组成型活性uPAR变体及其在抑制性抗体的生成与分离中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的变体，所述变体显示显著增加的玻连蛋白(VN)结合活性，这可能因VN结合位点的更有效暴露所致。本发明还涉及针对所述uPAR变体产生的抗体，其能够结合uPAR的VN结合位点，然后作为uPAR功能抑制剂起作用，作为VN活化的uPAR功能的功能拮抗剂起作用。在本发明中，此类抗体是单克隆、多克隆抗体，其合成或重组衍生物，如来自噬菌体展示文库的合成抗体(scFv)。本发明的抗体作为竞争性拮抗剂起作用。
【专利说明】组成型活性uPAR变体及其在抑制性抗体的生成与分离中的应用
【背景技术】
[0001 ] 尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR，也称为⑶87)是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着子固定在质膜上的膜糖蛋白。所述尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在生理学过程(例如伤口愈合、炎症和干细胞动员)以及严重病理学病症(例如HIV-1感染、肿瘤侵入和转移)中起重要作用。所述尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)是在炎症过程中和几乎所有人类癌症中过表达的质膜受体。uPAR在肿瘤细胞粘附、迁移、侵入和增殖中的重要作用使该受体成为癌症治疗中吸引人的药物靶点。就抑制肿瘤生长而言，已经或正在开发抑制uPA系统的若干治疗方案。uPAR除在调节细胞外周蛋白水解中的明确的作用以外，其还通过与胞外基质中存在的蛋白质(包括玻连蛋白(VN))相互作用来调节细胞的粘附、迁移和增殖。
[0002]尽管充分记录了与VN相互作用的重要性(Madsen等，2007 ；Smith等，2008)，该相互作用对uPAR的信号转导活性至关重要，但该相互作用在体内的重要性仍未经阐明。
[0003]定向VN相互作用是必要的，并且足以引发uPAR诱导的细胞形态、迁移以及定向侧接蛋白-蛋白相互作用的独立信号传导的变化。uPAR和VN之间的单独相互作用可能是由uPAR引发的多种蛋白质水解非依赖性生物作用的原因。开发所述uPAR/玻连蛋白相互作用的抑制剂是另一 个吸引人的靶标，并且可从玻连蛋白的结合uPAR的生长调节素B结构域开始，其为天然且有力的uPAR/玻连蛋白相互作用拮抗剂。
[0004]有数个国际申请公开了尿激酶受体的肽配体，例如W001/17544。
[0005]W097/35969公开了能够结合uPAR并抑制整联蛋白与玻连蛋白结合的肽。该文献并未提及uPA结合。所述文献中没有确定所述肽在uPAR中的结合位点，并且没有关于所述肽的功能阻断活性的数据。
[0006]W02008/073312涉及尿激酶型纤溶酶原激活物受体表位和由其衍生的单克隆抗体。该文献公开了对尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)具有特异性的抗体及其抗原结合片段、以及它们在癌症治疗或预防中的用途。具体地，所述公开的抗体对uPAR上的特定表位具有特异性。W02008/073312中描述的抗体识别的表位与本发明所述那些不重叠。
[0007]Rabbani SA 等(Neoplasia(2010) 12，778-788)测试了给予单克隆抗 uPAR 抗体(ATN-658)对体外和体内前列腺癌发展的影响。ATN-658(小鼠IgGl)能够以高亲和性结合uPAR的D2D3 (Kd约为InM)，不抑制uPA与uPAR的结合，并且甚至能够与结合了 uPA的uPAR结合。本研究中使用的抗体(ATN-658)在W02008/073312中有所描述。由ATN-658抗体识别的表位与本发明描述的那些不重叠。所述ATN-658抗体不是uPAR/玻连蛋白相互作用的竞争性拮抗剂，因为它不与uPAR中的玻连蛋白结合位点结合。uPAR中与所述ATN-658抗体结合的表位和另一种透彻研究的单克隆抗体R2相似或相同(Sidenius等.JBC (2002) 27727982-90)。ATN-658与完整的uPAR和截短的D2D3受体的结合性一样好。因此，其中所述的抗体不与完整uPAR优先结合。
[0008]W02005/116077鉴定了对二元uPA_uPAR复合物、对含uPA_uPAR的三元复合物以及对uPAR与除uPA以外的蛋白质(例如整联蛋白)的复合物具有特异性的抗体或其它配体。这些抗体抑制uPA和uPAR的复合物与其它分子间的相互作用。此类抗体或其它配体被用在诊断和治疗方法，特别是抗癌的诊断和治疗方法中。所述文献涉及不抑制玻连蛋白结合但抑制玻连蛋白成分组装的配体；此外，它们识别的表位与本文所述那些不重叠。
[0009]W02006/094828公开了优先识别uPAR受体的截短形式和可溶形式(D2D3)的抗体。其中所述的抗体不优先结合完整uPAR。
[0010]CN101050237公开了能够阻断uPA和uPAR之间相互作用的化合物及其应用。所述化合物包括uPA的ATF、ATF片段、uPAR片段、抗ATF抗体和抗uPAR抗体。所述化合物可阻断uPA和uPAR之间的相互作用，并且可用于制备预防和治疗动脉粥样硬化所用的药物。
[0011]Tressler RJ 等人(APMIS.1999 年 I 月；107 (I): 168-73)公开了基于人和鼠尿激酶的生长因子结构域的尿激酶受体拮抗剂。此类拮抗剂显示对它们的同源受体具有亚纳摩尔级亲和力。通过制备与人IgG恒定区的融合体来进一步修饰这些分子，导致具有高亲和性和体内长半衰期的分子。通过噬菌体展示和肽类似物合成的组合已获得较小的肽抑制剂。所有这些分子抑制uPA的生长因子结构域与uPA受体的结合并且增强uPA受体与玻连蛋白的结合。
[0012]Gardsvoll H 等，(J Biol Chem, 2011 年 9 月 23 日；286 (38): 33544-56)提出一种使uPA和玻连蛋白 协作以加强在玻连蛋白基质上的uPAR依赖性板状伪足引入的模型；这就暗示着靶向uPAR功能的药物开发，即，表位定位的单克隆抗体。该研究中被研究的抗体都不阻断玻连蛋白在uPA的存在下结合uPAR。
[0013]因此，需要 优先结合完整uPAR的抗体以作为uPAR功能的有力抑制剂。
【发明内容】
[0014]本发明涉及所述尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的独特变体，其显示显著增加的玻连蛋白(VN)结合活性(表观Kd增加>10.000倍)，这可能是因更有效地暴露了VN结合位点所致。
[0015]作者表示，针对所述uPAR变体产生的单克隆抗体是uPAR功能的有力抑制剂。抗体结合表位作图显示，这些抗体与uPAR的VN结合位点结合，这将它们分类为竞争性拮抗剂。
[0016]作者还显示使用上述uPAR变体从曬菌体展示库分离合成的抗体(scFv)是uPAR的功能抑制剂。所述受抑制的功能是:细胞粘附(图11)和因而的细胞迁移和细胞增殖(其为与细胞粘附相关的下游事件)。这些功能是VN依赖性的。
[0017]发明详述
[0018]本发明的目的是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体分子，其相比野生型分子具有增强的VN结合活性。
[0019]本发明的uPAR变体分子优选包含与以下部分连接的野生型uPAR氨基酸序列:
[0020]a)连接于所述野生型uPAR序列的N末端的uPA的生长因子样结构域(GFD)序列，和/或
[0021]b)连接于所述野生型uPAR序列的C末端的抗体分子的Fe区域的链，
[0022]其中，如果Fe区域的所述链存在，则所述uPAR变体分子是二聚体。
[0023]就“野生型uPAR氨基酸序列”而言，其意在指保持VN结合活性的全长野生型蛋白质或其片段的序列。
[0024]在一个优选实施方式中，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID N0:1的成熟huPAR的氨基酸32-92组成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸32-93组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
[0025]更优选地，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸3-271组成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸3-270组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
