Wnt系列衍生肽及其用途

Wnt系列衍生肽及其用途
【专利摘要】本发明涉及WNT系列衍生新肽及其用途。本发明的WNT衍生肽执行与天然的WNT蛋白质类似的功能，与天然WNT相比，稳定性非常优秀，且皮肤渗透度也非常优秀。因此，本发明的包含肽的组合物改善毛发生长及脱发防止，且具有抗老化功效，在治疗、预防和改善需要WNT蛋白质的活性的疾病或状态方面发挥功效。并且，本发明的肽的优秀的活性及稳定性能够非常有利地适用于医药、医药外品及化妆品。
【专利说明】WNT系列衍生肽及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及WNT系列衍生新肽及其用途。
【背景技术】
[0002]毛囊作为哺乳动物皮肤的独特的器官，是原始表皮的下部生长而向更深的皮肤层伸张的器官。在毛囊的基部有被认为嗉囊或真皮乳头细胞的细胞塞(Stenn andPaus, Physiol.Rev., 81:449 (2002)),乳头为毛囊的正常循环(Oliver, Embryol.Exp.Morph.15:331 (1966))及毛干的生长中必不可少的。毛干为用角蛋白丝和丝凝集蛋白质填充的由结实地紧贴的上皮细胞制成的胎面形状的结构。
[0003]人类的毛发周期性地反复生长期、退行期、休止期，并经过毛发脱落且再次生成的过程。通过调节激素或很多生长因子等，来周期性调节毛发。另一方面，也会因严重的压力或营养不良等导入经过早期退行期的休止期，由此引起严重的脱发症状(Arck，AmericanJournal of Pathology, 162 (3):803 (2003)。就男性型秃发而言，头皮的前面及上部的毛囊对于雄性激素有感受性。因此，像男性型秃发，与毛囊的破坏相比更相当于毛囊的小型化，其原因在于，分泌过多的作为男性激素的雄性激素，使得5-α还原酶活化，进一步使睾丸素(testosterone)变形为二氢睾酮(DHT, dihydrotestosterone),由此生成的二氢睾酮缩短毛发生长的期间，并使毛囊小型化，来减少既粗又结实的终毛(terminal hair)的数量，由此引发脱发。并且，推断脱发女性的20%在她们一生当中常经历以头皮上部的毛发变薄为特征的几种脱发。随着年龄变大脱发的扩散也变大。例如，疤痕脱发症、与烧伤或压迫伤害相关的疤痕形成状态等不同的疾病状态可引起显著的脱发。与原因无关地，在现代社会，随着活跃的女性越来越多，男性也开始关注外貌，脱发最终可引起自尊心和自豪感的丧失并引起产生显著的精神、社会及性别影响的结果。为了治疗这种脱发现象，目前为止，将多种物质等用作医药品，但存在价格太贵、且引发多种副作用的问题。并且，这种医药品存在需要持续使用，且当停止使用时再次`引发脱发的缺点。并且，存在对功效的每个人的差异严重，副作用也根据不同的人而不同的缺点。
[0004]此外，用作化妆品的原料虽然具有价格低廉的优点，但因为由植物提取物衍生成分组成，所以存在实际功效不大的缺点。
[0005]因此，在该领域中，需要效果更好、且在费用方面更经济的新的有效成分。
[0006]目前为止已知的两种可利用的药物(米诺地尔及非那雄胺)可延迟追加的脱发，但不能产生实际上诱导新毛囊的再生的效果。并且，在很多头发化妆品中，推出了利用植物提取物等的很多防脱发产品，尤其开发了含有苦参、辣椒、当药、桑白皮、桑叶、人参、甘草、芍药、地黄、茴香、山茱萸、大蒜等的提取物的产品、添加含有黄嘌呤及生长激素的组合物，来改善二氢睾酮过剩引起的细胞代谢抑制，并利用生长激素的生长促进效果来产生防脱发及通过毛发再生的毛发生长促进效果的产品、含有矿物质、维生素类、绿茶、迷迭香、艾草、甘草提取液，通过向头皮和毛发供给营养来呈现防脱发及毛发生长促进效果的产品、以及将维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、烟酸、泛酸、生物素及叶酸等物质与植物提取物进行混合，来抑制体内的5-a还原酶，在男性激素的代谢过程中不使二氢睾酮产生，帮助毛发的新陈代谢作用，有助于男性型脱发的改善的产品，但很难找到影响至新生毛发的生成的产品。另一方面，也由日本的东京慈惠会医科大学健康医学中心研究组临床组开发了利用已知的对糖尿等产生功效的科罗索酸(corosolic acid)的产品来抑制体内的5_ a还原酶，也开发了对毛发生长产生卓越的功效的产品。
[0007]在毛发生长和退化的过程中，非常多的因素相互联系，本研究人执行了在毛根生成中最重要的用于促进毛发的角质细胞的增殖，且诱导向毛发分化的研究以及利用供给毛发周围的营养成分且促进血管内皮生长因子的活性的一系列的生长因子的研究。
