胎盘干细胞及其分离方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离的人胎盘多能干细胞群或一种分离的人胎盘多能干细胞，其对人类白细胞抗原-G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性。本发明还提供了一种分离人胎盘多能干细胞的方法。该方法包括：从人胎盘提取细胞；以及分离对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性的细胞，及其用途。此外，本发明还很可能适用于灵长类和其他动物。
【专利说明】胎盘干细胞及其分离方法与应用
[0001] 本发明涉及胎盘胚胎干细胞，其分离方法和应用。
[0002] 再生医学（RM)是一种新兴的、发展迅速的的研究及治疗领域。再生医学的目的 在于通过修复、替换或再生细胞、组织或器官，恢复细胞的功能（DaarAS等，Aproposed definitionofregenerativemedicineJTissueEngRegen, 2007 第 179-184 页）。再生 医学能够在现有治疗方法不足的情况下，从根本上有助于提供治疗。这些情况很多，其中包 括糖尿病、急性肝功能和心脏衰竭、肌肉失调、关节炎、脑部损伤和功能紊乱、视力障碍、肾 病、造血和免疫疾病，急性白血病和淋巴瘤以及各种实体瘤。人体拥有通过干细胞再生的内 生系统。几乎可以在所有种类的组织中找到干细胞。
[0003] 干细胞可自我更新，并且能够分化为各种细胞系。这些细胞可分为胚胎干细胞 (ESC)和非胚胎干细胞或成体干细胞（ASC)。后者不能再分化为各种组织（多能的），并且 其增殖速度低于胚胎干细胞。因此，胚胎干细胞的应用性优于成体干细胞的应用性。
[0004] 对动物和人类的初步研究表明，可以通过移植在体外培养的干细胞，可缓解某些 疾病的症状,例如糖尿病、帕金森氏病、肝功能衰竭和充血性心力衰竭。然而，由于诸多原 因，例如伴随人类胚胎干细胞的使用而产生的伦理问题，以及我们对该领域的极为有限的 知识，该领域进展缓慢。
[0005] 由于上述缺点，人们已经开始使用来自人类骨髓的成体干细胞治疗某些癌症，例 如血癌（白血病）。然而，因为需要侵入式的外科手术、大量专家和专业中心，这一疗法并不 能被系统地应用，并且仍然取决于临床医生的意愿。一些研究者正开发细胞疗法，该疗法基 于分离自脐带的干细胞。然而，从脐带中所能提取的干细胞数量相当少，这使得这一过程漫 长而昂贵。此外，分离自脐带的干细胞并不能与每一位受体免疫系统相容，这会引起免疫反 应，导致移植排斥。
[0006] 诱导性多能干细胞（iPSCs)具有作为再生药物的巨大潜力。Lister等（Hotspots ofaberrantepigenomisreprogramminghumaninhumaninducedpluripotentstem ce11s，Nature，471，2011，第68-73页）指出，人类诱导性多能干细胞表现出重大的重组变 化性，包括躯体记忆和异常的表观基因重组。
[0007] 因此，需要一种细胞疗法，该细胞疗法使得：（1)大量非源自胚胎的多能干细胞在 伦理上可被接受；(2)产生与任何受体免疫相容的干细胞；（3)产生能够到达靶标的可引导 的干细胞。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了分离自人胎盘的多能干细胞。该干细胞群包括至少一种干细胞多能 标志物、人类白细胞抗原G(HLA-G)、以及迁移标志物。由此，本发明的干细胞群可与任何受 体免疫相容，能够迁移至目标组织，而不会产生任何的伦理问题，因为胎盘在分娩之后即被 丢弃。此外,胎盘能够再生大量干细胞。
[0009] 本发明提供了一种分离的人胎盘多能干细胞群或一种分离的人胎盘多能干细胞， 其对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性。
[0010] 本发明还提供了一种分离人胎盘多能干细胞的方法，该方法包括：
[0011] 从人胎盘提取细胞；以及
[0012] 分离对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳 性的细胞。
[0013] 本发明还提供了人胎盘多能干细胞在再生医学、药物传输、药物发现、细胞化妆品 或基因治疗中用作治疗目的的用途，其中，人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G、迁移标 志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性。
[0014] 本发明还提供了通过本文所述方法获得的人胎盘多能干细胞在医学成像中的用 途，其中，所述人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能 干细胞标志物呈阳性。
[0015] 本发明还提供了人胎盘多能干细胞作为人类遗传疾病模型或者作为毒性测试模 型的用途，其中，该人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种 多能干细胞标志物呈阳性。
[0016] 本发明还提供了一种用于对有需要的患者进行治疗的细胞治疗法，该方法包括向 患者施用人胎盘多能干细胞，该人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志 物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1SSEA4、HLA-G和CXCR4细胞的磁性活化细胞分选。