[0026]甚至更优选地，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸1-277组成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸1-273组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。[0027]在本发明另一个优选实施方式中，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2组成的序列，或由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽或其功能突变体或衍生物或类似物。
[0028]在本发明中，uPA的GFD序列优选包含基本由SEQ ID NO: 3的人uPA的GFD的氨基酸11-42组成的序列，或基本由SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD的氨基酸12-43组成的序列，或来自GDF直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
[0029]在本发明的uPAR变体分子中，uPA的GFD序列优选基本以下物质序列组成:SEQID NO: 3的人uPA的GFD序列，或SEQ ID NO: 4的小鼠uPA的GFD序列，或来自GFD直系同源基因的对应区域编码的多肽或其功能突变体或衍生物或类似物。
[0030]在本发明中，所述Fe区域的链优选是人源性并且包含基本由SEQ ID N0:5组成的序列，或所述Fe区域的链优选是小鼠源性并且包含基本由SEQ ID N0:6组成的序列或来自Fe区域的链直系同源基因的对应区域编码的多肽或其功能突变体或衍生物或类似物。
[0031]在本发明的uPAR变体分子中，所述Fe区域的人链(human chain)优选基本由SEQID NO: 5组成，或者所述小鼠Fe区域优选由SEQ ID NO: 6组成，或由来自Fe区域人链的直系同源基因的对应区域编码的多肽组成，或其功能突变体或衍生物或类似物。
[0032]在一个优选实施方式中，本发明的uPAR变体分子还包含:
[0033]a)在uPA的GFD序列和野生型uPAR序列的N末端之间的第一接头区域,和/或
[0034]b)在抗体分子Fe区域的链和野生型uPAR序列的C末端之间的第二接头区域。
[0035]优选地，所述第一接头区域基本由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的序列组成。
[0036]所述第二接头区域优选基本由SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10或SEQ ID N0:11的序列组成。
[0037]在一个优选实施方式中，所述uPAR变体分子包含的序列基本具有SEQ ID NO: 12、
13、14、15、16 或 17 的序列。
[0038]本发明的另一个目的是本发明的uPAR变体分子作为抗原在获得具有uPAR功能拮抗剂活性的特异性抗体中的应用，或在选择所述抗体的重组体或合成的抗原结合片段中的应用。
[0039]本发明的另一个目的是能够结合上述尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段优选具有uPAR功能拮抗剂活性。
[0040]所述抗体可用于人类治疗应用。所述抗体通常是完全人抗体，或嵌合或人源化的，以在给予患者时使针对所述抗体的免疫应答的风险最小化。如本文所述，可从此类抗体设计或衍生出其它抗原结合分子，例如，抗原结合抗体片段、抗体衍生物和多特异性分子。
[0041]此类抗体的抗体结合片段，以及包含此类抗原结合片段的分子，包括工程改造的抗体片段、抗体衍生物、双特异性抗体和其它多特异性分子等，也是本发明的目的。[0042]在一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段能够结合uPAR分子的表位，所述表位包含R89、R91和Y92氨基酸残基中的至少一种。
[0043]优选地，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含如下至少一个重链互补决定区(⑶RH3)氨基酸序列，所述重链互补决定区(⑶RH3)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21或25的氨基酸90-102、SEQID NO:24以及SEQ ID NO:22或23的氨基酸90-101 ;和/或如下至少一个重链互补决定区(CDRH2)氨基酸序列，所述重链互补决定区(CDRH2)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21、24或25的氨基酸41-57 ;和/或如下至少一个重链互补决定区(CDRHl)氨基酸序列，所述重链互补决定区(CDRHl)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21或24的氨基酸22-26, SEQ ID NO: 25 的氨基酸 17-26。
[0044]优选地，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含如下至少一个轻链互补决定区(CDRL3)氨基酸序列，所述轻链互补决定区(CDRL3)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:65、66、67、68或69，和SEQ ID N0:74或85的氨基酸80-87 ;和/或如下至少一个轻链互补决定区(CDRL2)氨基酸序列，所述至少一个轻链互补决定区(⑶RL2)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQID N0:65、66、67、68和69的氨基酸41-47 ;和/或至少一个轻链互补决定区(CDRLl)氨基酸序列，所述轻链互补决定区(⑶RLl)氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO:65、66、67、68 和 69 的氨基酸 15-23。
[0045]在一个优选实施方式中，上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含与SEQID NO: 18、19、20、21或24的氨基酸22-26具有至少80%相同性的CDRHl氨基酸序列、分别与SEQ ID NO: 18、19、20、21或24的氨基酸41-57具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列，以及分别与SEQ ID NO: 18、19、20或21的氨基酸90-102或SEQ ID NO: 24的氨基酸90-101具有至少80%相同性的⑶RH3氨基酸序列。
[0046]在另一个优选实施方式中，上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含与SEQID NO: 25的氨基酸17-26具有至少80%相同性的CDRHl氨基酸序列、与SEQ ID NO: 25的氨基酸41-57具有至少80%相同性的⑶RH2氨基酸序列，以及与SEQ ID NO: 25的氨基酸90-102具有至少80%相同性的⑶RH3氨基酸序列。
[0047]在又一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段还包含与SEQ ID N0:65、66、67、68或69的氨基酸15-23具有至少80%相同性的CDRLl氨基酸序列、分别与SEQ ID N0:65、66、67、68或69的氨基酸41-47具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，和分别与SEQ ID NO:65、66、67、68或69的氨基酸80-87具有至少80%相同性的⑶RL3氨基酸序列。
[0048]在又一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段还包含:与SEQ ID N0.18、19、20、21或24的氨基酸22-26具有至少80%相同性的CDRHl氨基酸序列、分别与SEQ ID N0.18、19、20、21或24的氨基酸41-57具有至少80%相同性的CDRH2氨基酸序列、分别与SEQ ID N0:18、19、20或21的氨基酸90-102，或SEQ ID N0:24的氨基酸90-101具有至少80%相同性的CDRH3氨基酸序列，分别与SEQ ID NO: 66、65、68、67或69的氨基酸15-23具有至少80%相同性的CDRLl氨基酸序列、分别与SEQ ID NO:66、65、68、67或69的氨基酸41-47具有至少80%相同性的CDRL2氨基酸序列，和分别与SEQ ID N0:66、65、68、67或69的氨基酸80-87具有至少80%相同性的CDRL3氨基酸序列。
[0049]在另一方面，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ.1D N0:18、19、20、21、24和25，所述轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:65、66、67、68或69。
