专利名称：基质金属蛋白酶抑制剂多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶和具有包括抑制血管内皮细胞迁移在内的血管生成抑制剂，可用于血管相关疾病包括肿瘤和类风湿在内的疾病治疗。
背景技术：
近年我国肿瘤的发病率和病死率不断增长。无限制生长、侵袭和转移是肿瘤的恶性标志和特征，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移是改善预后，提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出肿瘤生长依赖血管新生的理论，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，它不仅向肿瘤提供营养，也向宿主输出大量的肿瘤细胞导致肿瘤的生长 和转移。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤血管形成是重要的抗癌措施。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是一组结构相似和功能相关的蛋白内切酶。它们可以切割各种细胞外基质，为炎症细胞和肿瘤细胞的转移打开“通路”；它们可以切割细胞因子或趋化因子，影响炎症细胞的募集；它们还可以切割各种膜连接分子，包括受体和细胞间连接分子，从而调节这些分子的功能。基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是基质金属蛋白酶的典型代表，它的结构复杂、功能多样并且是一种诱导表达的酶。研究发现，MMP-9可以在几个方面促进肿瘤生长。首先，MMP-9是肿瘤部位血管增生的“开关”，它可以切割细胞外基质，释放连接于基质上的VEGF，促进血管增生，血管增生是肿瘤生长的前提条件。这一点可由MMP-9基因敲除小鼠抑制肿瘤部位血管增生得到证明。MMP-9还可以通过从细胞外基质释放VEGF的方式促进淋巴管增生，促进肿瘤转移。其次，肿瘤细胞以及进入肿瘤组织的巨噬细胞和T细胞表面都表达有TNF-α前体，几种金属蛋白酶(包括MMP-9)可以切割并释放有活性的TNF-a，促进血管增生和抑制肿瘤细胞的凋亡。另外，肿瘤部位的炎症细胞表达的MMP-9可以通过两个方面激活TGF- β途径，一是把TGF- β前体切割成有活性的TGF- β，二是切割TGF-β连接蛋白，把TGF-β从细胞外基质上释放出来，活化的TGF-β抑制免疫系统，却不抑制肿瘤本身的生长，从而间接的促进肿瘤生长。MMP抑制剂不但可抑制肿瘤的生长和转移，还具有靶向功能，早在1999年，Koivunen就发现表达了 ΜΜΡ-9多肽抑制剂序列的曬菌体可富集于肿瘤部位。Schafers用MMP-9抑制剂将123I带到肿瘤组织中的MMP-2和MMP-9高表达部位。在最近的研究中，用荧光探针标记的多肽片段(MMP的多肽底物)可以把肿瘤部位的MMP-2，MMP-9和MMP-14的活力定位于转移细胞的前端(已经做到亚细胞定位)。以上的例子表明MMP抑制剂具有靶向功能，不但可早期检测到肿瘤组织，还可以把目的物带到肿瘤部位。MMP-9多肽抑制剂的优势在于，其序列可以连接到其它有抗肿瘤活性的多肽或蛋白质上，新的分子不但可以抑制MMP-9活力，还可以通过MMP-9多肽抑制剂部分把有抗肿瘤活性的成分富集于肿瘤部位，提高其抗肿瘤效果。内皮抑素是一种内源性血管增生抑制剂，但其分子中含有多个二硫键，作为基因工程表达产品，其生产工艺难于控制，影响到产物活性的发挥。Wickstrftm发现内皮抑素的50-60个氨基酸(ES-2)在体外具有很好的抑制血管生成的活性，甚至高于内皮抑素本身的活性。Xu小组研究发现ES-2在鸡胚尿囊膜(CAM)实验中抑制血管增生活性很高，但在小鼠移植肿瘤模型给药中并无此活性。这可能是因为体内实验中ES-2不能在肿瘤部位形成有效浓度。基于这些研究结果，本实验室将MMP-9多肽抑制剂连接于ES-2的N端或C端，获得新的多肽。新多肽可以直接抑制MMP-9的活力，抑制肿瘤生长和转移；还可以把ES-2富集于肿瘤部位，增加其在肿瘤部位有效浓度，增强其抗肿瘤活性。根据这个思路设计的多肽在C57B1/6小鼠上显著的抑制了黑色素瘤B16F10的生长，证明了设计思路的正确性和可行性。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。在全世界的发病率约为0.5%-1.0%，在我国约为0.4%。RA可发生于任何年龄，随着年龄的增长，发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁，性别与RA发病关系密切，男女之比约1:3。RA是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可以缓解症状，但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵，通常可达I小时以上，并不断加重；同时出现一定的关节功能障碍。RA的病理过程中，血管新生是一种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和炎细胞浸润，是RA中血管翳形成及关节破坏的基础。原来应该没有血管存在的关节软骨因某种异常变化，而形成新的血管，使得软骨受到侵蚀，造成关节变形或疼痛。新生血管引起类风 湿关节炎患者滑膜组织发生异常变化，正常人的关节滑膜内层仅1-2层细胞组成，而RA患者的滑膜内层通常有4-10层细胞(有时甚至超过20层)。这些细胞不仅在数量上异常增多，而且在功能上处于异常活跃的状态，它们可以分泌大量的细胞因子、信号分子和蛋白酶，加速关节破坏的进程。另外，RA滑膜中还有大量炎性细胞的浸润，如T细胞、B细胞和单核细胞。因此，血管抑制多肽通过抑制血管生成不仅可阻止向滑膜输送氧气和营养物质，且直接导致血管退化，从而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤。此外该序列中还含有新生血管抑制序列，研究发现其具有高效抑制新生血管生成的活性，特别是对类风湿性关节炎类疾病有很好的治疗作用。血管抑制多肽针对抑制血管新生治疗类风湿关节炎的作用靶点，为开发新型类风湿关节炎药物提供新的研究方向。此外，在关节滑膜腔中，有大量炎症细胞释放的基质金属蛋白酶-9，本专利所设计的多肽本身有抑制基质金属蛋白酶-9的活力，可以减少该酶对滑膜组织的破坏，缓解类风湿性关节炎的症状。新设计的多肽具有抑制包括基质金属蛋白酶-9在内的几种基质金属蛋白酶和抑制血管内皮细胞迁移两种作用，前期研究发现多肽能够抑制内皮细胞的迁移、小管生成，并发现其能体内抑制不同瘤株的生长。进一步研究发现其对类风湿性关节炎有治疗作用，增加了适用症，拓展了其社会价值和经济价值。