[0018] 图2磁性活化细胞分选和荧光活化细胞分选。进行磁性活化细胞分选，分离对 CXCR4标志物呈阳性的细胞，然后对CXCR4阳性细胞进行荧光活化细胞分选，分离对SSEA4 和HLA-G呈阳性的细胞。
[0019] 图3SSEA4、HLA-G和CXCR4细胞的磁性活化细胞分选。
[0020] 图4磁性活化细胞分选和荧光活化细胞分选。进行磁性活化细胞分选，分离对 CXCR4标志物呈阳性的细胞，然后对CXCR4阳性细胞进行荧光活化细胞分选，分离对SSEA4 和HLA-G呈阳性的细胞。
[0021] 图5SSEA4、NANOG、ALP和0CT-4的磁性活化细胞分选。
[0022] 图6细胞活性。
[0023] 图7证实了SSEA4或HLA-G存在的FACScan分析典型图示。
[0024] 图8目标干细胞中CXCR4的免疫染色的典型图示。
【具体实施方式】
[0025] 术语"人胎盘"是指将发育中的胎儿连接至子宫壁，以便通过母体的供血进行营养 吸收、废物排泄和气体交换的器官。分娩后，胎盘通常被丢弃。可以在正常的胎儿娩出后获 得胎盘，也可以在流产后获得胎盘。
[0026]表述"多能干细胞"指能够分化成内胚层、中胚层或外胚层这三种胚层中任意一 种的细胞。因此，多能干细胞能发育成任何胎儿的或成人的细胞类型。然而，众所周知，多 能细胞自身并不能发育成胎儿或成人生物体，因为它们缺乏生成胚胎外组织例如胎盘的潜 能。本发明的多能干细胞分离自胎盘。从胎盘分离多能干细胞的技术是已知的，例如酶消 化、用于悬浮在流体中的细胞的荧光活化细胞分选（FACS)和磁性活化细胞分选（MACS)。
[0027] 表述"呈阳性"是指细胞表达标志物。一方面，在细胞的表面表达标志物。用于 检测细胞对标志物呈阳性的技术是已知的，例如依靠能够与选定的标志物结合的抗体的技 术。例如将对于标志物特异的一级抗体与细胞一起培养。该抗体结合至特异性标志物，将 对于一级抗体特异的二级标记抗体与细胞一起培养。像这样，如果细胞表达了标志物，则细 胞被标记并且能够被检测到。如果细胞不表达标志物，就检测不到任何标记。使用的方法 例如荧光活化细胞分选、磁性活化细胞分选或ELISA。
[0028] 表述"人类白细胞抗原G"（HLA-G)是指已知由HLA-G基因编码的多肽。该蛋白 质属于HLA非经典I类的重链旁系同源。I类分子是由重链和轻链（￠2微球蛋白）组成 的异质二聚体。重链锚定在细胞膜中。已知HLA-G在来源于胎儿的胎盘细胞上表达，这可 能对孕期的免疫耐受性起作用。此外，细胞表达HLA-G使移植具备免疫耐受性，从而能与 任何受体免疫相容（LeMauxA等，Solublehumanleucocyteantigen-Gmoleculesin peripheralbloodhaematopoieticstemcelltransplantation:aspecificroleto preventacutegraft-versus-hostdiseaseandalinkwithregulatoryTcells.Clin ExpImmunol.2008年4月；152(1):50-56)。据此，本发明对HLA-G呈阳性的多能干细胞改 善了移植时的免疫耐受性，从而与任意受体免疫相容。
[0029] 在一个实施例中，所述HLA-G多肽包含与HLA-G的部分或全部核苷酸序列或氨基 酸序列至少65%-95%-致，至少65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%-致的序列。 这理解为，所述多肽与HLA-G具有一定比例一致性，这使移植免疫耐受性的活性得以提升。 这也理解为，所述多肽与HLA-G具有一定比例一致性，这保持了抗体的结合力，以便被检测 至1J。已知用于检测对HLA-G呈阳性的细胞的抗体例如来自ThermoScientific公司的MsmAb HLA-G(MEMG/9)-APC。
[0030] 术语"迁移标志物"指由细胞表达、允许该细胞迁移至目标的多肽。因此，表达迁 移标志物的细胞能够到达特定的位置或目标。在一个实施例中，所述迁移标志物为趋化因 子受体（CXCR) 4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR7、CCR9、血小板源性生 长因子受体（PDGF-Ra)、TOGF-RP、类胰岛素生长因子受体（IGF-R)、RANTES-R、或MDC-R。 可用于本发明的迁移标志物包括以下文献中所描述的迁移标志物：HonczarenkoM等，Stem cells2006 ;24:1030-1041;SiY等，JClinInvest. 2010 ;120 (4):1192-1203和PonteAL 等，StemCells2007 年 7 月；25(7) :1737-45.Epub2007 年 3 月 29。在一个实施例中，所 述迁移标志物为CXCR4。
[0031] 促炎刺激因素（例如损伤组织、脂多糖、TNF或IL1)引起产生基质细胞衍生因子 I-a和I-P(SDF-I)，已知该因子能吸引表达CXCR4受体的细胞并与其结合。因此，发明人 相信，本发明对迁移标志物呈阳性的多能干细胞，通过系统地给药，能够向炎症部位迁移。 此外，局部用药后，多能干细胞被局部靶标吸引并停留在局部。
[0032] 在一个实施例中，所述迁移标志物包含与上述迁移标志物的部分或全部核苷酸或 氨基酸序列至少65 % -95 % -致，至少65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 % -致的序 列。这理解为，所述多肽与迁移标志物具有一定比例一致性，保持了迁移标志物的活性，从 而所述多肽能够朝着靶标迁移。这也理解为，所述多肽与迁移标志物具有一定比例相似 性，保持了抗体结合力，以便被检测到。已知用于检测对CXCR4呈阳性细胞的抗体例如来自 Abeam公司的MsmAbCXCR4 和来自BDPharmingen公司的MsmAbCXCR4-PE_Cy?5。