[0050]在一个优选实施方式中，本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID NO: 18、19、20、21和24，所述轻链可变区包含与分别选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:66、65、68、67和69。
[0051]在本发明中，“至少80%相同性”指所述相同性可以是与提及序列的至少80%或至少85%或90%或95% 或100%的序列相同性。
[0052]优选地，上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段是单克隆抗体或嵌合或人源化的，或去免疫化的或完全人抗体。
[0053]本发明的又一个目的是作为药物使用的上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，特别是用于癌症治疗，优选是前列腺癌治疗。
[0054]本发明的另一个目标是编码上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，或与上述核酸杂交，或由其简并序列组成的核酸分子。本发明的另一个目的是编码本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段的表达载体。本发明的另一个目的是包含上述核酸的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞产生本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。
[0055]本发明的另一个目的是产生本发明抗体、其重组体或合成的抗原结合片段的方法，所述方法包括培养产生上述抗体的细胞并从细胞培养物回收所述抗体。
[0056]在本发明中，公开的⑶R的突变体可通过使所述⑶R序列中的一个或多个氨基酸突变来产生。已知合适位于CDR中的单氨基酸取代就足可改善亲和性。研究人员已采用定点突变来使一些免疫球蛋白产物的亲和性增加约10倍。这种通过使CDR突变来增加或减少(即，调节)抗体亲和性的方法是常识(参见，例如，Paul，W.E.，1993)。因此，使本发明CDR发生氨基酸取代、缺失或添加以增加或减少(即，调节)结合亲和性或特异性也在本发明的范围内。
[0057]简洁起见，可用以下名称来表示本发明的优选抗体:10H6(包含SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:65)、8B12(包含 SEQ ID N0:18 和 SEQ ID N0:66)、13D11 (包含 SEQ ID NO: 21SEQ ID NO: 67)、19.10(包含 SEQ ID NO:20 和 SEQ ID NO: 68)、AL6 (包含 SEQ ID NO:24 和SEQ ID N0:69)(如图9所示)、0MD4(包含SEQ ID NO:25)(如图22所示)。虽然本发明着眼于此类抗体以作为本发明的示例，但本领域普通技术人员应理解，一旦确定本公开内容，其它类似的抗体及其抗体片段，以及这些类似抗体的抗体片段的产生和使用都落在本发明范围内。此类类似抗体可由本领域技术人员通过合理量的实验来产生。
[0058]另优选所述抗体是含有所述表位结合区的SCFV、FV片段、Fab片段、F(ab)2片段、多聚体抗体、肽或蛋白水解片段。优选所述scFv片段包含
[0059]a) SEQ ID NO: 22和/或74 (本文以名称3B6表示，如表3所示)或b) SEQ ID NO: 23和/或85 (本文以名称3C10表示，如表3所示)。
[0060]包含本发明抗体的试剂盒或其它物品也是本发明的部分。
[0061]本发明的另一个目的是包含上述至少一种抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，以及合适的稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。所述组合物包含有效量的所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。药物组合物在该领域中是常规的，并且可由本领域技术人员基于一般常识来制备。包含所述抗体和/或其片段和/或重组衍生物和/或偶联物与至少一种药学上可接受的赋形剂和/或载体混合的药物组合物包括在本发明的范围内。
[0062]治疗和/或预防对象内癌症的方法也是本发明的目的，所述方法包括给予需要的对象治疗有效量的上 述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。本发明的一个目的是减少和/或抑制uPAR的方法，所述方法包括给予有效量的上述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。
[0063]本发明提供包含治疗有效量的本文公开的抗体、pH保持在约4.5~约6.5的缓冲液和可任选的表面活性剂的制剂。所述制剂典型地用于本发明公开的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其活性浓度原则为约0.lmg/ml~约100mg/ml。在某些实施方式中，所述抗体、其重组或合成抗原结合片段的浓度是约0.lmg/ml~lmg/ml ;优选为lmg/ml~10mg/ml，优选为10~100mg/ml。出于本文目的，“药物组合物”是适合且合适给予哺乳动物，尤其是人的药物组合物。因此，所述组合物可用于治疗哺乳动物中的疾病或病症。此外，所述组合物中的抗体已经过一次或多次纯化或分离步骤，从而已将可能对其治疗应用产生干扰的污染物分离在外。所述药物组合物通常包含治疗性的蛋白质和药学上可接受的运载体或稀释剂。所述组合物通常是无菌的，并且可被冻干。下文对药物制备进行更详细的描述。可通过使具有所需纯度的抗体和可任选的生理学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第 16 版,Osol, A.编，1980)混合来制备冻干制剂或水溶液形式的所述一种或多种抗体的治疗制剂。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂就使用的剂量和浓度而言是对接受者无毒的，并且可包括缓冲液、抗氧化剂、防腐剂、肽、蛋白质、亲水性聚合物、螯合剂(例如EDTA)、糖类、成盐的反荷离子(如钠)；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂(例如TWEEN?、PLURONICS?或聚乙二醇(PEG))。活性成分也可包入通过(例如)凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例子分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入乳池液(macroemulsion)中。此类技术可参见《雷明顿药物科学》第16版，Osol,A.编(1980)。用于体内给予的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。
[0064]在另一个实施方式中，就疾病预防或治疗而言，本发明的一种或多种抗体的合适剂量将取决于待治疗的疾病类型、所述疾病的严重性和疗程、所述抗体是否以预防或治疗目的给予、先前治疗、患者的临床史和对所述抗体的应答，以及主治医师的判断力。所述抗体适合于以一次或经一系列治疗给予所述患者。
[0065]根据疾病的类型和严重性，给予患者的抗体或其片段的初始候选剂量是约I μ g/kg~15mg/kg,例如,通过一次或多次分开给予或通过连续输注来给予。就经数天或更长时间的重复给予而言，根据所述病症，使所述治疗持续直至疾病症状得到所需的抑制。然而，也可采用其他剂量方案。可通过常规技术和方法来容易地监测该治疗进展。所述抗体组合物应以遵循良好医学实践的方式来制备、配剂和给予。本发明的抗体/衍生物可通过任何合适的途径给予。这包括(但不限于)腹膜内、肌肉内、静脉内、皮下、关节内、气管内、口服、肠内、肠胃外、鼻内或皮肤给予。就该范围考虑的因素包括治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、所述病症的起因、试剂的递送位点、给予方法、给予安排，以及医学从业人员已知的其它因素。待给予的抗体的“治疗有效量”将由此类考虑来决定，并且是所需的最小量，以预防、改善或治疗疾病或病症。所述抗体不需要，但可任选地与一种或多种当前使用的试剂一同配制以预防或治疗所针对的病症。此类其它试剂的有效量取决于所述制剂中抗体的量、病症或治疗类型，以及上述其它因素。
[0066]在本发明中，抗体指
[0067]a)单克隆、多克隆或嵌合的，或人源化的，或去免疫的，或亲和性成熟的抗体，或完全人抗体或scFv ；
[0068]b)其重组体或合成的抗原结合片段，以及包含此类抗原结合片段的分子，包括工程改造的抗体片段、抗体衍生物、双特异性抗体和其它多特异性分子。
