专利名称：一种促进表皮细胞增殖的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及干细胞及基因工程技术领域，具体涉及一种促进表皮细胞增殖的方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物。
背景技术：
细胞具有一定的寿命，细胞的分裂能力也是有一定限度的，随着细胞分裂次数的增加，细胞增殖能力逐渐减弱，最终停止增殖。这也是细胞从干细胞经过短暂扩增细胞到终末分化细胞的过程。此过程受很多因素影响，有些因素可以减缓甚至扭转这一进程，使细胞重新获得分化、增殖能力。目前，使细胞重新获得分化和增殖能力的策略有核移植(WilmutI, SchniekeAEj McWhir Jj Kind AJj CampbelI KH..Viable offspring derived from fetaland adult mammalian cells.Nature.1997 Feb 27;385 (6619):810-3.)、鸡尾酒基因修饰法(Takahashi K，Yamanaka S.1nduction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factorsCell.2006 Aug 25; 126 (4):663-76.)、细胞裂解液(Taranger CKj Noer A，S0rensenAL，Hakelien AM， Boquest AC，Collas P.1nduction of dedifferentiation, genomewidetranscriptional programming,and epigenetic reprogramming by extracts ofcarcinoma and embryonic stem cells.Mol Biol Cell.2005Dec;16 (12):5719-35.)、端粒酶转染 Comandini A, Naro C，Adamo R，Molecular mechanisms involved in HIV-1-Tatmediated inhibition of telomerase activity in human CD4 (+)T lymphocytes.Mol Immunol.2012 Dec 31; 54 (2): 181-192.)、生长因子转染(Hu ZX，Geng JMj LiangDM，Luo M，Li ML.Hepatocyte growth factor protects human embryonic stem cellderived-neural progenitors from hydrogen peroxide-1nduced apoptosis.Eur JPharmacol.20100ct25;645(l-3):23-31.)等。这些方法虽然可以让成体细胞恢复增殖能力，但存在致瘤性、细胞毒性及细 胞基因型发生改变等问题。组织工程对所需种子细胞的最基本要求就是扩增快，效率高。如何在保持原有细胞特性的基础上实现种子细胞如表皮细胞的快速、高效扩增已经成为组织工程急需解决的重点问题。近年来的研究表明慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因修饰与治疗的效果。在美国已经开展了慢病毒介导的基因治疗的临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景(Dong A, Rivella S，Breda L.Gene therapy for hemoglobinopathies:progress andchallenge.Transl Res.2013 Jan 18.pi1:S1931-5244(12)00447-1.)。链接粘附分子JAMl (GENBANK No:ΝΜ_016946)是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。JAMl可以在同源二聚化之后形成多蛋白的大的复合体，这种复合体介导细胞由外到内的信号传递。此外，JAMl在细胞增殖、迁移，器官发育等方面也有重要作用(参见文献:(I)Nava P，Capaldo CT,Koch Sj et.al.JAM-A regulates epithelial proliferationthrough Akt/β -catenin signalling.EMBO Rep.201IApr;12(4):314-20.； (2)SeversonEA，Lee WY, Capaldo C T，Nusrat A，Parkos CA.Junctional adhesion molecule Ainteracts with Afadin and PDZ-GEF2 to activate RaplAj regulate betalintegrinlevels, and enhance cell migration.Molecular Biology of the Cell Vol.20, 1916 -1925.)基因修饰可调节细胞增殖。目前较为安全的基因修饰方法是慢病毒感染。慢病毒基因载体是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒载体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安全性都得到了保证。目前尚无文献报道有关JAMl基因修饰表皮细胞，以促进其快速增殖的研究及应用。
发明内容
本发明的目的在于一种促进表皮细胞增殖的方法，本发明的另一目的在于提供该方法在制备皮肤移植物中的应用。申请人:基于JAMl可调节上皮细胞增殖，促进间充质干细胞增殖等实验依据，构建含目的基因JAMl的慢病毒过表达载体和JAMl特定干扰序列的慢病毒干扰载体，将其转染表皮细胞，以便用表达的外源性JAMl启动信号转导，获得JAMl高表达和低表达的表皮细胞，称之为JAM1°V-EC和JAMlkd-EC。绘制 生长曲线法测量各组细胞的增殖速度。免疫组化测量各组细胞的表皮细胞特性。裸鼠皮下注射法测量各组细胞有无致瘤性。本发明的主要技术方案如下:首先是根据JAMl的基因结构，设计引物，以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAMlcDNA，再构建重组人peGFP-Nl-JAMl真核表达载体，为提高转染效率，构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP，将慢病毒感染人表皮细胞。设计并合成引物如下:Pl:CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC (SEQ ID NO:1)P2:ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG (SEQ ID NO:2);以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAMlcDNA (SEQ ID NO: 3) 其中的慢病毒载体的构建方法为常规方法，可参见工具书(耿运琪主编，慢病毒与泡沫病毒分子生物学文选，南开大学出版社)。也可以用以下的具体步骤:(I)设计并合成引物如下:JAMl-Age 1-F 如 SEQ ID N0:4 所示，JAMl-Age 1-R 如 SEQ ID N0:5 所示，Ub1-F 如 SEQ ID NO:6 所示，EGFP-N-R 如序列 SEQ ID NO: 7 所示；(2)采用PCR方法从JAMl真核表达载体中钓取目的基因；(3)使用Age I对获得的JAMl过表达质粒和病毒载体进行酶切以获取线性化模板；