[0033] 表述"至少一种多能干细胞标志物"指由干细胞表达的多肽，该干细胞与其他细胞 类型不同，例如全能细胞、多能细胞、寡能细胞、单能细胞、血细胞、肝细胞、内皮细胞等等。 因此，表达所述多肽的所述多能肝细胞可与其他细胞类型分离。已知多能干细胞能够对一 种以上的多能干细胞标志物呈阳性。
[0034] 在一个实施例中，所述多能干细胞标志物为阶段特异性胚胎抗原（SSEA)4、SSEA3、 P0U5F1/0CT4、NAN0G、S0X2、碱性磷酸酶（ALP)、人胚胎干细胞抗原（HESCA-I)、多潜能性维 持因子5 (DPPA5)、叉头框蛋白03 (GENESIS/F0X03)、未分化胚胎细胞转录因子I(UTFl)、 TRA-1-60、TRA-1-81、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3B(DNMT3B)、畸胎瘤衍生生长因子 1(TDGF1/CRIPT0、下调表达基因1(REX1/ZFP42)、端粒酶逆转录酶（TERT)、三磷酸腺苷结合 转运蛋白G超家族成员2抗体（ABCG2)、连接蛋白-43、连接蛋白-45、GCTM2、GCT343、胸腺 细胞抗原（Thyl/CD90)、Y-氨基丁酸受体亚基P3 (GABRB3)、CD9、生长分化因子3 (⑶F3)、 STELLAR、或成纤维细胞生长因子4(FGF4)。能够根据本发明使用的多能干细胞标志物包括 国际干细胞研究组织在自然生物技术（2007 ;25:803-816)中所记载的。
[0035] 在一个实施例中，多能干细胞标志物为SSEA4、NAN0G、ALP或0CT4。在另一个实施 例中，多能干细胞对SSEA4、NANOG、ALP和0CT4呈阳性。在另一个实施例中，多能干细胞标 志物为SSEA4。
[0036] 在一个实施例中，多能干细胞标志物包括与上述多能干细胞标志物的部分或全 部核苷酸或氨基酸序列至少65%-95%-致、至少65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95 % -致的序列。这理解为，所述多肽与迁移标志物具有一定比例一致性，保持了抗体结 合力，以便被检测到。已知用于检测细胞对多能干细胞标志物呈阳性的抗体为例如来自 R&D公司的MsmAbAntih/mSSEA4、来自Abeam公司的MsmAbNAN0G(NNG_811)、MsmAb ALP(BGN/03/661)和MsmAb0CT4。
[0037] 用于检测核酸和氨基酸"序列一致性"的技术在现有技术中也是已知的。通常， 这些技术包括确定基因的mRNA核苷酸序列和/或确定其所编码的氨基酸序列，并且将这 些序列与第二个核苷酸或氨基酸序列进行对比。大体而言，"一致性"指两个多核苷酸序 列的核苷酸与核苷酸精确对应，或者两个多肽序列的氨基酸和氨基酸精确对应。两个或 更多的序列（多核苷酸或氨基酸）可通过确定其"一致性比率"进行对比。无论是核酸还 是氨基酸序列，两序列的一致性比率为，两个比齐的序列的精确匹配数除以较短序列的长 度再乘以100所得的数值。核酸序列的近似队列可以通过局部同源算法进行计算（Smith andWaterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981))。该算法可通过使 用计分矩阵应用至氨基酸序列，该计分矩阵由DayhofT开发（DayhofT,AtlasofProtein SequencesandStructure,M. 0.Dayhoffed.,5suppl. 3:353-358,NationalBiomedical ResearchFoundation,美国华盛顿），并由Gribskov标准化（Gribskov,Nucl.Acids Res. 14(6) :6745-6763(1986))。遗传学计算机小组（GeneticsComputerGroup,威斯康星 州麦迪逊）在"BestFit"应用程序中提供了该算法的示范性实施例，用于确定序列的一致 性比率。在威斯康星序列分析包程序手册第八版（1995)中，记载了该方法的默认参数，该 手册可向遗传学计算机小组（GeneticsComputerGroup,威斯康星州麦迪逊）购买。另 一种可用于本发明的确定一致性比率的方法为MPSRCH软件包，该软件包的版权为爱丁堡 大学所有，由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok开发，并由IntelliGenetics公司（位 于加利福尼亚山景城）销售。在这套软件包中，可应用Smith-Waterman算法，记分表采用 默认参数（例如起始空位罚分（gapopenpenalty)=12、空位延伸罚分（gapextension penalty)= 1、一个空位（gap) =6)中。根据所生成的数据，"匹配"值反映了"序列一致 性"。现有技术中已知其他用于计算序列间一致性比率的合适的程序，例如，另一种比对程 序为BLAST，使用默认参数。例如，BLASTN和BLASTP可采用以下默认参数：geneticcode= standard；filter=none；strand=both；cutoff= 60；expect= 10；MatrixBL0SUM62 ；； Descriptions= 50sequences；sortby=HIGHSCORE!Databases=non-redundant,Gen Bank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swissprotein+Spupdate+PIR。