[0069]本文 的术语“抗体”以其最广泛含义使用，并且涵盖不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段(前提是它们显示所需的抗原结合活性)。
[0070]“抗体片段”指除完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的部分，该部分结合与所述完整抗体结合的抗原。
[0071]抗体片段的示例包括但不限于，Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0072]术语“嵌合”抗体指其中重链和/或轻链部分来源于特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链来源于不同的来源或物种的抗体。
[0073]本文术语"Fe区〃优选用于定义抗体的C末端区域，优选是免疫球蛋白，更优选是人IgG，含有至少恒定区的部分的重链，更优选用于定义人IgG铰链和恒定区(hFc)或小鼠IgG铰链和恒定区(mFc)。该术语也包括来自其它免疫球蛋白类型和/或物种的，形成二聚体或寡聚体的类似序列。所述术语还包括天然序列Fe区和变体Fe区。
[0074]术语〃宿主细胞〃、〃宿主细胞系〃和〃宿主细胞培养物〃可互换使用，并且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括〃转化株〃和〃转化细胞"，其包括最初转化的细胞及其衍生的子代，不计传代次数。子代的核酸含量可不与亲本细胞完全相同，并可包含突变。本文包括功能或生物活性与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的突变子代。
[0075]“人抗体”是具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体，或具有的氨基酸序列来源于非人来源但使用人抗体库的抗体，或具有其它编码人抗体的序列的抗体。人抗体的这一定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0076]“人源化的”抗体指含有来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方式中，人源化的抗体将基本包含至少一个、通常两个可变结构域的全部，其中，全部或基本全部的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本全部的FR对应于人抗体的那些。人源化的抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少部分。抗体的“人源化形式”，例如，非人抗体，指已经过人源化的抗体。
[0077]“去免疫化的”抗体是基于HLA结合(T细胞刺激的基本要求)被破坏的免疫原性降低的抗体。
[0078]本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群的抗体，即，除可能的变体抗体(例如少量存在的包含天然发生的突变或在单克隆抗体制备生产过程中出现的变体)以外，所述群包含的单独抗体是相同的和/或结合相同的表位。不同于通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体均针对抗原的单一决定簇。因此，定语"单克隆"表明的抗体特征在于获自基本均一的抗体群，而不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过不同技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和使用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法。
[0079]与参照多肽序列相关的"氨基酸序列相同性百分率(%)"被定义为，在对齐所述序列并引入缺口(如有需要)以达到最大序列相同性百分率之后，候选序列中与参照多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率，并且认为任何保守性取代都不作为所述序列相同性的部分。以测定氨基酸序列相同性百分率为目的的对齐可以本领域技术范围内的不同方式实现，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定合适的参数供于对齐序列，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。
[0080]术语〃药物制剂〃指此类形式的制剂:所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含具有待给予该制剂的对象不可接受的毒性的额外成分。
[0081]本文中所用的“治疗”(及其语法变化形式)指企图改变受治疗的个体的自然病程，并且可供预防或在临床病理学的病程中进行的临床介入。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，和减轻或改善预后。在一些实施方式中，本发明的抗体用于延迟疾病发展或减缓疾病进展。
[0082]本发明的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段可以与分子偶联，所述分子优选是治疗剂。
[0083]通过参考下图的非限制性实施例来描述本发明。
[0084]图1:分别描述三种uPAR变体:uPAR-hFc、uPAR-mFc和uPARmyc (作为对照)的结构域结构的卡通图。(A)描述uPAR-hFc (含有人Fe标签的uPAR的可溶性二聚体形式)的结构的卡通图。uPAR-hFc (序列I，对应于SEQ ID NO: 14)由人uPAR(序列4的全部序列，对应于SEQ ID NO:1)的残基1-277(序列1A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277、结构域D1、D2和D3)、接头区(序列1B，对应于SEQ ID NO:9)和人IgG重链(序列1C，对应于SEQID NO:5)的铰链和恒定区(Fe)组成。hFc-标签的存在导致同源二聚体形成，其中两个多肽通过二硫键连接在一起。
[0085](B)描述uPAR-mFc (含有小鼠Fe标签的uPAR的可溶性二聚体形式)的结构的卡通图。uPAR-mFc (序列2，对应于SEQ ID NO: 15)由人uPAR(序列1A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-277)的残基1-277、接头区(序列2A，对应于SEQ ID NO: 10)和鼠IgG重链(序列2B，对应于SEQ ID NO: 6)的铰链和恒定区(Fe)组成。就uPAR-hFc而言，所述mFc-标签的存在导致同源二聚体形成，其中两个多肽通过二硫键连接在一起。(C)描述uPARmyc (含有C末端myc-标签的uPAR的可溶单体形式)的结构的卡通图。uPARmyc (序列3,对应于SEQ ID NO: 26)由人uPAR(序列3A，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)的残基1-274和C末端myc-标签(序列3B，对应于SEQ ID NO: 27)组成。如图所示，成熟野生型uPAR由三种同源结构域(称作D1、D2和D3)组成。
[0086]图2:使用免疫球蛋白重链恒定区的uPAR的强制二聚化增加VN结合亲和性，但不增加uPA的结合亲和性。(A)uPAR-hFc与经固定VN的结合。使采用VN被覆的96孔板在有过量前uPA(黑色)或无过量前uPA(灰色)存在下用递增浓度的uPAR-hFc在室温下孵育2小时。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。通过检测时间分辨荧光强度来检测所述结合的物质。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值土SD显示。通过非线性回归(四参数拟合)，采用Prism5.0软件包来计算结合曲线、平衡解离常数(Kd，以纳摩尔单位计)和最大结合能力(Bmax，以CPS单位计(计数/秒))。注意到与图B所示的单体uPARmyc相比，uPAR-hFc具有约10倍更高的亲和性和约3倍更高的结合能力。(B) uPARmyc和经固定VN的结合。使采用VN被覆的96孔板在有过量前uPA (黑色)或无过量前uPA (灰色)存在下用递增浓度的uPARmyc在室温下孵育2小时。完全按 照图A所述检测并分析uPARmyc的结合。(C)uPAR-hFc和uPARmyc与经固定的前uPA的结合。使采用前uPA被覆的96孔板用递增浓度的uPAR-hFc (圆形)和uPARmyc (方形)在室温下孵育2小时。完全按照图A所述检测并分析uPARmyc的结合。注意到uPAR-hFc和uPARmyc与经固定的前uPA的结合的Kd和非常相似。