[0008]尤其，在建议毛发的周期的多种生长因子中，人类衍生WNT通过在细胞中传递信号来影响毛发，而这种WNT的信号传递途径借助分泌的WNT与作为它们的受体的弯曲(frizzled)的蛋白质之间的相互作用来活化,此时,作为低密度脂蛋白(LDL, low-densitylipoprotein)受体-相关蛋白质的LRP5及LRP6起到辅助受体(co-receptor)的作用。WNT的信号传递的下游影响包括散乱(disheveled)的蛋白质的活化，在使Akt活化之后，以轴蛋白(Axin)-β -连环蛋白_GSK3 0 -复合体方式动员(Fukumoto et al., J.Biol.Chem.,276:17479-17483 (2001))。之后，GSK30被磷酸化及非活化，来抑制β-连环蛋白的磷酸化及分解。蓄积的β-连环蛋白向核移位，从而与淋巴样增强因子-T细胞因子(LEF-TCF, lymphoid enhancer factor-T cell factor)族的转录因子相互作用，来诱导革巴基因的转录。如此表达的蛋白质对毛发的生长和分化起到重要的作用，可生成新的母细胞。并且，通过降低雄性激素引起的二氢睾酮的功能来起到防止脱发的功能。
[0009]在本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。引用的论文及专利文献的所有公开内容作为参照插入于本说明书中，从而更加明确地说明本发明所属【技术领域】的水平及本发明的 内容。

【发明内容】

[0010]本发明人努力开发在生长因子中维持与WNT相同或类似的功能并与自然的WNT蛋白质相比，具有优秀的活性、皮肤渗透度及稳定性的物质，其结果，基于天然的WNT蛋白质的氨基酸序列合成了表示上述特性的多个WNT相关肽，从而完成了本发明。
[0011]因此，本发明的目的在于，提供一种肽，其由选自包含记载于序列表中序列1、序列
2、序列3及序列4的氨基酸序列的组中的一种氨基酸序列组成，用于表示WNT蛋白质的活性。
[0012]本发明的再一个目的在于，提供一种生发促进及毛发生成改善用组合物，其包含上述肽作为有效成分。
[0013]本发明的另一个目的在于，提供一种脱发防止改善用组合物，其包含上述肽作为有效成分。
[0014]本发明的还有一个目的在于,提供一种皮肤状态(skin conditions)改善用组合物，其包含上述肽作为有效成分。
[0015]本发明的又一个目的在于，提供一种WNT相关信号传递衰竭相关疾病的改善或治疗用组合物，其包含上述肽作为有效成分。
[0016]本发明的又一个目的在于，提供一种作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的治疗用组合物，其包含上述肽作为有效成分。
[0017]以下的
【发明内容】
、发明要求保护范围以及附图使本发明的其他目的以及优点更加明确。
[0018]根据本发明的一实施方式,提供一种肽,其由选自包含记载于序列表中序列1、序列2、序列3及序列4的氨基酸序列的组中的一种氨基酸序列组成，用于表示WNT蛋白质的活性。
[0019]本发明人努力开发在生长因子中维持与WNT蛋白质相同或类似的功能的同时与天然WNT蛋白质相比，具有优秀的活性、皮肤渗透度及稳定性的物质，其结果，基于天然的WNT蛋白质的氨基酸序列合成了表示上述特性的多个生长因子相关肽。
[0020]本发明的肽衍生于人类WNT蛋白质，包含选自包含WNT系列衍生的序列表中序列I (肽I)至序列4 (肽4)的氨基酸序列的组中的氨基酸序列。优选地，本发明中的肽必须由选自包含序列表中序列I至序列表中序列4的氨基酸序列的组中的氨基酸序列组成。在本说明书中，术语“肽”意味着通过肽键来使氨基酸残基相互结合而形成的线性的分子。
[0021]本发明的肽可根据该领域公知的化学合成方法，尤其根据固相合成技术(solid-phase synthesis techniques) 来制 成(Merrifield, J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963) ;Stewart,et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd.ed., Pierce Chem.C0.:Rockford, 111 (1984))。
[0022]就本发明的肽而言，随机地将WNT蛋白质的多个部位进行部分合成来第一次探索对受体蛋白质的结合功能部位之后，将这个预测部位的氨基酸序列最佳化来选定并制成本发明的肽，并通过 筛选这些候补肽中活性最优秀的肽来提供本发明的肽。
[0023]序列表中序列I肽(肽-1)、序列2肽(肽-2)、序列3肽(肽_3)及序列4肽(肽_4)执行与天然WNT蛋白质类似的作用。这是与受体相结合来执行如生长因子等功能的肽。
[0024]本发明的肽其本身与天然的WNT蛋白质相比，稳定性非常优秀。
[0025]根据本发明的优选实施例，上述肽的N-末端结合有保护基，上述保护基选自包含乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蘧基、硬脂酰基及聚乙二醇(PEG，polyethylene glycol)的组。
[0026]上述氨基酸的变形起到大大改善本发明的肽的稳定性的作用。在本说明书中，术语“稳定性”不仅意味着“体内”稳定性，还意味着储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述保护基起到保护本发明的肽使其不受生物体内的蛋白质切割酶攻击的作用。
[0027]根据本发明的再一个实施方式，提供一种生发促进及毛发生成改善用组合物，其包含本发明的肽作为有效成分。
