专利名称：一种用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程领域，特别是涉及一种用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料。
背景技术：
内毒素，S卩脂多糖，作为革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，在人体内广泛存在。人体在严重创伤、感染等应激状态时，菌体的死亡会释放出大量内毒素，从而导致内毒素血症(Endotoxemia, ETM)，进而引起全身炎症反应综合征、脓毒症、多器官功能障碍综合征等。ETM具有高发病率、高死亡率以及高治疗费用等特点[I]。内毒素耐热且稳定，尚未找到安全有效的特异性药物，而使用抗生素治疗会导致大量革兰氏阴性菌的死亡进而释放出更多的内毒素。因而现在的临床研究重点越来越多地放在了采用血液净化方法去除体内内毒素上，而血液净化法的根本则是寻找一种高效、安全的净化吸附材料。血液净化吸附内毒素材料通常都是通过大分子树脂等直接连接配基或者引入间隔臂连接配基。配基材料的选用是决定吸附材料性质最关键的因素。S.Mitzner等人[2]将聚乙烯酰胺(PEI)固定于纤维素球载体上，吸附内毒素效果明显。将纯化的血清白蛋白共价交联在聚甲基丙烯酸酯上，实验发现可通过静电作用吸附内毒素、TNF、IL-6等[3]。多粘菌素B是唯一有抗内毒素作用的抗生素，特异性强、吸附效率高，日本的研究人员将多粘菌素B固定在中空纤维膜内壁上去除血浆中内毒素[4]。应用氨基酸作为内毒素吸附材料的研究，方晖等人[5]曾采用球形纤维素连接多种氨基酸，从而研究了其不同的吸附效率；徐堃等人[6]则研究了以PVDF基膜连接不同氨基酸的内毒素吸附材料。本发明选择了氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂为基底材料，以对人体安全无害的肝素连接苯丙氨酸制成吸附材料。该材料兼具了安全无毒性和良好的血液相容性，同时保持了较高的血浆中的内毒素吸附率。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料。本发明所述肝素-苯丙氨酸吸附材料对血浆中内毒素的去除率高,且血液相容性好,对人体安全无毒。为实现上述目的，本发明采取如下措施:本发明所述用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料，经如下方法制备而成:以氯甲基化聚苯 乙烯-二乙苯烯树脂(以下简称氯甲基树脂)为基底材料，经乙二胺氨基化后，制成氨基化氯甲基树脂；之后使用1_ (3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，即EDC/NHS作为催化剂连接间隔臂肝素，制成肝素化氯甲基树脂 ’最后仍以EDC/NHS为催化剂在肝素上连接苯丙氨酸，制成肝素-苯丙氨酸吸附材料。具体地，本发明所述用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料，经如下方法制备而成:(I)氯甲基树脂的氨基化取氯甲基树脂采用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤各三次，抽滤泵抽干备用；将所得氯甲基树脂5 IOg置于20 60mll，4- 二氧六环中溶胀2 6h，转移至三颈烧瓶中；取
0.1 Ig四丁基溴化铵和I IOg NaOH溶于40ml蒸懼水后加入至三颈烧瓶中；再向三颈烧瓶中加入10 50ml乙二胺；控制反应温度为40 100°C，搅拌反应I 9小时；将反应所得产物过滤，取滤渣用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤至中性，最后经真空干燥，得氨基化氯甲基树脂；(2)间隔臂肝素的连接取柠檬酸缓冲液100ml，采用0.1 1.0mol/L的NaOH溶液调节柠檬酸缓冲液的pH至3 7,采用蒸懼水定容至200ml,再加入0.5 Ig步骤(I)所得的氨基化氯甲基树月旨、I IOg肝素和I IOg催化剂EDC/NHS，其中催化剂EDC/NHS中EDC和NHS的摩尔比为1:1 ;于20 50°C下震荡反应20 40小时；将所得产物进行抽滤，取滤渣用PBS洗液洗涤三次，真空干燥备用，得肝素化氯甲基树脂；(3)配基苯丙氨酸的连接取柠檬酸缓冲液100ml，采用0.1 1.0mol/L的NaOH溶液调节柠檬酸缓冲液的pH至3 7,采用蒸懼水定容至200ml,加入I IOg苯丙氨酸和I 5g催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，即催化剂EDCdSK 0.5 Ih ;再加入0.5 IOg步骤(2)所得的肝素化氯甲基树脂和I IOg催化剂EDC/NHS，其中催化剂EDC/NHS中EDC和NHS的摩尔比为1:1 ;于10 40°C下振荡反应10 50h ;将所得产物进行抽滤，取滤渣用PBS洗液洗涤三次，真空干燥备用，即得肝素-苯丙氨酸吸附材料。