[0038] 本发明还提供了一种用于分离本发明所述多能干细胞的方法。一方面，首先在分 娩后获得人胎盘。然后从胎盘中提取多能干细胞。例如，可以用胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)酶解提取细胞（例如，大约35至40g胎盘绒毛组织与酶在37°C下一同培养）。 然后从上层清液中的组织中提取细胞，再通过尼龙筛网过滤，离心以获取沉淀物。随后将重 悬过的沉淀物通过不连续Percoll密度梯度（5-70% )进行分层，在室温以400Xg离心20 分钟。收集40%至50%之间的细胞带，洗涤并培养。一旦从胎盘提取了细胞，即分离了对 人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性的细胞。用于 分离对选择性标志物呈阳性的细胞的技术在现有技术中是已知的，例如磁性活化细胞分选 技术（MACSorting)和/或突光活化细胞分选技术（FACSorting)。已知这些方法取决于能 够与所选的标志物相结合的抗体。然后分选出对标志物呈阳性的细胞和未表达标志物的细 胞。
[0039] 如实施例中所描述的，采用磁性活化细胞分选法分离本发明的多能干细胞。通过 使用磁性活化细胞分选技术，分离出的18. 75%的细胞对CXCR4、HLA-G和SSEA4呈阳性。同 样如实施例中所描述的，也可采用磁性活化细胞分选法分离本发明的多能干细胞，将表达 迁移标志物（CXCR4)的细胞分离，并且使用荧光活化细胞分选技术进一步分离表达HLA-G 和多能干细胞标志物（SSEA4、NAN0G、ALP或0CT4)的细胞。通过联合使用这两种技术，分离 出的细胞20. 25%对CXCR4、HLA-G和SSEA4呈阳性。虽然磁性活化细胞分选技术和荧光活 化细胞分选技术联用比单独使用磁性活化细胞分选技术使细胞恢复更好，但两种技术都可 以单独使用。
[0040] 本发明的方法还提供了上述对HLA-G、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物 呈阳性的多能干细胞。
[0041] 本发明的多能干细胞可在多种应用领域中用于治疗目的，例如再生医药、药物释 放和基因治疗。本发明的多能干细胞还可用于医学成像、细胞化妆品、毒性试验，以及作为 研究工具。
[0042] 表述"治疗目的"指使用本发明的胎盘干细胞对需要再生医学的患者进行治疗。
[0043] 再生医学
[0044] 表述"再生医学"指替换或再生人类细胞、组织或器官，以恢复或建立正常功能的 方法。再生医学的例子包括注射干细胞、通过注入细胞而施加的生物活化分子诱导再生、以 及移植体外生长的器官和组织（组织工程）。
[0045] 由于本发明的多能干细胞对HLA-G和迁移标志物呈阳性，可以通过局部或全身用 药，将其用于在体内再生组织。此外，本发明的多能干细胞可用于通过组织工程手段在体外 再生组织。由于本发明的干细胞对HLA-G呈阳性，可以移植工程化的组织，而不会产生不利 的免疫反应。
[0046] 基因治疗
[0047] 表述"基因治疗"指使用DNA作为药物治疗疾病。现有技术中已知，本发明的多能 干细胞可以在体外通过遗传工程方法合成，使其具有编码特定蛋白质的核酸，然后提供给 患者。例如，该细胞可以通过使用皂苷、阳离子多胺、脂质体、微囊或病毒进行工程化来获 得。
[0048] 药物发现和药物释放
[0049] 表述"药物发现"指发现新的候选药物化合物的方法。干细胞药物发现方法旨在 发现调节干细胞功能，证明其具有潜在临床应用的候选药物。有三个特定的领域与此相关： 药物鉴别、药物验证、和/或药物优化。本发明的细胞可用于上述药物鉴别、药物验证和/ 或药物优化。该技术可应用于鉴别新的类药分子，这些类药分子可进一步被开发以解决尚 未满足的医疗需求。
[0050] 表述"给药"指施用药类化合物以达到治疗效果的方法。因此，如上所述，本发明的 细胞可通过遗传工程学的方法在体外合成，在用药时，表达特定的多肽或特定的化合物物， 从而达到治疗效果。该技术可以应用至所有具有以下特性的疾病：蛋白质、酶、激素或其他 对人体功能至关重要的成分的合成缺失或合成机能不全。非限制性实施例包括：癌症、阿尔 兹海默氏症、帕金森氏症、糖尿病、以及由基因缺陷所导致的所有疾病。
[0051] 医学成像
[0052] 本发明的细胞还可以用于医学成像。医学成像指出于诊断或研究疾病的临床目 的，而生成身体或身体部位图像的方法。一方面，对本发明的多能干细胞进行标记之后，细 胞可以被现有技术所知的各种技术追踪。从而，可以在体内对细胞进行追踪和研究。例如， 可以用金颗粒、荧光分子或铁对细胞进行标记，并且可以用MRI、CT扫描或Xenogen对细胞 进行检测。
[0053] 细胞疗法
[0054] 表述"细胞疗法"指将新的细胞引入患者体内以治疗疾病的方法。该表述是再生 医学的子类型疗法。细胞疗法通常着重遗传性疾病的治疗，联用或不联用基因疗法。众所 周知，细胞疗法用于多种临床适应症、多种器官，并且通过各种细胞施用的模式使用。据此， 疗法中所涉及的具体作用机制非常广泛。不局限于特定的理论，发明人相信细胞主要通过 以下两种已知的机制起到治疗作用 ：
[0055] 首先，已知干细胞到达损伤部位后（通过局部或全身给药），和在体外一样， 分化为特定的细胞类型。这些细胞随后整合到损伤部位，替换受损组织，从而改善器官 或组织的功能。例如已知干细胞用于替换心肌梗塞后的心肌细胞（Jacks〇n，K.A.，S. M.Majka等（2001) ?"Regenerationofischemiccardiacmuscleandvascular endotheliumbyadultstemcells."JClinInvest107(11):1395-402和Kawada，H.，J. Fujita等(2004).^Nonhematopoieticmesenchymalstemcellscanbemobilized anddifferentiateintocardiomyocytesaftermyocardialinfarction.''Blood 104(12):3581-7)。