发明内容
发明目的本发明针对多肽1、多肽I1、多肽II1、多肽IV做了进一步研究，发现其对多种实体肿瘤和类风湿性关节炎有治疗作用，增加了其适应症。技术方案血管生成抑制剂多肽，其特征在于其氨基酸序列为:在序列Pro- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu 的 N 端或 C 端加上血管抑制多肽序列X或序列Y，或Z序列，其中X的序列为Ile-Val -Ar g-Ar g-A I a~A sp -Ar g-A I a~A I a-Va 1-Pr ο, Y 的序列为Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly, Z 的序列为Gly-Gly-Gly-Gly-1le-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro,其中 D-Pyr为3-(3-卩比唳基)_D_丙氨酸，D-Cys为D-半胱氨酸，Bip为L_4, 4’ -联苯丙氨酸。所述的血管抑制多肽序列，其特征在于所述的多肽序列包括多妝1:1le-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-P;ro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu ；多妝I1:1Ie-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu ；(见 Seq N0.1)多妝II1:Pro_ (D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-1le-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Ar g-A I a~A I a-Va 1-Pr ο ；(见 Seq N0.2)多妝IV:Pro_ (D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-1le-Val-Arg-Arg-AIa-A sp -Ar g-A I a~A I a-Va 1-Pr o,(见 Seq N0.3)其中D-Pyr为3_ (3_吡啶基)-D-丙氨酸，D-Cys为D-半胱氨酸，Bip为L_4，4’ -联
苯丙氨酸。(见Seq N0.4)所述的血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱或睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。所述的血管生成抑制剂，其特征在于所述的多肽共价连接佐剂，佐剂是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或聚乙二醇。所述的血管生成抑制剂多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。
所述的药物组合物可通过多种给药方式治疗原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，口服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。所述的多肽是通过合成方法制备而得。有益效果
先前报道Pro- (D-Pyr) - (D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu具有抑制基质金属蛋白酶_8、基质金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶的活力，因此该多肽有抑制急性炎症的作用(参考文献I)。本专利在此基础上构建了新的多肽序列，新序列拓展了原来多肽的应用范围，将其应用于抗肿瘤领域。多妝Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro 具有抑制血管内皮细胞迁移的活性(参考文献2)，但不能在体内抑制肿瘤细胞的生长，现将多肽Ile-Val-Arg-Arg-AI a-A sp -Ar g-A I a-A I a-Va 1-Pr ο 连接于多妝 Pro- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu的C端或N端，多肽II和多肽IV还在其中加入4个Gly以增加整个分子的柔性，获得了全新的多肽，这些多肽使Pro- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu具有了新的功能,能够抑制实体肿瘤包括C57bl/6小鼠上黑色素瘤细胞B16F10在内的生长。这些多肽分子有望发展成为血管生成抑制剂类抗肿瘤药物，拓展了其社会价值和经济价值。本专利还将多肽I，多肽II，多肽II和多肽IV应用于抗类风湿性关节炎上，进一步拓展了其应用范围。参考文献1.Qiu Z, Yan M, Li Q, Liu D, Van den Steen PE, Wang M, OpdenakkerG, Hu J.Definition of peptide inhibitors from a synthetic peptide library bytargeting gelatinase B/matrix metalloproteinase-9(MMP-9)and TNF-a convertingenzyme(TACE/ADAM-17).J Enzyme Inhib Med Chem.2011Augl0.[Epub ahead of print]参考文献2.Wickstrom SA, Alitalo K, Kesk1-Oja J.An endostatin-derivedpeptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migrationof endothelial cells.J Biol Chem.2004May7;279(19):20178-85.