在上述用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料中，所述步骤(2)和步骤(3)中柠檬酸缓冲液的配制方法为:向IOOml蒸馏水中加入0.1 IOgNa2HPO4和
0.1 5g柠檬酸，搅拌均匀，即得。氯甲基树脂，俗称氯球，是吸附剂常用的载体材料，特点是机械性能适宜、化学性质稳定、易吸附疏水性物质，其官能团氯甲基可作为偶联其他连接臂或者直接连接配基的活性基团，有利于进行树脂表面的改性。肝素(Heparin)是一种天然生物活性多糖类的化合物，具有抗凝血性，在体内体外都有抗凝血作用，同时生物相容性良好。肝素连接有较多化学活性官能团，利于与不同配基的连接。虽然在人体内生理环境下带负电荷，但具有可以形成氢键的官能团-C00H、-0H，此外正电性基团-NH2具有P位羟基，会加强其静电吸附的作用，这些特性都增强了吸附内毒素的能力；而作为临床上常用的凝血剂，肝素可以减少材料对血液中蛋白的吸附，同时提高了对内毒素的特异性吸附。血液净化过程中，为避免凝血，管路都需进行肝素化涂层，而直接利用肝素作为吸附材料的组成之一，这也有利于透析过程中的抗凝血。考虑到氨基酸对人体的安全性以及良好的血液相容性，以及此前有很多相关机理的研究，因此认为肝素分子臂连接氨基酸是较为适宜和有发展前景的一种吸附材料。从中性氨基酸中选择疏水性比较强的芳香族氨基酸一苯丙氨酸作为配基，其特点是非极性氨基酸，等电点为5.48。肝素含有大量重复基团氨基和羧基，苯丙氨酸通过羧氨缩合反应与肝素大分子链相连，形成了在结构上具有内毒素特异性吸附优势的树形分子，图1所示。这种树型结构通过肝素与基底材料氯甲基树脂的共价缩合而包裹在树脂球表面，吸附过程中树形分子链在血浆中扰动进而通过疏水和氢键的双重作用吸附内毒素分子。本发明将所述肝素-苯丙氨酸吸附材料用于兔子血浆中内毒素的去除，结果证实肝素-苯丙氨酸吸附材料对血浆中内毒素的去除率高，同时采用血液相容性实验证实肝素-苯丙氨酸吸附材料血液相容性好，无毒安全。表明本发明肝素-苯丙氨酸吸附材料可有效用于血液净化法去除内毒素。本发明采用肝素作为间隔臂，连接基底材料氯甲基树脂与配基苯丙氨酸，得到用于血液净化法去除内毒素 的肝素-苯丙氨酸吸附材料，其有益效果是:(I)肝素具有抗凝血的特性，提升了肝素-苯丙氨酸吸附材料的血液相容性和特异选择性；(2)肝素分子上连接有多种活性官能团，作为间隔臂利于与各种配基分子相连；(3)在血液灌流的临床治疗中，通常会使用肝素进行灌流管路涂层以防止凝血，而本发明肝素-苯丙氨酸吸附材料中肝素直接作为了吸附材料的一部分，本身就有一定的抗凝血性；(4)肝素本身安全无毒，且配基为苯丙氨酸，因而本发明所述肝素-苯丙氨酸吸附材料本身就具有了安全无毒的特点；(5)本发明肝素-苯丙氨酸吸附材料对血浆中内毒素的平均去除率为68%，最高可达72%，去除率高。
图1肝素分子链连接苯丙氨酸模型三维图。图2是兔子血浆溶液中肝素-苯丙氨酸吸附材料吸附荧光标记内毒素的效果图。图3是兔子血浆溶液中肝素化氯甲基树脂吸附荧光标记内毒素的效果图。图4是兔子血浆溶液中氨基化氯甲基树脂吸附荧光标记内毒素的效果图。图5是肝素-苯丙氨酸吸附材料对兔子血浆中内毒素的吸附量。图6是肝素-苯丙氨酸吸附材料对兔子血浆中内毒素的吸附率。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的发明内容作进一步的详细描述。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。实施例1肝素-苯丙氨酸吸附材料的制备( I)氯甲基树脂的氨基化取氯甲基树脂采用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤各三次，抽滤泵抽干备用；将所得氯甲基树脂5 IOg置于20 60mll，4- 二氧六环中溶胀2 6h，转移至三颈烧瓶中；取