[0056] 其次，干细胞能够释放可溶性因子，例如细胞因子、趋化因子和生长因子，这些因 子以旁分泌或内分泌的方式起作用。这些因子促进器官或部位的自我修复。被施用的细胞 (通过局部或全身给药）在相对短的一段时间内（数天至数周）仍保持存活，随后死亡。这 包括那些自然分泌相关治疗因子的干细胞，或者经历表观遗传变异的干细胞，或者经历使 细胞释放大量特定分子的遗传工程（遗传疗法）的干细胞，比如可分泌促进血管生成、抗炎 症和抗细胞凋亡的因子的细胞（Deuse，T.，C.Peter等（2009).〃Hepatocytegrowthfactor orvascularendothelialgrowthfactorgenetransfermaximizesmesenchymalstem cell-basedmyocardialsalvageafteracutemyocardialinfarction.''Circulation 120(增刊 11):S247-54,Kelly，M.L，M.Wang等"TNFreceptor2,notTNFreceptor 1，enhancesmesenchymalstemcell-mediatedcardiacprotectionfollowing acuteischemia,Shock33 (6):602-7,YagijH. ,A.Soto-Gutierrez等"Mesenchymal stemcelIs:Mechanismsofimmunomodulationandhoming."CellTransplant 19(6) :667-79) 〇
[0057] 临床研究显示，可以将干细胞局部地或全身地注射入患者体内，产生所期望的细 胞疗效，恢复受损组织，例如脑部损伤、脊髓损伤、创伤性脑损伤和缺血性心脏病（Bulte JWInvivoMRIcelltracking:clinicalstudies,AJRAmJRoentgenol，2009， 第 314-25 页，BolliR等Cardiacstemcellsinpatientswithischaemic cardiomyopathy(SCIPIO):initialresultsofarandomizedphaseItrial,The Lancet, 2011，第 1847-1857 页）。
[0058] 因此，本发明的多能干细胞可用于那些能够通过细胞疗法治疗的疾病，例如心血 管损伤、糖尿病、癌症（白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、恶性胶质瘤或乳腺癌）、脑部损伤 (由中风所致或创伤性脑损伤）、脑部退化（帕金森氏症或阿尔兹海默氏症）、脊髓损伤、肌 萎缩性脊髓侧索硬化症、创伤愈合、不育症、克罗恩氏病（crohn'sdisease)或角膜损伤。
[0059] 本发明还提供了多能干细胞的用途，该多能干细胞对人类白细胞抗原-G(HLA-G)、 迁移标志物和至少一种上述多能干细胞标志物呈阳性，并且可用于局部或全身用药。
[0060] 表述"全身用药"指用药途径为肠内用药或肠胃外用药。已知肠内用药是指成分通 过胃肠道吸收。肠胃外用药是指在消化道外给药，例如静脉注射。当本发明的细胞采用肠内 给药时，可将其插入现有技术已知的树枝状大分子、基于脂蛋白的药物载体聚合物或微粒。
[0061] 表述"局部用药"指将细胞施用在身体的局部区域或身体部位的表面。如果受损 部位在脑部内，本发明的细胞可施用在脑部内的受损部位。
[0062] 本发明还提供了一种细胞治疗方法，用于对有需要的患者进行治疗。
[0063] 表述"对有需要的患者进行治疗"指任何容易患病的人，或任何已经患病的人，而 病的症状可以被减轻或缓解。更具体地，主体包括人。
[0064] 如上所述，采用干细胞的细胞疗法可减轻疾病引起的症状，该疾病例如心血管损 伤、糖尿病、癌症（白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、恶性胶质瘤或乳腺癌）、脑部损伤（由中 风所致或创伤性脑损伤）、脑部退化（帕金森氏症或阿尔兹海默氏症）、脊髓损伤、肌萎缩性 脊髓侧索硬化症、创伤愈合、不育症、克罗恩氏病或角膜损伤。由此，对于容易患上或已经患 上所述疾病的患者进行干细胞局部用药或全身用药可以缓解症状。
[0065]本发明的方法还提供了上述多能干细胞，该多能干细胞对人类白细胞抗 原-G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性。
[0066] 本发明的多能干细胞对HLA-G呈阳性，具备免疫耐受性，可与任何受体免疫相容， 而不存在移植排斥的风险。由此，本发明的细胞从人体分离，可被注射至任何动物中，而不 会产生移植排斥。并且，本发明的多能干细胞对迁移标志物呈阳性，可迁移至目标，例如受 损部位。此外，本发明的多能干细胞从胎盘分离，这不需要处理胚胎。由此，分离本发明的 多能干细胞不会产生任何伦理问题。再者，胎盘可再生大量干细胞。
[0067] 细胞化妆品