[0028]根据本发明的另一个实施方式，提供一种生发促进及毛发生成改善方法，其方法包括将本发明的肽处理给对象(subject)的步骤。
[0029]根据本发明的还有一个实施方式，本发明提供一种肽的用途，用于制备生发促进及毛发生成改善用医药品(medicaments)。
[0030]由于本发明的组合物包含上述本发明的生长因子相关肽作为有效成分，因而为了避免本说明书过于复杂，省略两者之间共同内容的记载。
[0031]如以下的实施例中所证明，可见，本发明的生长因子相关肽序列具有成纤维细胞、角质细胞或毛囊细胞生长促进能力，并且，随着作为WNT蛋白质的代表性信号传导的β -连环蛋白信号传导。并且，可见，即使存在WNT的抑制剂即DKK-1，也保持不变地传递WNT的信号。可见，作为WNT的靶基因的纤连蛋白的表达也通过肽增加，即使存在DKK-1，纤连蛋白的表达量也增加。这通过动物实验执行将毛发的生长促进得非常高的功能。
[0032]根据本发明的又一个实施方式，提供一种脱发防止改善用组合物，其包含本发明的肽作为有效成分。
[0033]根据本发明的又一个实施方式，提供一种脱发防止改善方法，其包括将本发明的肽处理给对象(subject)的步骤。
[0034]根据本发明的又一个实施方式，本发明提供一种肽的用途，用于制备脱发防止改
善用医药品。
[0035]本发明的肽能够诱导位于可使毛根生成的皮肤组织的毛囊(hair follicle)的干细胞的增殖，并以向毛根移动的方式诱导分化来生成新的毛囊。进而，即使存在由二氢睾酮诱导的DKK-1 (Dickkopf-1)脱发基因，来抑制WNT功能的状况下，肽也使WNT-β -连环蛋白(beta-catenin)的信号传导活化来表达生发促进基因。并且，肽起到促进作为毛发生成和生长时期的生长期的作用，并将由于多种环境因素而进入退行期的毛发的周期维持在生长期，来呈现脱发抑制效果，在正常毛发中，不仅是毛发生长，还是向毛发供给营养成分，对健康的毛发产生大的影响。因此，本发明的组合物对毛发的生长及皮肤状态的改善非常有效。
[0036]根据本发明的又一个实施方式,提供一种皮肤状态(skin conditions)改善用组合物，其包含本发明的肽作为有效成分。
[0037]根据本发明的又一个实施方式,提供一种皮肤状态(skin conditions)改善方法，其方法包括将本发明的肽处理给对象(subject)的步骤。
[0038]根据本发明的又一个实施方式`，提供一种肽的用途，用于制备皮肤状态(skinconditions)改善用医药品(medicament)。
[0039]根据本发明的优选实施例，优选地，本发明的组合物用于皮肤状态的改善，上述皮肤状态的改善包括皱纹改善、皮肤弹性改善、皮肤老化防止、皮肤保湿改善、伤口消除或皮肤再生。
[0040]根据本发明的又一个实施方式，提供一种基于WNT相关信号传递的衰竭的多种疾病的预防或治疗用组合物，包含上述本发明的肽作为有效成分。
[0041]根据本发明的又一个实施方式，提供一种WNT相关信号传递衰竭相关疾病的预防或治疗方法，其方法包括将本发明的肽处理给对象(subject)的步骤。
[0042]根据本发明的又一个实施方式，本发明提供一种肽的用途，用于制备WNT相关信号传递衰竭相关疾病的预防或治疗用医药品(medicament)。
[0043]根据本发明的优选实施例，本发明的组合物优选地用于包括骨疾病、骨发生疾病、骨折、老年性骨质疏松、软骨营养不良、高钙血症、骨质增生、成骨不全症、骨软化症、骨髓炎、骨质疏松症、佩吉特氏病、骨关节炎、佝偻病或肥胖的WNT相关信号传递的衰竭相关疾病的预防或治疗，更优选为骨质疏松症、骨疾病或肥胖。
[0044]根据本发明的又一个实施方式，提供一种作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗用组合物，其包含本发明的肽作为有效成分。
[0045]根据本发明的又一个实施方式，提供一种作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗方法，其方法包括将本发明的肽处理给对象(subject)的步骤。
[0046]根据本发明的又一个实施方式，本发明提供一种肽的用途，用于制备作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗用医药品(medicament)。
[0047]根据本发明的优选实施例，就本发明的组合物而言，优选地，DKK-1蛋白质相关疾病用于包括胰岛素抵抗、低胰岛素血症、高胰岛素血症、糖尿病或肥胖的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗。
[0048]本发明的组合物可用作包含(a)本发明的上述生长因子相关肽的药剂学有效量；以及(b)药剂学上接受的载体的药剂学组合物。
[0049]在本说明书中，术语“药剂学有效量”意味着充分达成上述生长因子相关肽的功效或活性的量。