[0087]图3:由uPA的生长因子样结构域和uPAR通过其N末端结合的嵌合分子制成的uPAR变体，其增加VN结合并且减少uPA结合。(A)描述野生型人uPAR和uPAR变体GFD_uPAR嵌合体的结构域结构的卡通图。成熟的野生型uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))由3个同源蛋白结构域(Dl、D2和D3)组成，其通过位于uPAR的C末端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)脂质锚着子连接所述细胞膜的外叶。所述GFDuPAR-嵌合体(序列5，(SEQ ID NO: 16))与野生型uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))具有相同序列，但额外包含uPA的受体结合生长因子样结构域GFD (序列5A，(SEQ ID NO: 3))，该结构域利用短接头序列(序列5B, (SEQ ID NO: 7))被工程改造到uPAR(序列4，(SEQ ID NO:1))的N末端上。(B) 293细胞中的GFDuPAR表达促进细胞对玻连蛋白的粘附。使表达野生型uPAR (uPAR)、VN结合缺陷型uPAR突变体(UPARW32A和 UPARR91A，(Madsen 等，2007))、GFDuPAR 嵌合体(GFDuPAR)或无 uPAR (模拟)的 293 细胞于37°C在采用整联蛋白结合缺陷型VN片段(VN(1-66)RAD，(Madsen等，2007))被覆的孔中粘附I小时。清洗后，将粘附的细胞固定，用结晶紫染色，然后通过在530nm检测吸光度来定量。通过减去非特异性结合(在未被覆孔中检测)来计算特异性细胞粘附，并以粘附聚-L-赖氨酸的百分率(%)表示。数据以独立实验(n=3)的平均值土SD表示。注意到uPAR和GFDuPAR都促进细胞对VN的稳健粘附，但W32A和R91A突变受体，以及模拟转染细胞都未能粘附。(C)GFDuPAR-嵌合体未能促进细胞对经固定的前uPA的粘附。使表达不同uPAR变体的293细胞与采用前uPA被覆的孔在37°C下结合I小时，并如图B所述定量细胞粘附。注意到uPAR、uPARW32A和UPARR91A的表达诱导细胞对前uPA的牢固粘附，而GFDuPAR嵌合体并非如此，因此证明该嵌合体无法结合前uPA。图4:可溶性的GFDuPAR显示对VN的uPA非依赖性高亲和性和减少的uPA结合。(A)描述GFDuPARmyc的结构域组织的卡通图。GFDuPARmyc (序列6 (SEQ ID NO: 28))是含有C末端myc标签的GFDuPAR的分泌的变体(图3A)。GFDuPARmyc-嵌合体(序列6 (SEQ ID NO:28))由uPA的受体结合生长因子样结构域，GFD (序列 5A(SEQ ID NO: 3))、短接头(序列 5B (SEQ ID NO: 7))、uPAR残基 1-274 (序列 3A，对应SEQ ID NO:1的氨基酸1-274)和C末端myc标签(序列3B (SEQ ID NO: 27))组成。(B) GFDuPARmyc和uPARmyc对固定的VN的结合。使采用VN被覆的96孔板用递增浓度的GFDuPARmyc (黑色方形)和uPARmyc (灰色圆形)在室温下孵育2小时。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。通过检测时间分辨荧光强度来检测所述结合的物质。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值土SD显示。通过非线性回归(四参数拟合)，使用Prism5.0软件包来计算结合曲线和解离常数(Kd)。注意到，GFDuPARmyc但非uPARmyc以高亲和性结合VN。(C)GFDuPARmyc和uPARmyc对经固定的前uPA的结合。使采用前uPA被覆的96孔板用递增浓度的GFDuPARmyc (黑色方形)和uPARmyc (灰色圆形)在室温下孵育2小时，并如图B所述检测结合的受体。通过上述非线性回归计算结合曲线、Kd和注意到与uPARmyc相比，GFDuPARmyc结合uPA的亲和性降低约30倍，结合能力减少约5倍。
[0088]图5:其它u PAR变体:uPAR的强制二聚化和在其N末端上添加GFD结构域协同增加所述受体的VN结合活性。
[0089](A)描述GFDuPAR-hFc的结构域结构的卡通图。GFDuPAR-hFc (序列7 (SEQ IDNO: 12))结合了通过如图1A所示添加C末端人Fe标签的强制二聚化和如图3A所示的在N末端上附加的GFD结构域。(B)描述GFDuPAR-mFc结构域结构的卡通图。GFDuPAR-mFc (序列8(SEQ ID NO: 13))与GFDuPAR-hFc相同，不同之处在于，所示Fe区源自小鼠免疫球蛋白(参见图1B)。(C) GFDuPAR-mFc以极度高亲和性结合经固定的VN。使采用VN被覆的96孔板用递增浓度的GFDuPAR-mFc在室温下孵育2小时。清洗后，通过用小鼠IgG恒定区特异性的生物素化的抗体和Eu3+标记的链霉亲和素依次孵育来检测结合的受体。结合的物质通过检测时间分辨的荧光来定量。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值土SD显示。通过非线性回归来计算结合曲线和Kd。
[0090]图6:不同形式的可溶性uPAR的VN结合活性的直接比较(A)GFDuPAR-hFc以高亲和性结合经固定的VN。使采用VN被覆的96孔板在无前uPA存在下或用递增浓度的GFDuPAR-hFc孵育，或在有或无过量前uPA存在下用uPAR-hFc和uPARmyc孵育。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。数据来自单一实验，并且以平均值土SD显示。通过非线性回归来计算结合曲线和Kd。注意到GFDuPAR-hFc以比所测其它任何uPAR形式高的亲和性和能力结合W。(B)GFDuPAR-hFc和GFDuPARmyc对经固定的VN结合的比较。使采用VN被覆的96孔板在无前uPA存在下用递增浓度的GFDuPAR-hFc和GFDuPARmyc在室温下孵育2小时。清洗后，通过采用单克隆uPAR抗体(13F6)和Eu3+标记的抗山羊小鼠抗体依次孵育来检测结合的受体。数据来自单一实验，并且以平均值土SD显示。通过非线性回归来计算结合曲线和Kd。注意到二聚体GFDuPAR-hFc以比单体GFDuPARmyc更高的亲和性(约4倍)和能力(约2.5倍)结合VN。图7:对连接uPAR-hFc中的GFD和uPAR结构域的接头区缺乏特殊要求(A)测试的接头区。为了比较GFDuPAR-hFc (参见图5A)中的GFD和uPAR结构域之间的不同接头长度的可能的影响，用指示的接头序列(长度为5、8、16或20个残基)制得GFDuPAR-hFc变体。接头8与全部上述实验中所用的序列5B(SEQ ID NO:7)和序列9B(SEQ ID NO:8)相同。(B)与经固定VN的结合。使采用VN被覆的孔在有或无IOnM前uPA存在下用来自用指示的uPAR变体瞬时转染的293细胞的条件培养基(稀释10倍)孵育。清洗后，通过用Eu3+标记的抗人Fe抗体孵育并检测时间分辨的荧光来检测结合的物质。注意到,不依赖接头长度，全部GFDuPAR-hFc变体都不依赖前uPA而结合VN。(C)对经固定uPA的结合。使采用前uPA被覆的孔用来自用指示的uPAR变体瞬时转染的293细胞的条件培养基(稀释10倍)孵育。清洗后，如图B所述检测结合的物质。注意到，不依赖于接头长度，全部GFDuPAR-hFc变体显示相较于uPAR-hFc减少的uPA结合。图8:描述在uPAR上附加GFD能增加VN结合并减少uPA结合的两种可能机制的卡通图。(A)分子内结合。若空间上允许，则GFDuPAR中的GFD结构域会结合uPAR中的uPA结合口袋，导致所述嵌合受体的自动饱和。uPAR的自动饱和可诱导所述受体内的构象变化，导致VN结合位点的有效暴露，并防止与uPA结合。(B)分子间结合。如果图A所示的自动饱和就空间原因没有可能，那么GFDuPAR将是杂二价的，并因而显示uPA和uPAR结合活性。在该情况下，GFDuPAR可能形成寡聚体，该寡聚体具有减少的uPA结合活性和和增加的VN结合活性。图9:8个抗体可变区的氨基酸序列。从通过如材料与方法中所述的PCR扩增获得的cDNA序列推出重链和轻链的可变区的氨基酸序列。按照Kabat系统对所 述氨基酸序列编号。互补决定区化0幻1、2和3(从左到右)有下划线。连字符表不引入所述序列以保持对齐的缺口。对应序列表中的Xaa的标点符号表不所述序列是未知的或不确定的。因此，Xaa可以是任何天然发生的氨基酸。
[0091 ] 图10:针对GFDuPAR-hFc产生的单克隆抗体识别细胞表面uPAR。表达人uPAR (huPAR)、小鼠uPAR (muPAR)或不表达uPAR (模拟)的293细胞用针对GFDuPAR-hFc产生的单克隆抗体8B12、10H6、13D11、19.10、13F6、AL6、AL38和BE18染色。使用荧光素标记的山羊抗小鼠抗体检测结合的抗体，并通过流式细胞术来分析所述染色。直方图显示染色亮度(X轴，FL1-H)和频率(Y轴，以最高频亮度的％计)。注意到全部八种抗体都对表达人uPAR的细胞特异性染色。先前已对抗体BR4和AK17有所描述，并且与小鼠uPAR特异性反应(Tjwa 等，2009)。