[0068] 本发明的多能干细胞可用于细胞化妆品，例如胎盘干细胞化妆品（Placental StemCellCosmetics，PSCC)或胎盘干细胞药妆品（PlacentalStemCell Cosmeceuticals，PSCC)。表述"细胞化妆品"指基于从器官或组织中提取出的细胞的药妆 品。已知的药妆品以分离自胚胎组织或胎盘的生物化学物质为基础。因此，本发明的多能 干细胞提供了用于药妆品的胎盘干细胞来源，这些药妆品用于治疗影响皮肤的失调症，例 如冻疮、烧伤、皮肤脱落、皮肤溃疡、坏疽、蜕皮、皮炎、湿疹、痤疮、银屑癣和带状疮疹。此外， 本发明的多能干细胞可用于女性、男性和婴儿化妆品。
[0069] 研究工具
[0070] 本发明的多能干细胞可用作研究工具，例如人类遗传疾病模型或毒性试验模型。
[0071] 人类遗传疾病模型
[0072] 本发明的多能干细胞可用作人类遗传疾病模型，通过用遗传学手段使用细胞或通 过衍生患病的细胞系。该方法有利于研究疾病，例如脆性X染色体综合征、囊胞性纤维症、 三染色体综合征、或其他尚未有可靠研究模型的遗传疾病。
[0073] 毒性试验模型
[0074] 本发明的多能干细胞有助于开发新型的毒性试验平台，以加速药物开发和鉴别新 型毒性因子。该新型毒性试验平台提供了动物试验的替代选择。本发明的多能干细胞还有 助于使用经过标准培养和分化方案的多能干细胞系进行毒性试验。不同的试验覆盖生殖毒 性、神经毒性、新陈代谢和毒物动力学，并且最终可整合为"一体化"试验系统。多能干细胞 培养可以是自动化的，并且放大至能够使所开发的毒性试验在未来实现工业用途。
[0075] 可通过混合有效量的细胞、选择性地其他活性物质、以及药学上可接受的载体，将 本发明的细胞施用至患者，该药学上可接受的载体例如稀释剂、赋形剂或载体。根据现有技 术已知的用药途径，载体可具有不同形式。
[0076] 值得注意的是，细胞的注射量可根据治疗目标情况、患者情况的不同而变化， 并且最后可由参与的主治医生自行决定。本发明施用于患者的细胞用量至少为2xl03/ kg、约 2xl03/kg至 3xl06/kg、约 2xl03/kg至I. 6xl04/kg、约 5xl04/kg至 5xl05/kg、或约 6xl05/kg至 3xl06/kg(参见例如：KebriaeiP等?（2009)."Adulthumanmesenchymal stemcellsaddedtocorticosteroidtherapyforthetreatmentofacute graft-versus-hostdisease〃BiolBloodMarrowTransplant15 (7):804-11,Bjorklund LM等，（2002)''Embryonicstemcellsdevelopintofunctionaldopaminergicneurons aftertransplantationinaParkinsonratmodel〃PNAS，99(4):2344-2349)〇
[0077] 通过参见以下实施例，更易于理解本发明。权利要求的范围不应当仅限于实施例 中所列出的优选实施方式，而应将其与本发明作为一个整体，作出与本发明一致的最宽泛 的解释。
[0078] 具体实施例
[0079] 实施例1
[0080] 提取细胞后，进行磁性活化细胞分选，随后分选出全部三种表现型。如图1和表1 所示，分选出的细胞44. 25 %对SSEA4呈阳性，29. 03 %的细胞对HLA-G呈阳性，75. 25 %的细 胞对CXCR4呈阳性。18. 75%的分离细胞对SSEA4、HLA-G和CXCR4呈阳性。
[0081]表1
[0082]
【权利要求】
1. 一种分离的人胎盘多能干细胞群或一种分离的人胎盘多能干细胞，其对人类白细胞 抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性。
2. 权利要求1所述分离的人胎盘多能干细胞群或所述分离的人胎盘多能干细胞， 其特征在于：所述多能干细胞标志物为阶段特异性胚胎抗原（SSEA)4、SSEA3、P0U5F1/ 0CT4、NANOG、S0X2、碱性磷酸酶（ALP)、人类胚胎干细胞抗原l(HESCA-l)、多能发育相关基 因5(DPPA5)、叉头框D3(GENESIS/F0XD3)、未分化胚胎细胞转录因子1(UTF1)、TRA-1-60、 TRA-1-81、DNA(胞嘧啶-5)甲基化转移酶3β (DNMT3B)、畸胎瘤源性生长因子1(TDGF1/ CRIPTO)、下调表达基因1(REX1/ZFP42)、端粒酶逆转录酶（TERT)、三磷酸腺苷结合转运蛋 白G超家族成员2(ABCG2)、连接蛋白43、连接蛋白45、60￥2、6(^343、胸腺细胞抗原（11^1/ CD90)、γ -氨基丁酸受体亚基β 3 (GABRB3)、CD9、生长分化因子3 (⑶F3)、STELLAR、或纤维 母细胞生长因子4(FGF4)。
3. 权利要求1或2所述分离的人胎盘多能干细胞群或所述分离的人胎盘多能干细胞， 其特征在于：所述多能干细胞标志物为SSE4、NAN0G、ALP或0CT4。
4. 权利要求1至3任一项所述分离的人胎盘多能干细胞群或所述分离的人胎盘多能干 细胞，其特征在于：所述多能干细胞标志物为SSEA4、NANOG、ALP和0CT4。
5. 权利要求1至3任一项所述分离的人胎盘多能干细胞群或所述分离的人胎盘多能干 细胞，其特征在于：所述多能干细胞标志物为SSEA4。
6. 权利要求1至5任一项所述分离的人胎盘多能干细胞群或所述分离的人胎盘多能干 细胞，其特征在于：所述迁移标志物为趋化因子受体（CXCR)4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、 CCR2、CCR3、CCR4、CCR7、CCR9、血小板源性生长因子受体（PDGF-Ra )、PDGF-R0、类胰岛素 生长因子受体（IGF-R)、RANTES-R、或 MDC-R。