[0050]包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体是在制剂时通常利用的，其包含乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯胶(acacia gum)、磷酸|丐(calcium phosphate)、藻酸盐(alginate)、明胶(gelatin)、娃酸?丐(calcium silicate)、微晶纤维素(microcrystallinecellulose)、聚乙烯批咯烧酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖衆(syrup)、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)>羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸续(magnesium stearate)及矿物油(mineral oil)等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。
[0051]优选地，以非口服的方式将本发明的药剂学组合物进行给药，例如，可通过皮肤局部给药来进行给药。
[0052]本发明的药剂学组合物的适当的给药量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等因素而不同，普通熟练的医生可容易地决定对所需的治疗或预防有效的给药量，并开处方。根据本发明的优选实施例，本发明的药剂学组合物的I天的给药量为0.001~1000 mg / kg。
[0053]本发明的药剂学组合物可根据本发明所属【技术领域】的普通技术人员容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂进行制剂化，由此制备为单位容量形态，或者装入至大容量容器内而制备。此时，剂型可以是油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂或凝胶(例如，水凝胶)形态，还可包含分散剂或稳定剂。
[0054]并且，本发明的组合物可用作包含(a)本发明的上述生长因子相关肽的化妆品学有效量(cosmetically effective amount);以及(b)化妆品学上接受的载体的化妆品组合物。
[0055]在本说明文中，术语“化妆品学有效量”意味着充分达成上述本发明的组合物的功效的量。
[0056]本发明的化妆品组合物也能够以在该领域中通常所制备的任何剂型制成，例如，能够以溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、皂、含有表面活性剂清洁剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡粉底及喷雾剂等剂型化，但并不局限于此。更详细地，能够以柔肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、卸妆水、面膜、喷雾剂或粉的剂型制备。
[0057]本发明的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，作为载体成分，可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧
化锌等。
[0058]本发明的剂型为粉或喷雾剂的情况下，作为载体成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，尤其喷雾剂的情况下，还可包含氯氟烃、丙烷/ 丁烷或二甲醚等推进剂。
[0059]本发明的剂型为溶液或乳浊液的情况下，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳浊剂，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3- 丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐的脂肪酸酯。
[0060]本发明的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分，可利用水、乙醇或丙二醇等液状稀释剂、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯等悬浮剂、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或胺黄树胶等。
[0061]本发明的剂型为含有表面活性剂的卸妆油的情况下，作为载体成分，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
[0062]包含在本发明的化妆品组合物的成分除了作为有效成分的肽类和载体成分之外包含通常用于化妆品组合物的成分，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等常规的助剂。
[0063]归纳本发明的特征 及优点如下:
