疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP I-plus在制备抗肝炎病毒药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种已知蛋白的新用途，属于医药生物【技术领域】，具体涉及疟原虫环子孢子蛋白多肽CSPI-plus在制备抗肝炎病毒药物中的应用。本发明通过将肝细胞与疟原虫环子孢子蛋白多肽CSPI-plus预孵后，再加入肝炎病毒攻击，发现肝细胞表面结合的肝炎病毒明显减少，而且培养一段时间后细胞上清中病毒蛋白和DNA水平明显降低，以上结果表明疟原虫环子孢子蛋白多肽CSPI-plus可明显阻断肝炎病毒与肝细胞的结合。因此，CSPI-plus有望进一步开发成为新型入胞抑制剂，用于治疗急慢性肝炎病毒感染。
【专利说明】疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus在制备抗肝炎病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物【技术领域】，具体涉及疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-Plus在制备抗肝炎病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002]病毒黏附宿主细胞是病毒进入宿主细胞完成其复制、增殖、扩散感染等系列过程的首要步骤。近年研究发现肝细胞表面分子一硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)等多种肝炎病毒的初始黏附受体，在这些肝炎病毒感染早期的细胞黏附中起着关键性作用，决定着病毒的宿主选择性和组织靶向性以及细胞的易感性。而丁型肝炎病毒(HDV)是一种利用HBV包膜蛋白进入肝细胞中的卫星拟病毒，至今为止还没有针对HDV感染的有效治疗。阻断肝炎病毒与宿主细胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖之间的结合，从而有效阻断这些肝炎病毒入侵肝细胞，是治疗急慢性肝炎病毒感染的有效措施之一。
[0003]环子孢子蛋白(circumsporozoite protein, CSP)是覆盖于痕原虫子孢子表面的主要蛋白，通过与肝细胞膜上的HSPG特异性结合，可介导子孢子特异性粘附于肝细胞膜上，进而入侵肝细胞。最近的研究发现，包含CSP保守I区和其上游序列的19个氨基酸的小肽段(CSP 1-plus)是环子孢子蛋白粘附结合肝细胞的主要功能域，可特异性靶向结合肝细胞表面分子HSPG。
迄今为止，未见疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus抗肝炎病毒的相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效的抗肝炎病毒药物的缺陷，提供疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-Plus在制备抗肝炎病毒药物中的应用。
[0005]本发明的另一个目的是提供疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus编码基因在制备抗肝炎病毒药物中的应用。
[0006]本发明的另一个目的是提供含有疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus编码基因的重组表达载体在制备抗肝炎病毒药物中的应用。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
本发明通过将肝细胞与疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus预孵后，再加入肝炎病毒攻击，发现肝细胞表面结合的肝炎病毒明显减少，而且培养一段时间后细胞上清中病毒蛋白和DNA水平明显降低，以上结果表明疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus可明显阻断肝炎病毒与肝细胞的结合。因此，CSP 1-plus有望进一步开发成为新型入胞抑制剂，用于预防肝炎病毒原发感染和/或用于治疗病毒性肝炎。基于上述研究，本发明疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus在制备抗肝炎病毒药物中的应用；疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP1-Plus编码基因在制备抗肝炎病毒药物中的应用；含有如上所述的疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-Plus编码基因的重组表达质粒在制备抗肝炎病毒药物中的应用。疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]肝炎病毒指引起病毒性肝炎的病原体。