7. 权利要求1至6任一项所述分离的人胎盘多能干细胞群或所述分离的人胎盘多能干 细胞，其特征在于：所述迁移标志物为CXCR4。
8. 权利要求1-3、5-7中任一项所述分离的人胎盘多能干细胞群或所述分离的人胎盘 多能干细胞，其特征在于：所述多能干细胞标志物为SSEA4,所述迁移标志物为CXCR4。
9. 用于分离人胎盘多能干细胞的方法，该方法包括： 从人胎盘提取细胞；以及 分离对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性的 细胞。
10. 权利要求9所述的方法，其特征在于：所述多能干细胞标志物为阶段特异性胚胎 抗原（SSEA)4、SSEA3、POU5F1/OCT4、NANOG、SOX2、碱性磷酸酶（ALP)、人类胚胎干细胞抗原 1 (HESCA-1)、多能发育相关基因5 (DPPA5)、叉头框D3 (GENESIS/FOXD3)、未分化胚胎细胞转 录因子1(^^1)、了狀-1-60、了狀-1-81、0嫩（胞嘧啶-5)甲基化转移酶33(0靈138)、畸胎瘤 源性生长因子1(TDGF1/CRIPT0)、下调表达基因1(REX1/ZFP42)、端粒酶逆转录酶（TERT)、 三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)、连接蛋白43、连接蛋白45、GCTM2、 GCT343、胸腺细胞抗原（Thyl/⑶90)、γ -氨基丁酸受体亚基β 3 (GABRB3)、⑶9、生长分化因 子3 (⑶F3)、STELLAR、或纤维母细胞生长因子4 (FGF4)。
11. 权利要求9或10所述的方法，其特征在于：所述多能干细胞标志物为SSE4、NAN0G、 ALP 或 0CT4。
12. 权利要求9至11任一项所述的方法，其特征在于：所述多能干细胞标志物为 SSEA4、NANOG、ALP 和 0CT4。
13. 权利要求9至11任一项所述的方法，其特征在于：所述多能干细胞标志物为 SSEA4。
14. 权利要求9至13任一项所述的方法，其特征在于：所述迁移标志物为趋化因子受 体（CXCR)4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR7、CCR9、血小板源性生长因 子受体（PDGF-Ra)、TOGF-R0、类胰岛素生长因子受体（IGF-R)、RANTES-R、或MDC-R。
15. 权利要求9至14任一项所述的方法，其特征在于：所述迁移标志物为CXCR4。
16. 权利要求9-11U3-15中任一项所述的方法，其特征在于：所述多能干细胞标志物 为SSEA4,所述迁移标志物为CXCR4。
17. 权利要求9至16任一项所述的方法，其特征在于：从人胎盘酶解提取所述细胞。
18. 根据权利要求9至17任一项所述的方法，其特征在于：所述细胞对人类白细胞抗 原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性，并通过磁性活化细胞分选 和/或荧光活化细胞分选进行分离。
19. 人胎盘多能干细胞在再生医学、药物输送、药物发现、细胞化妆品或基因治疗中用 于治疗目的的用途，其特征在于：所述人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁 移标志物和至少一种多能干细胞标志物呈阳性。
20. 权利要求19所述的用途，用作细胞化妆品，治疗冻疮、烧伤、皮肤脱落、皮肤溃疡、 坏疽、蜕皮、皮炎、湿疹、痤疮、银屑癣或带状疮疹。
21. 权利要求19所述的用途，其特征在于：所述再生医学包括细胞疗法或组织工程。
22. 通过权利要求9至18任一项所述的方法得到的人胎盘多能干细胞在医学影像的用 途，其特征在于：所述人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少 一种多能干细胞标志物呈阳性。
23. 权利要求19至22任一项所述的用途，其特征在于：所述人胎盘多能干细胞为局部 用药或全身用药。
24. 人胎盘多能干细胞用作人类遗传疾病模型或用作毒性试验模型的用途，其特征在 于：所述人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种多能干细 胞标志物呈阳性。
25. 权利要求19所述的用途，用于在细胞疗法中，治疗心血管损伤、糖尿病、癌症、脑部 损伤、脑部退化、脊髓损伤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、创伤愈合、不育症、克罗恩氏病或角 膜损伤。
26. 权利要求25所述的用途，其特征在于：所述癌症为白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、 恶性胶质瘤或乳腺癌。
27. 权利要求25所述的用途，其特征在于：所述脑部损伤由中风或创伤性脑损伤所致。
28. 权利要求25所述的用途，其特征在于：所述脑部退化由帕金森氏症或阿尔兹海默 氏症所致。
29. 权利要求19至28任一项所述的用途，其特征在于：所述多能干细胞标志物为阶 段特异性胚胎抗原（SSEA)4、SSEA3、POU5F1/OCT4、NANOG、SOX2、碱性磷酸酶（ALP)、人类 胚胎干细胞抗原l(HESCA-l)、多能发育相关基因5(DPPA5)、叉头框D3(GENESIS/FOXD3)、 未分化胚胎细胞转录因子1 (UTF1)、TRA-1-60、TRA-1-81、DNA(胞嘧啶-5)甲基化转移酶 3β (DNMT3B)、畸胎瘤源性生长因子1(TDGF1/CRIPT0)、下调表达基因1(REX1/ZFP42)、端粒 酶逆转录酶（TERT)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2 (ABCG2)、连接蛋白43、连接 蛋白45、6〇￥2、6(^343、胸腺细胞抗原（11^1/〇)9〇)、￥-氨基丁酸受体亚基0 3(6六81?3)、 CD9、生长分化因子3 (⑶F3)、STELLAR、或纤维母细胞生长因子4(FGF4)。