[0064]( i )本发明的WNT相关肽可起到与天然的WNT蛋白质相同或类似的功能。
[0065](ii)本发明的肽与天然的WNT蛋白质相比，稳定性非常优秀，且皮肤渗透度也非常优秀。
[0066](iii)因此，本发明的包含肽的组合物对毛发的生长及生成具有活性，且在治疗、预防或改善需要生长因子的活性的疾病或状态方面发挥非常优秀的功效。
[0067](iv)本发明的上述肽的优秀的活性及稳定性可非常有利地适用于医药、医药外品及化妆品。
【专利附图】

【附图说明】
[0068]图1为表示通过本发明的合成例制成的序列表中序列I (肽-1)至序列4 (肽-4)的肽的高效液相色谱法分析结果的图表。
[0069]图2a为表示处理通过本发明的合成例制成的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽_2、序列
3;肽_3、序列4 ;肽-4)的角质细胞的细胞生长促进效果的图表。
[0070]图2b为处理通过本发明的合成例制成的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ；肽_3、序列4 ;肽-4)的成纤维细胞的细胞生长促进效果的图表。
[0071]图2c为处理通过本发明的合成例制成的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ；肽_3、序列4 ;肽-4)的毛囊细胞的细胞生长促进效果的图表。
[0072]图3a为用显微镜确认处理本发明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽_2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽-4)的角质细胞的细胞生长促进效果的照片。
[0073]图3b为用显微镜确认处理本发明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽_4)的成纤维细胞的细胞生长促进效果的照片。
[0074]图3c为用显微镜确认处理本发明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽-4)的毛囊细胞的细胞生长促进效果的照片。
[0075]图4为确认作为基于本发明的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽-4)的受体的LRP5的磷酸化增加的数据。
[0076]图5a为确认本发明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽_2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽_4)使β_连环蛋白的活性增加的数据。
[0077]图5b为即使存在作为WNT抑制剂的DKK-1及脱发基因，借助本发明的肽(序列I ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽-4)活化的β -连环蛋白也显示表达量的免疫印迹法数据。
[0078]图6为表示作为基于本发明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列
4;肽-4)的转录因子的LEF-1的活性的数据。
[0079]图7a为示出随着本发明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽_2、序列3 ;肽_3、序列4 ；肽-4)的处理时间的纤连蛋白的表达增加的图表。
[0080]图7b为示出即使存在DKK-1即WNT抑制剂及脱发基因，本发明的肽(序列I ;肽_1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽-3、序列4 ;肽-4)使纤连蛋白的表达增加的图表。
[0081]图7c为示出当将本发明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列4 ；肽-4)处理给细胞时，通过免疫染色化学法使肽存在于细胞的照片。
[0082]图8为处理本发明的肽(序列1 ;肽-1、序列2 ;肽-2、序列3 ;肽_3、序列4 ;肽_4)的小鼠等皮肤的毛发生长效果。
【具体实施方式】
[0083]实施例
[0084]以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，本发明的范围并不根据本发明的要旨而受这些实施例的限制，这对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说是显而易见的。
[0085]实施例