[0092]图11:mAb8B12的功能抑制活性。将表达人uPAR的293细胞接种于用玻连蛋白(A和B)或纤连蛋白(C)被覆的96孔E平板中，然后转移至实时细胞分析仪仪器(RTCA，xCELLigence, SP罗氏公司(SP Roche Corp.))。以规律间隔记录电阻抗(称为细胞指数，Cl)。大约2小时后，向细胞添加前uPA (B和C)或载剂(A)并继续检测细胞指数。大约另一个小时之后，以图中指示的终浓度向孔添加稀释曲线的8B12抗体，并继续检测细胞指数。图中通过垂直点线指示了添加前uPA和8B12的时间。所述曲线显示标准化的细胞指数(NCI，Y轴)与时间(X轴)的关系。基于抗体添加之前直接检测的细胞指数对全部细胞指数进行标准化。为检测IC50值(图D)，在抗体添加后一小时检测NCI (以相同时间点的未处理细胞的NCI的百分比(%) (ANCI，Y轴)计算)并对与抗体浓度(X轴)的关系作图。
[0093]图12:通过流式细胞术的表位作图(I)。表达人uPAR (uPAR WT)、UPARR83/89A的293细胞用指示的不同抗体染色，并通过流式细胞术分析所述结合。在有或无前uPA的存在下进行uPAR WT细胞染色，以检测配体占用度对抗体结合的可能影响。如同阴性对照(Neg.Ct.)，全部图中的uPAR WT细胞的染色谱都显示细胞没有接纳一抗。图13:通过流式细胞术的表位作图(II)。如图12所述，但分析不同的uPAR变体。
[0094]图14:通过流式细胞术的表位作图(III)。如图12和13所述，但分析不同的uPAR变体。
[0095]图15:uPAR中的抑制性抗体的结合表位的位置。uPAR由三个结构域(D1、D2和D3)组成，其中Dl通过短接头区连接D2。该接头区包含对与VN相互作用的受体而言至关重要的残基(R91 和 Y92，有下划线)(Madsen 等，2007) (Gardsvoll 和 Ploug, 2007)。该实施例中生成的抑制性抗体的结合位点与具有结合热点重要性的R89、R91和Y92有重叠的表位。uPAR的D2D3截短形式的结构示于下文。该变体缺乏SEQ ID NO:1的uPAR的残基1_82。
[0096]图16:抑制 Eu3+-uPA 通过 mAb8B12、13F6、R3 和前 uPA 与 293/uPAR 细胞结合。mAb8B12不干扰uPAR的蛋白水解功能。为了研究所述抑制性抗体8B12是否是uPAR/VN相互作用的特异性抑制剂，或其是否也干扰uPA与所述受体结合，我们进行了体外结合试验。注意到，mAb8B12显示没有或几乎没有抑制活性，说明了该抗体不干扰所述受体的蛋白水解功能。该试验的有效性通过R3抗体和未标记的前uPA显示有效竞争活性来说明。(CPS-计数/秒)。
[0097]图17:mAb8B12抑制体内PC3肿瘤生长。雄性Balb C nu/nu小鼠通过皮下(s.c.)途径接种(IxlO6) PC-3细胞。通过腹膜内途径两周注射一次10.0mg/kg的mAb8B12、mAbl3F6、非免疫对照小鼠IgG(mlgG)或PBS来处理动物。一周测量两次肿瘤，如材料与方法中所述测定肿瘤体积。在PBS和mlgG处理的动物之间没有观察到肿瘤生长差异，并且汇集这些数据然后进行统计学分析。对照动物和8B12处理动物之间的显著性差异用星号表示(NS,非显著性，Ρ>0.05，*Ρ〈.05，**Ρ〈.01和_Ρ〈.001)。指示对照和8Β12处理动物之间的肿瘤体积差异(以％计)。
[0098]图18:mAb8B12减少PC-3肿瘤细胞增殖并促进体内凋亡。雄性Balb C nu/nu小鼠用PC-3细胞皮下接种，并每两周一次地用10.0mg/kg的mAb8B12、mAbl3F6或非免疫对照小鼠IgG通过腹膜内途径注射处理。异种移植后8周，收集肿瘤并如材料与方法部分所述通过免疫组化进行分析(图A)。示出K1-67和活化的胱冬酶3染色并且用Dapi对细胞核进行复染。图B中显示对数据的定量。注意到，相较于采用对照IgG的处理，采用抑制性mAb8B12的处理显著减少肿瘤细胞增殖并增加凋亡。相同同种型的非抑制性mAbl3F6没有显示该活性，说明抗增殖和促凋亡作用的原因是mAb8B12的抑制活性。Y轴的单位是每个视野下的阳性细胞数。
[0099]图19.mGFDmuPAR-Fc的结构域组成和VN结合特性
[0100](A)描述—muPAR-hFc的结构域组织的卡通图。"^muPAR-hFc (序列9 (SEQ IDNO: 17))由鼠uPA的受体结合生长因子样结构域mGFD(序列9A(SEQ ID N0:4))、短接头(序列9B(SEQ ID NO:8))、小鼠uPAR残基1-273(序列9C，对应于SEQ ID NO: 2的氨基酸1-273)、另一个短接头(序列9D (SEQ ID NO: 11))和C末端人Fe标签(hFc，序列IC (SEQ IDNO: 5))组成。同样地，可以使用小鼠Fe标签的C末端。
[0101]⑶mGFDmuPAR-hFc与经固定VN的结合。使采用VN被覆的96孔板用递增浓度的mGFDmuPAR-hFc在室温下孵育2小时。清洗后，通过用Eu3+标记的山羊抗人Fe抗体孵育来检测结合的受体。通过检测时间分辨荧光强度来检测所述结合的物质。通过减去在采用相同样品孵育的未被覆的孔中检测到的非特异性结合来计算特异性结合。数据以代表性实验的平均值土SD显示。通过非线性回归(四参数拟合)，使用Prism5.0软件包来计算解离常数(Kd)。
[0102]图20.针对—muPAR-hFc产生的抗体通过小鼠uPAR介导抑制细胞对VN的粘附。293/muPAR细胞对VN粘附的抑制通过来自骨髓瘤杂交的细胞培养上清液来达到，所述骨髓瘤杂交产生识别mGFDmuPAR-hFc的抗体。将表达鼠uPAR的293细胞接种在VN被覆的E平板中，然后使用xCELLigence酶标仪(罗氏公司(Roche))通过阻抗测量来检测细胞粘附。当粘附到达平台(通过垂直点线表示)时，向所述孔添加来自13种不同骨髓瘤杂交的条件培养基(终浓度30%v/v)，所述骨髓瘤杂交源自用m(:FDmuPAR-hFC免疫的小鼠的脾细胞。注意到，来自4种杂交的条件培养基导致细胞粘附的大幅(0MD4、NE43和00F12)或中等减少(NM23)(以标准化的细胞指数检测)，而来自剩余9种杂交的条件培养基显示几乎没有或没有抑制活性。
[0103]图21.抑制性抗体0MD4和NE43结合至小鼠uPAR中的VN结合位点。为了检测生成抗体的结合表位是否落在小鼠uPAR (muPAR)的VN结合位点中，对用于免疫的抗原(meFDmuPAR-hFc)和在muPAR的VN结合位点包含单个氨基酸取代的该嵌合体的变体(mGFDmuPAR-hFc R92A)以及人可溶性受体(suPAR)进行体外结合试验以确定所述抗体是否也识别人uPAR。使采用—DmuPAR-hFC^muPAR-hFc R92A或人可溶性uPAR (suPAR)被覆的96孔ELISA平板用在稀释缓冲液中以1:100稀释的杂交瘤细胞上清液封闭并孵育。清洗后，通过用Eu3+标记的山羊抗小鼠抗体孵育来探测结合的抗体，并通过增强的时间分辨荧光轻度检测(Delfia)来定量。通过减去未经被覆孔观察到的结合来计算特异性结合。注意到，0MD4和NE43不识别"^muPAR-hFc R92A变体，说明这些抗体结合muPAR中的VN结合位点。这些抗体之一(0MD4)还识别人受体。
[0104]图22.针对meFDmuPAR-Fc重链可变区产生的mAb 0MD4的氨基酸序列。从通过如实施例2材料与方法中所述的PCR扩增获得的cDNA序列推出0MD4重链的可变区的氨基酸序列。根据Kabat系统对所述氨基酸序列编号。互补决定区化0幻1、2和3(从左到右)有下划线。
[0105]图23.mAb 0MD4、NE43、00F12、NM23、8B12的抑制活性的物种特异性。将表达人uPAR (图A)和小鼠uPAR(图B)的293细胞接种在用VN被覆的E平板上，并通过阻抗检测来监测细胞粘附。一旦细胞粘附达到平台(垂直点线)，向孔添加纯化的孔体至IOOnM*的终浓度，并记录细胞粘附变化结果。注意到，表达人uPAR的细胞的粘附受mAb8B12抑制，且部分受mAb 0MD4抑制，而其余的抗体没有显著影响。相反，表达鼠uPAR的细胞的粘附受mAb NE43、00F12、匪23抑制，部分受0MD4抑制，但完全不受8B12抑制。使用13F6作为结合人uPAR的非抑制性阴性对照抗体。*所述0MD4抗体是IgA同种型，并且以1:5稀释的细胞培养物上清液形式使用。该抗体在所述上清液中的浓度未知并且可能较低。因此，采用该抗体观察到的部分影响可能归因于此。
[0106]图24:供于分离scFv识别配体占用二聚体uPAR的淘选策略。
[0107]图25:分离的scFv和细胞表面uPAR的反应性。表达人uPAR的293细胞用指示的SCFv(200nM)染色。使用荧光素标记的山羊抗人F(ab) 2抗体检测结合的抗体，并通过流式细胞术分析染色。直方图显示染色亮度(X轴，FL1-H)和频率(Y轴，以计数计)。