人类征炎疽皇有甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和庚型病毒等之分；目前研究发现肝细胞表面分子一硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycans, HSPG)是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戍型肝炎病毒(HEV)等多种肝炎病毒的初始黏附受体，在这些肝炎病毒感染早期的细胞黏附中起着关键性作用，决定着病毒的宿主选择性和组织靶向性以及细胞的易感性，而丁型肝炎病毒(HDV)是一种利用HBV包膜蛋白进入肝细胞中的卫星拟病毒。所以说，疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-plus对这些类型的肝炎病毒都有抑制作用。
[0009]本发明的有益效果是:
本发明将CSP 1-Plus与肝细胞预孵后，研究发现:肝细胞表面结合的肝炎病毒明显减少，培养一段时间后细胞上清病毒蛋白和DNA水平明显降低，表明CSP 1-plus可明显阻断肝炎病毒与肝细胞的结合。此外，本发明的CSP 1-plus是多功能的，还具有肝靶向性。因此，CSP 1-plus有望进一步开发成为新型入胞抑制剂，用于预防肝炎病毒感染(如暴露后预防、垂直传播或者肝移植的再感染的预防等)和/或与干扰素或核苷类似物用于治疗急慢性病毒性肝炎(防止原初细胞的感染/被治愈细胞的再感染)，包含CSP 1-plus基因的重组表达载体有望进一步开发成为抗肝炎病毒的新型基因药物，具有良好的临床应用前景。
[0010]说明书附图
图1为免疫荧光显微镜和流式细胞仪检测CSP 1-Plus特异性结合肝细胞表面分子HSPG的结果。
[0011]图2为荧光显微镜观察CSP 1-plus结合模式与HSPG免疫分布是一致的结果。
[0012]图3为流式细胞术检测CSP 1-plus与肝细胞预孵后，再以肝炎病毒攻击肝细胞，肝细胞表面结合的肝炎病毒明显减少的结果。
[0013]图4为实时荧光定量PCR检测CSP I_plus与肝细胞预孵后，再以肝炎病毒攻击肝细胞并培养一段时间后，细胞上清病毒DNA水平明显降低的结果。
【具体实施方式】
[0014]下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法，可参照本领域常规方法条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的方法和条件，或按照制造产品厂商所建议的条件进行。
[0015]实施例1`
S1.疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP 1-Plus的固相化学合成:按SEQ ID N0:1的氨基酸残基的序列，委托北京中科亚光有限公司按照常规多肽合成方法合成多肽，经纯化达到95%以上的纯度。
[0016]S2.CSP 1-plus特异性结合肝细胞表面分子HSPG研究:以H印G2.2.15细胞为肝炎病毒感染肝细胞模型，加入带FITC标记的CSP 1-plus,置湿盒37°C 30分钟，PBS洗涤，封片，荧光显微镜观察。结果显示CSP 1-plus主要结合在肝细胞膜上(见图1)。以可特异降解HSPG的肝素酶处理肝细胞2小时后，发现其均呈浓度依赖性地抑制CSP 1-plus与肝细胞的结合(图1)，进一步表明CSP 1-Plus可特异结合肝细胞表面分子HSPG。接下来发明人进一步研究了 CSP 1-plus与肝细胞表面分子HSPG的关系，取小鼠肝脏切片加入带FITC标记的CSP 1-plus与鼠源HSPG单克隆抗体(1.200)混合物置湿盒37 °C 30分钟，荧光显微镜观察显示CSP 1-plus的肝组织结合模式与HSPG的免疫分布基本一致(见图2)。
[0017]S3.CSP 1-plus阻断肝炎病毒结合肝细胞作用研究:收集5~8例临床HBV、HCV感染患者血清，通过6%聚乙二醇(PEG) 8000沉淀病毒颗粒或以H1-Trap肝素亲和层析柱纯化肝炎病毒颗粒，实时荧光定量PCR检测纯化后的病毒颗粒拷贝数，确定肝炎病毒含量后分装冻存于_80°C。以肝炎病毒易感细胞模型H印aRG细胞为研究对象，HepaRG细胞用含10%胎牛血清(FCS)UOO单位/ml青霉素、100yg/ml链霉素、5yg/ml胰岛素和5Χ10-5M氢化可的松半琥珀酸酯的William’s E培养基培养。在感染前的两至三星期培养基中添加2%的DMSO以诱导细胞分化，每2~3天换液一次。H印aRG细胞与不同浓度CSP 1-plus(0、1、10 nM)预孵30分钟后，再加入肝炎病毒共孵育2小时，此时肝炎病毒只粘附在肝细胞上并未入侵，用培养基洗漆三次洗去未结合的肝炎病毒颗粒，突光抗体标记细胞表面粘附的肝炎病毒，流式细胞仪计数阳性细胞数，结果显示肝细胞与CSP 1-Plus预孵后，与对照组相比肝细胞表面结合的肝炎病毒明显减少(见图3)。先将不同浓度CSP 1-plus (0,0.K
1、10 nM)和H印aRG细胞预孵30分钟，接着将细胞与肝炎病毒共孵育20小时，用培养基洗涤三次洗去未结合的肝炎病毒颗粒，继续培养12天(以保证病毒基因表达)，于第12天收集培养上清，Real-time PCR测定肝炎病毒DNA浓度，结果显示CSP 1-plus处理后与对照组相比，细胞上清病毒DNA水平明显降低的结果(见图4 )。