[0086]合成例1 =Leu-Cys-Cys-Gly-Arg-Gly-His-Arg-Thr-Arg-Thr-Gln-Arg (序列表)的合成[0087]将700mg 的氯三苯甲基氯树脂(Chloro trityl chloride resin ；CTL resin,Nova biochem Cat N0.01-64-0021)放入反应容器，并添加IOml的亚甲基氯(MC,methylene chloride)来搅拌3分钟。除去溶液，并放入IOml的二甲基甲酰胺(DMF,Dimethyl Formamide)来搅拌3分钟之后,再次除去溶剂。向反应器放入IOml的二氯甲烧(DCM, Dichloromethane)溶液，并放入 200mmole 的荷甲氧擬基-Ala (pbf) -OH (Fmoc-Ala(pbf ) -0H)(巴亨公司(Bachem),瑞士(Swiss))及 400mmole 的 N,N- 二异丙基乙胺(DIEA,N, N-Diisopropylethylamine)之后进行搅拌使它们均匀溶解,再搅拌I小时并进行反应。反应后进行清洗，将甲醇和DIEA (2:1)溶解在DCM进行10分钟反应，并用过量的DCM/DMF(1:1)进行清洗。除去溶液,并放入IOml的DMF搅拌3分钟之后，再次除去溶剂。将IOml的脱保护溶液(20%的哌啶(Piperidine) /DMF)放入反应容器，在常温下搅拌10分钟之后除去溶液。放入相同量的脱保护溶液，再维持10分钟的反应之后去除溶液，并分别隔3分钟用DMF清洗2次，用MC清洗I次，并用DMF清洗I次，来制备了 Arg (pbf)-氯三苯甲基氯树脂(Ala(pbf )-CTL Resin)。向新的反应器放入IOml的DMF溶液,并放入200mmole的荷甲氧擬基 _ Y _ 三苯甲基-L-谷氨酸胺(Fmoc-Gln (trt)-OH) (Bachem, Swiss)、200mmole 的羟基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑_1_基氧基三(二甲基氨基)磷鐵六氟磷酸盐(Bop)之后进行搅拌来使它们均匀溶解。以分馏的方式向反应器分两次放入400mmole的N,N- 二异丙基乙胺(DIEA,N,N_Diisopropylethylamine)2次之后,最小限度地搅拌5分钟，直到所有固体溶解为止。将溶解的氨基酸混合溶液放入有脱保护的树脂的反应容器，并在常温下搅拌I小时并进行反应。除去反应液，用DMF溶液隔5分钟搅拌3次之后进行除去。取出少量的反应树脂，并利用却三酮试验(Nihydrin test)检查反应程度。与上述方法相同地，用脱保护溶液进行2次脱保护反应，来制备了甘氨酸(trt)-Arg (pbf)-氯三苯甲基氯树脂(Gin (trt)-Arg (pbf)-CTL Resin)。用DMF和MC充分清洗，再次执行一次茚三酮试验之后，与上述方法相同地，执行了以下的氨基酸附着实验。通过选定的氨基酸序列，以 Fmoc-Thr (tBu)、Fmoc-Arg (pbf)、Fmoc-Thr (tBu)、Fmoc-Arg (pbf)、Fmoc-His (trt)及 Fmoc-Gly、Fmoc-Arg (pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys> Fmoc-Cys 及 Fmoc-Leu 顺序进行了链式反应。用脱保护溶液使Fmoc-保护基隔10分钟反应2次之后，通过均匀清洗来进行除去。放入乙酸酐和DIEA、羟基苯并三唑(HoBt, Hydroxybenzotriazole)执行I小时乙酰化之后，用DMF、MC及甲醇分别将制成的肽基树脂清洗3次，慢慢将氮空气流出来进行干燥之后，在五氧化二磷(P2O5, Phosphorus pentoxide)条件下用真空进行减压,等完全干燥之后，放入30ml的泄漏溶液[三氟乙酸(TFA，Trifluroacetic acid)95%、蒸馏水2.5%、茴香硫醚(Thioanisole)2.5% ]之后，在常温下偶尔摇晃，并维持2小时反应。对树脂进行过滤，并用少量的溶液清洗树脂之后将其与母液合起来。利用减压来蒸馏，使得整体容积剩一半左右，并添加50ml的凉的醚诱导沉淀之后，进行离心分离来收集沉淀，并用更凉的醚清洗2次。除去母液，并在氮条件下充分干燥，提纯之前合成了 0.65g的Leu-Cys-Cys-Gly-Arg-GIy-His-Arg-Thr-Arg-Thr-Gln-Arg肽I (收率:92.6% )。当利用分子量测定仪来测定时，可获得分子量1543.8 (理论值:1543.81)。利用如上所述的方法，还合成了序列2肽、序列3及序列4肽(图1)。
[0088]表1
[0089]
【权利要求】
1.一种肽，其特征在于，由选自包含记载于序列表中序列1、序列2、序列3及序列4的氨基酸序列的组中的一种氨基酸序列组成，用于表示WNT蛋白质的活性。
2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽的N-末端结合有保护基，上述保护基选自包含乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蘧基、硬脂酰基及聚乙二醇的组。
3.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽衍生于人类WNT蛋白质。