[0108]图26:scFv3B6的抑制活性。如图11中针对mAb8B12所述来检测scFv3B6的抑制活性。所述曲线显示标准化的细胞指数(NCI，Y轴)与时间(X轴)的关系。基于抗体添加之前直接检测的细胞指数对全部细胞指数进行标准化。为检测IC50值(图D)，在抗体添加后一小时检测NCI (以相同时间点的未处理细胞的NCI的百分比(%) (ANCI, Y轴)计算)并对与抗体浓度(X轴)的关系作图。
[0109]图27:scFv3C10的抑制活性。完全按照图26中针对scFv3B6所述来检测3C10的抑制活性。
[0110]图28:将8B12和其它已知化合物抑制uPAR/VN相互作用或uPAR功能的抑制活性做比较。如图11中针对8B12抗体所述检测SMB结构域(图A)、肽P7 (图B)、抗体R3和R5(图C)以及R2抗体(图D)的抑制活性。为检测IC50值，在化合物添加后一小时检测NCI (以相同时间点的 未处理细胞的NCI的百分比(%) (ΛΝ(:Ι，Υ轴)计算)并对与化合物浓度(X轴)的关系作图。图11的8Β12的抑制曲线已经包括在全部四个图中以供比较。所测化合物各自的经计算的IC50和最大抑制常数示于表2。
[0111]实施例1
[0112]材料与方法
[0113]表达载体的构建
[0114]用于带有人IgG恒定区(hFc)标签的重组蛋白的表达载体基于pFRT/TO-Fc质粒(Madsen等，2007)，然而，引入了许多修饰以便于不同编码区的改组并促进蛋白质产量。首先，通过定点突变利用寡核苷酸dXu/dXd破坏位于hFc编码区的载体序列下游的XhoI限制性位点。第二，将通过对寡核苷酸PreF/PreR进行退火所制备的编码PreScission蛋白酶的切割序列的接头插入到位于信号肽/Fe连接处的XhoI位点。为了去除所述构建体的Fe区中存在的内含子(发现这样做增加重组蛋白的产量(我们未经公开的观察结果))，将所述载体转染进入CHO细胞，提取RNA，逆转录，然后用寡核苷酸hVNukpn/FcNr扩增cDNA，并 KpnI/Notl 克隆进入 pcDNA5/FRT_T0 (英杰公司(Invitrogen corp.))和 pEGFP-Nl (克隆泰克公司(Clontech corp.)),以分别牛.成pFRT/TO-hFc和pNl-hFc。带有小鼠IgG恒定区(mFc)标签的重组蛋白的表达载体如下生成:通过使用寡核苷酸mFcU/mFcD来PCR扩增小鼠 IgGlcDNA (克隆 IRAVp968B035D，获自 imaGenes GmbH)，并 Xhol/Notl 克隆进入 pFRT/ΤΟ-hFc和pNl-hFc中，以分别牛成pFRT/TO-mFc和pNl-mFc。编码带有人Fe标签的可溶性uPAR (uPAR-hFc,序列 I (SEQ ID NO: 14))和带有小鼠 Fe 标签的可溶性 uPAR (uPAR-mFc，违^ll 2 (SEQ ID N0:15))的构建体如下制备:通过用寡核苷酸URskF/UpreR2D扩增全长uPARcDNA (Madsen 等，2007)，并 KpnI/XhoI 克隆进入 pFRT/TO-hFc 和 pFRT/TO-mFc 以分别生成pFRT/TO-uPAR-hFc 和 pFRT/TO-uPAR-mFc。编码带有 myc 标签的可溶性 uPAR (uPARmyc，序歹 1丨3(SEQ ID NO:26))的构建体如下生成:通过用寡核苷酸URskF/URMYCR扩增uPAR cDNA，并KpnI/Notl克隆进入pcDNA5/FRT-T0以牛成dFRT/TO-uPARiwc。所述表达载体编码uPA的生长闵子结构域(GFD,序列5A(SEQ ID NO:3))和全长uPAR(序列4(SEQ ID NO:1))的嵌合体。gfdUPAR(序列5 (SEQ ID NO: 16))通过两步PCR重叠扩增法生成。首先，用寡核苷酸ATFkpnF/GFDlr扩增uPA cDNA,并用寡核苷酸UL8f/F012394扩增uPARcDNA。第二，混合所述两种PCR产物，使用寡核苷酸ATFkpnF/F012394共扩增，并KpnI/Notl克隆进入pcDNA5/FRT_T0以生成dFRT/TO-^uPAR。编码带有C末端iwc标签的可溶件csfdUPARdPARiwc,序列6 (SEQ IDNO: 28))的表达载体如下生成，通过采用寡核苷酸ATFkpnF/URMYCR扩增pFRT/TO_GFDuPAR，并将产物KpnI/Notl克隆进入pcDNA5/FRT-T0以生成PFRTZTO-smUPARmvc0编码带有C末端人Fe标签的可溶性二聚体gfdUPAR变体(GFDuPAR-hFc,序列7(SEQ ID NO: 12))和带有小鼠Fe标签mFc标签的可溶性二聚体gfdUPAR变体(GFDuPAR-mFc，座Hg (SEQ ID NO: 13))的表达载体如下生成:通过采用寡核苷酸ATFkpnF/UpreR2D扩增pFRT/T0_GFDuPAR并将产物与 KpnI/XhoI 克隆进入 pFRT/TO-hFc 和 pFRT/TO-mFc 以分别生成 pFRT/TQ-^PAR-hFc 和pFRT/TO-—uPAR-mFc ο如上所述，用uL5f、uL12f、uL16f或uL20f替代寡核苷酸uL8f来制备编码多种嵌合体的表达载体，所述多种嵌合体中的GFD和uPAR结构域之间的接头区的长度不同。将编码eFDuPAR-hFc的区域及其含不同长度接头的变体KpnI/Notl转移到pEGFP-Nl表达载体(克隆泰克公司)，生成pNl-eFDuPAR-hFC供于瞬时表达实验。
[0115]重组蛋白的表达和纯化
[0116]将pFRT/TO-uPAR-hFc、pFRT/TO-GFDuPAR_hFc、pFRT/TO-uPAR-mFc, pFRT/T0-GFDuPAR-mFc,pFRT/TO-uPARmyc pFRT/TO-GFDuPARmyc 表达载体转染进入 CHO Flp-1n 细胞(英杰公司)，而在无血清条件下表达的重组蛋白如先前所描述(Madsen等，2007)。通过标准蛋白A亲和层析从所述条件培养基纯化带有人或小鼠Fe标签的重组体，并用PBS充分透析。将用pFRT/TO-uPARmyc和GFDuPARmyc转染的细胞的条件培养基浓缩约20倍，无需进一步纯化即用于结合试验。使用标准ELISA试验来测定浓缩的条件培养基中的uPARmyc浓度。通过用pNl-eFDuPAR-hFC载体变体瞬时转染培养在OptiMEM无血清培养基(英杰公司)中的Phoenix细胞来使所述多种eFDuPAR-hFc变体(在GFD和uPAR部分之间具有不同长度的接头)表达，并在培养6-8天后回收所述条件培养基。结合试验
[0117]4°C下用在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH9.6)中稀释的前uPA或VN(IOnM)被覆黑色96孔免疫板。平板用清洗缓冲液(含有0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS-T))清洗，并用封闭缓冲液(含有2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS)在室温下使非特异性结合位点饱和>2小时。用PBS-T清洗后，使孔在有或无指示前uPA存在下用在稀释缓冲液(含1%BSA的PBS)中稀释的指示浓度的uPAR-hFc、uPAR-mFc和uPARmyc孵育。在室温下允许所述结合发生2小时，之后通过用清洗缓冲液漂洗来去除未结合的试剂。通过用抗uPAR单克隆抗体(13F6，I μ g/ml)和Eu3+标记的山羊抗小鼠抗体(1:5.000,珀金埃尔默公司(PerkinElmer Corp.))依次孵育来检测结合的uPAR-hFc和uPARmyc。通过使用Envision Xcite酶标仪(帕金埃尔默公司)，使用DELFIA标记方案检测时间分辨荧光强度来检测Eu3+标记。为了计算特异性结合，从被覆孔中检测到的总结合减去在用相同样品孵育的未被覆孔中检测到的非特异性结合。
[0118]细胞系和细胞粘附试验[0119]通过按照已公开的方法(Madsen等，2007)用pFRT/T0_GFDuPAR载体转染来生成表达gfdUPAR的HEK293Flp-1n T-Rex细胞(293)。用空载体转染的293细胞和表达uPARW32A与UPARe9ia的细胞在先前已经描述(Madsen等，2007)。
[0120]寡核苷酸序列
【权利要求】
1.一种尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体分子，所述uPAR变体分子相对于野生型分子具有增加的VN结合活性。
2.如权利要求1所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述uPAR变体分子包含与以下部分连接的野生型uPAR氨基酸序列: a)连接于所述野生型uPAR序列的N末端的uPA的生长因子样结构域(GFD)，和/或 b)连接于所述野生型uPAR序列的C末端的抗体分子的Fe区域的链，其中，若所述Fe区域的链存在，则所述uPAR变体分子是二聚体。