附图1多肽II对血管内皮细胞迁移的抑制作用；
具体实施例方式多肽1、多肽 I1、多肽III和多肽IV由委托吉尔生化(上海)有限公司合成。实施例1血管生成抑制剂对几种靶点酶的抑制作用。实验方法:重组人基质金属蛋白酶-9[购自R&D Systems, USA]。基质金属蛋白酶-9的浓度为92ng/ μ L(1 μ Μ)。酶活力的检测是通过切割荧光产生多肽底物Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg_NH2 [购自R&D Systems, USA]并检测产生的突光值实现的(激发波长=328nm，检测波长=392nm).所有的检测在37° C下100 μ L反应体系中进行。重组人基质金属蛋白酶-8 [购自Sino Biotechnology Inc.，China]的检测与基质金属蛋白酶-9的检测类似并使用同样的荧光产生底物。反应也是在37° C下IOOyL反应体系中进行。检测时向反应体系中加20 μ L重组人基质金属蛋白酶-8 (2ng/μ L).底物的终浓度为10 μ M0重组人基质金属蛋白酶-3用另外一个荧光产生底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH2 [购自 R&DSystems, USA]来检测(激发波长=320nm，发射波长=405nm)。反应在37° C下100 μ L反应体系中进行。反应开始时向反应体系中加 ο μ L基质金属蛋白酶-3存储液(lng/yL)底物的终浓度为10 μ M。肿瘤坏死因子释放酶[购自R&D Systems, USA]的活力是通过切割荧光产生底物Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Dpa-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-NH[购自 R&DSystems, USA]检测的(激发波长=320nm，发射波长=405nm)。反应在37° C下100 μ L反应体系中进行。反应开始时向反应体系中加4μ L基质金属蛋白酶-3存储液(lng/yL)底物的终浓度为10 μ Μ。结果:新设计的多肽保留了对几种靶点酶的抑制作用，如表I所示。表1.血管生成抑制剂对几种基质金属蛋白酶和肿瘤坏死因子释放酶的抑制作用
权利要求
1.血管生成抑制剂多肽，其特征在于其氨基酸序列为: 在序列Pro- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu的N端或C端加上血管抑制多肽序列 X 或序列 Y，或序列 Z，其中 X 的序列为 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-ProiY 的序列为 IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly，Z 的序列为 Gly-Gly-Gly-Gly-1le-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，其中 D-Pyr为3-(3- 定基)_D_丙氨酸，D-Cys为D-半胱氨酸，Bip为L_4，4’ -联苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的血管抑制多肽序列，其特征在于所述的多肽序列包括多妝 1:1Ie-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu ；多妝II:IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly- Pro-(D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu ；多妝 III:Pro- (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu-1le-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-AIa~AIa-Va1-Pro ；多妝 IV:Pro_ (D-Pyr) - (D-Cys) -Bip-Arg-Gly-Glu —Gly-Gly-Gly-Gly-1le-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proj 其中D-Pyr为3-(3-吡啶基)-D-丙氨酸，D-Cys为D-半胱氨酸，Bip为L_4，4’ -联苯丙氨酸。
3.根据权 利要求1或2任意一项所述的血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱或睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。
4.根据权利要求1或2任意一项所述的血管生成抑制剂多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。
5.根据权利要求3血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的药物组合物可通过多种给药方式治疗原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，口服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。
全文摘要
本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶和抑制血管内皮细胞迁移的血管生成抑制剂，可用于实体肿瘤和类风湿性关节炎的预防和治疗。所述的多肽具体是指多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ和多肽IV(见SeqNO.1、SeqNO.2、SeqNO.3、SeqNO.4)；该多肽可用于治疗实体肿瘤和类风湿性关节炎。该四种血管生成抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。
文档编号A61P19/02GK103145855SQ201310080048
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者胡加亮, 徐寒梅 申请人:南京安吉生物科技有限公司