0.1 Ig四丁基溴化铵和I IOg NaOH溶于40ml蒸懼水后加入至三颈烧瓶中；再向三颈烧瓶中加入10 50ml乙二胺；控制反应温度为40 100°C，搅拌反应I 9小时；将反应所得产物过滤，取滤渣用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤至中性，最后经真空干燥，得氨基化氯甲基树脂；(2)间隔臂肝素的连接向IOOml蒸馏水中分别加入0.1 IOg Na2HPO4和0.1 5g柠檬酸，搅拌均匀，得柠檬酸缓冲液；采用0.1 1.0mol/L的NaOH溶液调节柠檬酸缓冲液的pH至3 7，再采用蒸馏水定容至200ml，加入0.5 Ig步骤(I)所得的氨基化氯甲基树脂、I IOg肝素和I IOg催化剂EDC/NHS，其中催化剂EDC/NHS中EDC和NHS的摩尔比为I: I ;于20 50°C下震荡反应20 40小时；将所得产物进行抽滤，取滤渣用PBS洗液洗涤三次，真空干燥备用，得肝素化氯甲基树脂；(3)配基苯丙氨酸的连接向IOOml蒸馏水中加入0.1 IOg Na2HPO4和0.1 5g柠檬酸，搅拌均匀，得柠檬酸缓冲液；采用0.1 1.0mol/L的NaOH溶液调节柠檬酸缓冲液的pH至3 7，再采用蒸懼水定容至200ml,加入I IOg苯丙氨酸和I 5g催化剂EDC,活化0.5 Ih ;再加入
0.5 IOg步骤(2)所得的肝素化氯甲基树脂和I IOg催化剂EDC/NHS，其中催化剂EDC/NHS中EDC和NHS的摩尔比为1:1 ;于10 40°C下振荡反应10 50h ;将所得产物进行抽滤，取滤渣用PBS洗液洗涤三次，真空干燥备用，即得肝素-苯丙氨酸吸附材料。实施例2荧光显微镜观察肝素-苯丙氨酸吸附材料对荧光内毒素(FITC-LPS)的吸附
将0.2g实施例1制备的肝素-苯丙氨酸吸附材料在含有50 u g/mL荧光内毒素的兔子血浆溶液中分别进行了吸附实验，吸附反应时长为2h，通过倒置荧光显微镜观察表面荧光强度来定性观察吸附情况；在相同实验条件下，以实施例1步骤(I)制备的氨基化氯甲基树脂和实施例1步骤(2)制备的肝素化氯甲基树脂为对照组，实验结果如图2 4所示。图2为肝素-苯丙氨酸吸附材料吸附荧光标记内毒素的效果图，图3为肝素化氯甲基树脂吸附荧光标记内毒素的效果图，图4为氨基化氯甲基树脂吸附荧光标记内毒素的效果图。从图中可以明显看到，荧光内毒素均匀的包裹在吸附材料外层，肝素-苯丙氨酸吸附材料对荧光内毒素吸附的效果明显优于氨基化氯甲基树脂和肝素化氯甲基树脂。实施例3肝素-苯丙氨酸吸附材料用于兔子血浆中内毒素的去除鲎试剂显色基质法用于内毒素的定量检测，基本原理为细菌内毒素与鲎试剂中C因子进行酶促反应，产生凝固酶，其可将人工合成的显色基质分解为黄色的对硝基苯胺(PNA)和多肽。PNA可进一步被偶氮试剂染成玫瑰色，可在545nm下测量反应液中的吸光度值而进行内毒素定量。取实施例1制备的肝素-苯丙氨酸吸附材料0.2g填充入2mL的注射器中，两头用脱脂棉塞住，连接恒流泵和烧杯自制成血液灌流装置进行血浆灌流动态实验。利用鲎试剂盒检测肝素-苯丙氨酸吸附材料分别与含不同内毒素初始浓度的成年白兔血浆溶液于37°C下反应时长2h后的吸附量，实验结果如图5所示。由图5可以看出，本发明肝素-苯丙氨酸吸附材料对兔子血浆中的内毒素的吸附量随着内毒素初始浓度的增加而增加。图6为相应内毒素初始浓度下肝素-苯丙氨酸吸附材料对兔子血浆中的内毒素的吸附率。由图6可知，在测试范围内，吸附率变化不大，内毒素的平均去除率为68%，最高可达72%。实验表明本发明所述肝素-苯丙氨酸吸附材料可有效用于血液净化法去除
内毒素。实施例4肝素-苯丙氨酸吸附材料的血液相容性实验用一次性注射器自制血液灌流器，装入0.5g实施例1制备的肝素-苯丙氨酸吸附材料，灌流前使用肝素钠生理盐水冲管3次，控制适当流速，进行离体血液灌流实验。分别取20iil、2ml未经灌流和20iil、2ml经过体外模拟血液灌流实验2h后的白兔血样，用BC-2000血液细胞分析仪和BS-200常规全自动生化分析仪进行测定，结果如表I所示。血液成分变化不大，血细胞相对变化率都在5%以下，血浆蛋白的相对变化率则在10%以下，即血浆蛋白能够有90%以上的回收率，其中血小板前后变化率在5%以下，在临床可接受范围内。表I灌流材料对血液成分的影响
权利要求