(4) PCR产物交换进入线性化慢病毒载体制备慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP。其次，通过查阅文献确定JAMl基因特定的干扰序列为:AAAGAUGGGAUAGUGAUGCCU (SEQ ID NO:8) (Mandell KJ BB, Nusrat A, ParkosCA.(2005)Junctional adhesion molecule I regulates epithelial cellmorphology through effects on betal integrins and Raplactivity.J Biol Chem280:11665-11674.)。构建 JAM1RNA 干扰的慢病毒载体为:pFU-GW-JAMlRNAi_GFP。将 JAMl的干扰慢病毒感染人表皮细胞。最后，本发明将pGC-FU-JAMl-GFP和pFU-GW-JAMlRNAi_GFP颗粒感染表皮干细胞(EC),获得JAMl高表达和低表达的表皮细胞，即JAM1t-EC和JAMlkd-EC,构建方法为常规方法(Elbashir SM, Harborth J, Lendeckelff, Yalcin A, Weber K, Tuschl T.Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature.2001May24;411(6836):494-8.)。实验发现，JAMl下调后表皮细胞增殖明显加快。本发 明的第一方面，是提供了一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAMl基因修饰和基因干扰表皮细胞，该方法包括:A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒；B、将步骤A获得的慢病毒去感染表皮干细胞，获得JAMl低表达的表皮细胞。具体的，该方法包括以下步骤:A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒:JAMl基因干扰慢病毒质粒构建中合成片段如下:pSCF4772-l 如 SEQ ID NO:9 所示；pSCF4772-2 如 SEQ ID NO: 10 所示；退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体pFU-GW-RNAi上，构建JAM1RNA干扰的慢病毒即 pFU-GW-JAMlRNA1-GFP ；B、将pFU-GW-JAMlRNA1-GFP慢病毒颗粒感染表皮干细胞(EC)，获得JAMl低表达的表皮细胞，即JAMlkd-EC,表皮细胞增殖加快。连续培养7天，JAMlkd-EC的细胞量从I万个增加到平均60.5万个，而EC培养7天增加到45万个，JAMlov-EC增加到31.5万个。实验重复三次，均表现为JAMlkd-EC增殖加快。上述方法中，步骤A具体为:首先合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链DNA oligo,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNA干扰慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。(I)确定目的基因siRNA序列:AAAGAUGGGAUA⑶GAUGCCU(NM_016946)(2)确定病毒载体:pFU-GW_RNAi
慢病毒名称载体编号框架结构pFU-GW-RNAipFU-GW-RNAi U6-vshRNA-UB1-GFP—
权利要求
1.一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAMl基因修饰和基因干扰表皮细胞，该方法包括: A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒； B、将步骤A获得的慢病毒去感染表皮干细胞，获得JAMl低表达的表皮细胞。
2.根据权利要求1所述的一种促进表皮细胞增殖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒: JAMl基因干扰慢病毒质粒构建中合成片段如下: PSCF4772-1 如 SEQ ID NO:9 所示； PSCF4772-2 如 SEQ ID NO: 10 所示； 退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体pFU-GW-RNAi上，构建JAM1RNA干扰的慢病毒即 pFU-GW-JAMlRNA1-GFP ； B、将pFU-GW-JAMlRNA1-GFP慢病毒颗粒感染表皮干细胞，获得JAMl低表达的表皮细胞，即JAMlkd-EC,表皮细胞增殖加快。
3.根据权利要求2所述的一种促进表皮细胞增殖的方法，其特征在于，步骤B为: (a)先将10μL三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中，加入的病毒量分别为5 X IO5TU, I X IO5TU, I X IO4TU,而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为I X IO4个，所以三个孔的MOI分别为50、10、I ； (b)每孔中加入10μ L的Polybrene稀释液； (C)在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育； Cd)培养8 12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基； (e)感染3 4天后，观察荧光表达情况，对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性； Cf)通过细胞感染效果，确认MOI值为50可获得最佳感染效果。
4.一种链接粘附分子JAMl基因低表达的表皮细胞，其特征在于，是用以下方法制备得到的: A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒: JAMl基因干扰慢病毒质粒构建中合成片段如下: PSCF4772-1 如 SEQ ID NO:9 所示； PSCF4772-2 如 SEQ ID NO: 10 所示； 退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体pFU-GW-RNAi上，构建JAM1RNA干扰的慢病毒即 pFU-GW-JAMlRNA1-GFP ； B、将pFU-GW-JAMlRNA1-GFP慢病毒颗粒感染表皮干细胞，获得JAMl低表达的表皮细胞，即 JAMlkd-EC。
5.一种如权利要求1至3任一所述的促进表皮细胞增殖的方法在制备创面修复材料或皮肤移植物中的应用。
6.一种如权利要求4所述的链接粘附分子JAMl基因低表达的表皮细胞在制备创面修复材料或皮肤移植物中的应用。
全文摘要
本发明涉及干细胞及基因工程技术领域。链接粘附分子JAM1(NM_016946)是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。本发明提供了一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAM1基因修饰和基因干扰表皮细胞；本发明还提供了一种链接粘附分子JAM1基因低表达的表皮细胞即JAM1kd-EC，并检测了该表皮细胞的增殖能力及表皮细胞特性、生物安全性等。本发明还进一步提供上述的促进表皮细胞增殖的方法和JAM1kd-EC在创面修复或制备皮肤移植物中的应用。
文档编号A61L27/60GK103194425SQ20131011189
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月2日 优先权日2013年4月2日
发明者刘厚奇, 仵敏娟, 周童, 郭晓灿 申请人:中国人民解放军第二军医大学