[0018]实施例2将含CSP 1-plus的编码基因的重组载体转染肝细胞后，观察肝细胞感染肝炎病毒的情况。具体步骤如下: S1.含CSP ι-plus的编码基因的重组载体的构建:
用Primer Premier 5.0生物软件设计含CSP 1-plus编码基因的寡核苷酸片段,序列如SEQ ID NO: 2所示(其中含Hind III酶切位点、BamH I酶切位点及其各自限制性内切酶保护碱基)，并将其克隆入pMD 20-T载体，得到重组质粒pMD 20-T/CSP 1-plus，转化大肠杆菌DH5 α，经过蓝白斑筛选、PCR鉴定、双酶切鉴定及DNA测序分析后，验证了目的基因序列完全正确。pMD 20-T/CSP 1-plus经Hind III和BamH I双酶切，回收目的片段后用T4连接酶连接到经Hind III和BamH I双酶切线性化的真核表达载体pFLAG_CMV8 (Sigma公司)，构建的重组真核表达质粒转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，取转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，于温度37°C孵育18小时，从平板上挑取单个菌落，接种于4mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在温度37°C、振摇速度200转/分钟的条件下振摇培养12~16小时，用质粒抽提试剂盒(TIANGE公司)按照试剂盒说明书抽提重组质粒，进行PCR、酶切鉴定及DNA测序验证，结果显示重组质粒中插入片段的核苷酸序列和顺序与预期完全一致，表明重组表达质粒PFLAG-CMV8-CSP 1-plus构建成功。
[0019]S2.含CSP 1-plus编码基因的重组表达质粒转染肝细胞:
取鉴定正确的含有重组表达质粒PFLAG-CMV8- CSP 1-plus的重组工程菌XLl-Blue，接种于含有AMP的LB液体培养基中，37°C、200转/分钟条件下振摇培养至490nm波长处的OD值达到I~1.5，采用去内毒素超纯质粒抽提试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)按照试剂盒说明书大量抽提重组质粒。用脂质体2000 (Lipofectamine2000)按试剂盒说明转染pFLAG-CMV8- CSP 1-plus至H印aRG细胞，同时设pFLAG_CMV8对照组(以PFLAG-CMV8替代pFLAG_CMV8_CSP 1-plus)。转染24 h后裂解细胞提取蛋白，12 000 r/min离心10 min,收集上清加入SDS-PAGE样品缓冲液,煮沸5min,离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，以抗Flag抗体(1:2 000稀释)为一抗、羊抗小鼠IgG( 1:5 000稀释)为二抗进行Western blot实验,检测发现转染了重组质粒PFLAG-CMV8- CSP 1-plus的H印aRG细胞中得到了与预期蛋白片段大小相符的单一目的条带，从蛋白质水平说明CSP 1-plus基因在H印aRG细胞中得到了表达。 [0020]S3.转染含CSP 1-plus编码基因的重组表达质粒的肝细胞抗肝炎病毒效应:将肝炎病毒加入到转染重组质粒PFLAG-CMV8-CSP 1-plus的肝细胞中(同时设pFLAG_CMV8空载体转染组为对照组)，孵育过夜，培养基洗涤三次洗去未结合的肝炎病毒颗粒，继续培养12天以便允许病毒基因表达，收集第12天的细胞培养上清液，采用上海科华HBsAg ELISA试剂盒，按照试剂说明书测定细胞上清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，结果显示转染重组PFLAG-CMV8-CSP 1-plus的肝细胞肝炎病毒感染率显著下降。
【权利要求】
1.疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP1-Plus在制备抗肝炎病毒药物中的应用。
2.疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP1-plus编码基因在制备抗肝炎病毒药物中的应用。
3.含有权利要求2所述的疟原虫环子孢子蛋白多肽CSP1-plus编码基因的重组表达载体在制备抗肝炎病毒药物中的应用。
4.根据权利要求1至3任一项所述应用，其特征在于，所述药物为肝炎病毒入胞抑制剂。
5.根据权利要求1至3任一项所述应用，其特征在于，所述肝炎病毒为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和/或`戊型肝炎病毒。
【文档编号】A61P31/20GK103611150SQ201310649000
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】朱家勇, 卢雪梅, 金小宝, 汪洁 申请人:广东药学院