1.一种用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料，其特征在于，经如下方法制备而成: (1)氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂的氨基化 取氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂采用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤各三次，抽滤泵抽干备用；将所得氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂5 IOg置于20 60mll，4- 二氧六环中溶胀2 6h,转移至三颈烧瓶中；取0.1 Ig四丁基溴化铵和I IOg NaOH溶于40ml蒸馏水后加入至三颈烧瓶中；再向三颈烧瓶中加入10 50ml乙二胺；控制反应温度为40 100°C，搅拌反应I 9小时；将反应所得产物过滤，取滤渣用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤至中性，最后经真空干燥，得氨基化氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂； (2)间隔臂肝素的连接 取柠檬酸缓冲液100ml，采用0.1 1.0mol/L的NaOH溶液调节柠檬酸缓冲液的pH至3 7,采用蒸懼水定容至200ml,再加入0.5 Ig步骤(I)所得的氨基化氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂、I IOg肝素和I IOg催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，其中催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1;于20 50°C下震荡反应20 40小时；将所得产物进行抽滤，取滤渣用PBS洗液洗涤三次，真空干燥备用，得肝素化氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂； (3)配基苯丙氨酸的连接 取柠檬酸缓冲液100ml，采用0.1 1.0mol/L的NaOH溶液调节柠檬酸缓冲液的pH至3 7,采用蒸懼水定容至200ml,加入I IOg苯丙氨酸和I 5g催化剂1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，活化0.5 Ih ;再加入0.5 IOg步骤(2)所得的肝素化氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂和I IOg催化剂1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺， 其中催化剂1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1 ;于10 40°C下振荡反应10 50h ;将所得产物进行抽滤，取滤渣用PBS洗液洗涤三次，真空干燥备用，即得用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料。
2.根据权利要求1所述的一种用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(3)中柠檬酸缓冲液的配制方法为向IOOml蒸馏水中加入0.1 IOg Na2HPO4和0.1 5g柠檬酸，搅拌均匀，即得。
全文摘要
本发明涉及一种用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料。本发明所述的用于血液净化法去除内毒素的肝素-苯丙氨酸吸附材料，经如下方法制备而成以氯甲基化聚苯乙烯-二乙苯烯树脂(氯甲基树脂)为基底材料，经乙二胺氨基化后，制成氨基化氯甲基树脂；之后使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，即EDC/NHS作为催化剂连接间隔臂肝素，制成肝素化氯甲基树脂；最后仍以EDC/NHS为催化剂在肝素上连接苯丙氨酸，制成肝素-苯丙氨酸吸附材料。本发明所述肝素-苯丙氨酸吸附材料可有效用于血液净化法去除内毒素，且血液相容性好，对人体安全无毒。
文档编号A61M1/14GK103230781SQ201310161110
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月3日 优先权日2013年5月3日
发明者王翔, 靳欣欣, 杨力, 毛金春, 王菲菲 申请人:重庆大学