶剂方法有蒸发、冷冻干燥、超声超声波。
12.根据权利要求7所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的冻干使用的方法包括冷冻干燥法和喷雾干燥法。
13.根据权利要求7所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的冻干使用的冻干保护剂包括有葡聚糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、甘氨酸、海藻糖、山梨醇、甘油、果糖、木糖醇、半乳糖中的一种或几种，用量为2-10g/100mL。
14.根据权利要求7所述的一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂可以在制备脂质体溶液时加入到水相中，也可以在冻干前加入到制备好的脂质体溶液中。
15.根据权利要求1-15所述的槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，其特征在于，所述的脂质体及其冻干粉为皮肤外用制剂，适宜用于抗氧化、抗炎、抗紫外辐射损伤、抗皮肤癌，对抗紫外线辐射引起的 水肿、红斑、色素沉着、炎症、免疫抑制。
全文摘要
一种槲皮素皮肤用脂质体及其冻干粉，属于医药技术领域，为解决槲皮素溶解性差，难以应用的问题，同时提高槲皮素对角质层的渗透量和渗透速度，并增强药物在表皮和真皮中的滞留量，更好地发挥药效。每100mL的脂质体溶液是由下列物质制备而成槲皮素0.01g-0.1g，两亲性脂质0.1g-1.2g，胆固醇0.025g-0.6g，表面活性剂0.05g-3g，抗氧剂0.001g-0.5g，其余为水性介质。该脂质体及其冻干粉为皮肤外用制剂，适宜用于抗氧化、抗炎、抗紫外辐射损伤、抗皮肤癌，对抗紫外线辐射引起的水肿、红斑、色素沉着、炎症、免疫抑制。
文档编号A61P37/04GK103070826SQ20121059010
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者史小军, 刘丹, 朱永原 申请人:清华大学深圳研究生院