30. 权利要求19至29任一项所述的用途，其特征在于：所述多能干细胞标志物为 SSE4、NANOG、ALP 或 0CT4。
31. 权利要求19至30任一项所述的用途，其特征在于：所述多能干细胞标志物为 SSEA4、NANOG、ALP 和 0CT4。
32. 权利要求19至31任一项所述的用途，其特征在于：所述多能干细胞标志物为 SSEA4。
33. 权利要求19至32任一项所述的用途，其特征在于：所述迁移标志物为趋化因子受 体（CXCR)4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR7、CCR9、血小板源性生长因 子受体（PDGF-Ra)、TOGF-R0、类胰岛素生长因子受体（IGF-R)、RANTES-R、或MDC-R。
34. 权利要求19至33任一项所述的用途，其特征在于：所述迁移标志物为CXCR4。
35. 权利要求19-30、32-34中任一项所述的用途，其特征在于：所述多能干细胞标志物 为SSEA4,所述迁移标志物为CXCR4。
36. -种用于对有需要的患者进行治疗的细胞治疗方法，该方法包括向患者施用人胎 盘多能干细胞，该人胎盘多能干细胞对人类白细胞抗原G(HLA-G)、迁移标志物和至少一种 多能干细胞标志物呈阳性。
37. 权利要求36所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述施用为局部用药或全身用药。
38. 权利要求36或37所述的细胞治疗方法，包括治疗心血管损伤、糖尿病、癌症、脑部 损伤、脑部退化、脊髓损伤、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、创伤愈合、不育症、克罗恩氏病或角 膜损伤。
39. 权利要求38所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述癌症为白血病、多发性骨髓 瘤、淋巴瘤、恶性胶质瘤或乳腺癌。
40. 权利要求38所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述脑部损伤由中风或创伤性脑 损伤所致。
41. 权利要求38所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述脑部退化由帕金森氏症或阿 尔兹海默氏症所致。
42. 权利要求36至41任一项所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述多能干细胞标志 物为阶段特异性胚胎抗原（SSEA)4、SSEA3、POU5F1/OCT4、NANOG、SOX2、碱性磷酸酶（ALP)、 人类胚胎干细胞抗原1 (HESCA-1)、多能发育相关基因5 (DPPA5)、叉头框D3 (GENESIS/ FOXD3)、未分化胚胎细胞转录因子1(UTF1)、TRA-1-60、TRA-1-81、DNA(胞嘧啶-5)甲基 化转移酶3β (DNMT3B)、畸胎瘤源性生长因子1(TDGF1/CRIPT0)、下调表达基因1(REX1/ ZFP42)、端粒酶逆转录酶（TERT)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)、连接 蛋白43、连接蛋白45、GCTM2、GCT343、胸腺细胞抗原（Thyl/CD90)、γ-氨基丁酸受体亚基 β 3 (GABRB3)、CD9、生长分化因子3 (⑶F3)、STELLAR、或纤维母细胞生长因子4 (FGF4)。
43. 权利要求36至42任一项所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述多能干细胞标志 物为 SSE4、NANOG、ALP 或 0CT4。
44. 权利要求36至43任一项所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述多能干细胞标志 物为 SSEA4、NANOG、ALP 和 0CT4。
45. 权利要求36至44任一项所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述多能干细胞标志 物为SSEA4。
46. 权利要求36至45任一项所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述迁移标志物为 趋化因子受体（CXCR)4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR7、CCR9、血小板 源性生长因子受体（PDGF-Ra )、TOGF-R0、类胰岛素生长因子受体（IGF-R)、RANTES-R、或 MDC-R。
47. 权利要求36至46任一项所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述迁移标志物为 CXCR4。
48. 权利要求36-43、45-47任一项所述的细胞治疗方法，其特征在于：所述多能干细胞 标志物为SSEA4,所述迁移标志物为CXCR4。
【文档编号】A61K35/50GK104284976SQ201380022598
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2012年3月6日
【发明者】阿齐兹·阿里斯 申请人:Sct&B公司