3.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸32-92组成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸32-93组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
4.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸3-271组成的序列，或者基本由SEQ ID NO: 2的成熟muPAR的氨基酸3-270组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
5.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID NO:1的成熟huPAR的氨基酸1-277组成的序列，或者基本由SEQ ID NO:2的成熟muPAR的氨基酸1-273组成的序列，或者由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
6.如权利要求2所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述野生型uPAR序列包含基本由SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO: 2组成的序列，或由来自uPAR直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
7.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子,其特征在于，uPA的所述GFD序列包含基本由SEQ ID NO: 3的人uPA的GFD的氨基酸11-42组成的序列，或者基本由SEQ IDNO:4的小鼠uPA的GFD的氨基酸12-43组成的序列，或由来自GFD直系同源基因的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
8.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子,其特征在于，uPA的所述GFD序列基本由SEQ ID NO: 3的人uPA的GFD序列组成，或基本由SEQ ID NO:4的小鼠uPA的GFD序列组成，或基本由来自GFD直系同源基因的对应区域编码的多肽组成，或其功能突变体或衍生物或类似物。
9.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述Fe区的链是人源性的并且包含基本由SEQ ID NO:5组成的序列，或者所述Fe区的链是小鼠源性的并且包含基本由SEQ ID NO:6组成的序列，或者包含由来自Fe区直系同源基因的链的对应区域编码的多肽，或其功能突变体或衍生物或类似物。
10.如权利要求2-9中任一项所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述uPAR变体分子还包含: a)在所述uPA的GFD序列和所述野生型uPAR序列的N末端之间的第一接头区域，和/或 b)在抗体分子的所述Fe区域的链和所述野生型uPAR序列的C末端之间的第二接头区域。
11.如权利要求10所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述第一接头区域基本由SEQID NO:7或SEQ ID NO:8的序列组成。
12.如权利要求10或11所述的uPAR变体分子，其特征在于，所述第二接头区域基本由SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11 的序列组成。
13.如前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子,其特征在于,所述uPAR变体分子包含基本具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16或17的序列的序列。
14.前述权利要求中任一项所述的uPAR变体分子作为抗原用于获得特异性抗体分子或者用于选择所述抗体的重组体或合成的抗原结合片段的应用，其中，所述特异性抗体分子具有uPAR功能拮抗剂活性。
15.一种能够与权利要求1-13中任一项所述的尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)变体结合的抗体，或其重组体或合成的抗原结合片段。
16.如权利要求15所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段具有uPAR功能拮抗剂活性。
17.如权利要求15或16所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段能够与uPAR分子的表位结合，所述表位包含R89、R91和Y92氨基酸残基中的至少一种。
18.如权利要求15-17中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含至少一个重链互补决定区(CDRH3)氨基酸序列，所述CDRH3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQID N0:18、19、20、21 或 25 的氨基酸 90-102、SEQ ID NO: 24 的氨基酸 90-101，和 SEQ IDNO:22 或 23， 和/或至少一个重链互补决定区(CDRH2)氨基酸序列，所述CDRH2氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID N0:18、19、20、21、24或25的氨基酸41-57， 和/或至少一个重链互补决定区(⑶RHl)氨基酸序列，所述⑶RHl氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO: 18、19、20、21或24的氨基酸22-26和 SEQ ID NO:25 的氨基酸 17-26。
19.如权利要求15-18中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含至少一个轻链互补决定区(CDRL3)氨基酸序列，所述CDRL3氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQID NO:65、66、67、68 或 69 的氨基酸 80-87，和 SEQ ID NO: 74 或 85， 和/或至少一个轻链互补决定区(CDRL2)氨基酸序列，所述CDRL2氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸41-47， 和/或至少一个轻链互补决定区(CDRLl)氨基酸序列，所述CDRLl氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少80%的相同性:SEQ ID NO:65、66、67、68和69的氨基酸15-23。
20.如权利要求15-19中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:18、19、20、21、24和.25 ;和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID NO:65、66、67、68 和 69。
21.如权利要求20所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段，其特征在于，所述抗体、其重组体或合成的抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID N0:18、19、20、21和24 ;和轻链可变区，所述轻链可变区包含与分别选自下组的氨基酸序列具有至少80%相同性的氨基酸序列:SEQ ID NO:66、65、68、67 和 69。
22.用作药物的如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。
23.用于癌症治疗的如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。
24.用于前列腺癌治疗的如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段。
25.一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种如权利要求15-21中任一项所述的抗体、其重组体或合成的抗原结合片段和合适的稀释剂和/或赋形剂。
【文档编号】A61K38/49GK103930128SQ201280038620
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年8月2日 优先权日:2011年8月5日
【发明者】N·西顿纽斯, S·甘地 申请人:意大利癌症研究基金会分子肿瘤学研究所(Ifom)