4.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽具有成纤维细胞、角质细胞或毛囊细胞的生长促进功能。
5.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽促进β连环蛋白信号传导。
6.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽即使存在干涉脱发的DKK-1蛋白质，也促进β_连环蛋白信号传导。
7.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽用于促进纤连蛋白的表达，上述纤连蛋白为WNT的靶蛋白，即为毛发生长重要的蛋白质。
8.—种生发促进及毛发生成改善用组合物，其特征在于，包含上述权利要求1至7中任一项所述的肽作为有效成分。
9.一种脱发防止改善用组合物，其特征在于，包含上述权利要求1至7中任一项所述的肽作为有效成分。
10.一种皮肤状态改善用组合物，其特征在于，包含上述权利要求1至7中任一项所述的肽作为有效成分。`
11.根据权利要求10所述的皮肤状态改善用组合物，其特征在于，上述皮肤状态的改善为皱纹改善、皮肤弹性改善、皮肤老化防止、皮肤保湿改善、伤口消除或皮肤再生。
12.—种WNT相关信号传递衰竭相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含上述权利要求1至7中任一项所述的肽作为有效成分。
13.根据权利要求12所述的WNT相关信号传递衰竭相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，上述WNT相关信号传递衰竭相关疾病为骨质疏松症、骨疾病或肥胖。
14.一种作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含上述权利要求1至7中任一项所述的肽作为有效成分。
15.根据权利要求14所述的作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，上述DKK-1蛋白质相关疾病为胰岛素抵抗、低胰岛素血症、高胰岛素血症、糖尿病或肥胖。
16.一种生发促进及毛发生成改善方法，其特征在于，包括将上述权利要求1至7中任一项所述的肽处理给对象的步骤。
17.一种脱发防止改善方法，其特征在于，包括将上述权利要求1至7中任一项所述的肽处理给对象的步骤。
18.一种皮肤状态改善方法，其特征在于，包括将上述权利要求1至7中任一项所述的肽处理给对象的步骤。
19.根据权利要求18所述的皮肤状态改善方法，其特征在于，上述皮肤状态的改善为皱纹改善、皮肤弹性改善、皮肤老化防止、皮肤保湿改善、伤口消除或皮肤再生。
20.一种WNT相关信号传递衰竭相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将上述权利要求1至7中任一项所述的肽处理给对象的步骤。
21.根据权利要求20所述的WNT相关信号传递衰竭相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于，上述WNT相关信号传递衰竭相关疾病为骨质疏松症、骨疾病或肥胖。
22.—种作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将上述权利要求1至7中任一项所述的肽处理给对象的步骤。
23.根据权利要求22所述的作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于，上述DKK-1蛋白质相关疾病为胰岛素抵抗、低胰岛素血症、高胰岛素血症、糖尿病或肥胖。
24.一种上述权利要求1至7中任一项所述的肽的用途，其特征在于，用于制备生发促进及毛发生成改善用医药品。
25.—种上述权利要求1至7中任一项所述的肽的用途，其特征在于，用于制备脱发防止改善用医药品。
26.—种上述权利要求1至7中任一项所述的肽的用途，其特征在于，用于制备皮肤状态改善用医药品。
27.根据权利要求26所述的肽的用途，其特征在于，上述皮肤状态的改善为皱纹改善、皮肤弹性改善、皮肤老化防止、皮肤保湿改善、伤口消除或皮肤再生。
28.—种上述权利要求1至7中任一项所述的肽的用途，其特征在于，用于制备WNT相关信号传递衰竭相关疾病的预防或治疗用医药品。
29.根据权利要求28所述的肽的用途，其特征在于，上述WNT相关信号传递衰竭相关疾病为骨质疏松症、骨疾病或肥胖。`
30.一种上述权利要求1至7中任一项所述的肽的用途，其特征在于，用于制备作为WNT拮抗剂的DKK-1蛋白质相关疾病的预防或治疗用医药品。
31.根据权利要求30所述的肽的用途，其特征在于，上述DKK-1蛋白质相关疾病为胰岛素抵抗、低胰岛素血症、高胰岛素血症、糖尿病或肥胖。
【文档编号】A61K38/18GK103781799SQ201280038648
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年5月9日 优先权日:2011年8月4日
【发明者】郑熔池, 金银美 申请人:凯尔格恩有限公司