皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢功能修复药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢功能修复药物中的应用。具体提供了皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢功能修复或改善卵巢组织微环境的药物中的应用，在制备促进卵巢颗粒细胞形成、促进卵泡发育转录因子表达和/或抑制卵巢组织中炎症发生的药物中的应用，以及制备促进卵巢损伤动物的体重增加和/或改善卵巢损伤动物生育能力的药物中的应用。本发明拓展了皮肤来源间充质干细胞的应用范围，为皮肤来源间充质干细胞的科学和有效利用提供了指导。
【专利说明】皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢功能修复药物中的应用
[0001]【【技术领域】】
本发明涉及皮肤来源间充质干细胞的用途，具体地说，涉及皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢功能修复药物中的应用。
[0002]【【背景技术】】
皮肤是人体中最大的器官，长期以来一直是作为研究细胞再生的一个潜在来源。皮肤来源间充质干细胞(SMSCs)是一种原始的、独特的多能干细胞，可分化为三个胚层的细胞，包括神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、软骨细胞和成骨细胞。其不仅具有多向分化的潜能外，其还具有组织相容性高、免疫抑制、基因修饰易感性、体外扩增能力强等优点，为临床中疾病的治疗及受损组织的修复带来了新的希望。
[0003]Dyce等人曾报道，在离体实验中发现皮肤来源间充质干细胞可以表达生殖细胞特异性蛋白并形成卵母样的细胞(①Dyce Pff, W Shen, E Huynh, H Shao, DAVillagomez, G.M Kidder, WA King and J L1.(2011).Analysis of oocyte-like cellsdifferentiated from porcine fetal skin-derived stem cells.Stem Cells Dev.20:809-819.②Dyce Pff, L Wen and J L1.2006.1n vitro germline potential of stemcells derived from fetal porcine skin.Nat Cell Biol 8: 384 - 390.)。而且，该研究小组发现新生小鼠皮肤来源的干细胞具有分化成卵母样细胞的能力，将该细胞移植入免疫缺陷小鼠中可形成卵母细胞(Dyce Pff, J Liu, C Tayade, GM Kidder, DH Betts and JL1.(2011).1n vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived fromnewborn mouse skin.PLoS One.6: e20339.)。以上研究表明，皮肤来源的干细胞具有分化为生殖细胞极大的临床应用 潜能。
[0004]中国期刊《南方医科大学学报》，2011年05期，刊出的论文“骨髓间充质干细胞对免疫损伤卵巢的修复作用”，方法是:6~8周龄的野生型健康ICR雌性小鼠随机分为3组，每组各12只。A组不作任何处理，B、C组利用猪卵巢蛋白主动免疫建立免疫损伤卵巢模型。而后C组腹腔移植来自GFP转基因小鼠的骨髓MSCs细胞，A、B组各注射等体积的PBS。MSCs移植后按既定时间处死小鼠，利用PCR检测卵巢中GFP基因以判断MSCs是否到达卵巢；通过对卵巢组织切片HE染色以及细胞凋亡分析来检测MSCs是否对免疫损伤卵巢有修复作用及其机制。结果=PCR结果表明MSCs经腹腔移植可直接到达免疫损伤卵巢;MSCs移植可促进免疫损伤卵巢组织的修复；相应地，移植组颗粒细胞的凋亡比非移植组明显减少。结论:腹腔移植MSCs可促进免疫损伤卵巢的修复，其机制可能与减少颗粒细胞凋亡有关。
[0005]但是目前关于皮肤来源间充质干细胞对卵巢功能修复的作用还未见报道。
[0006]【
【发明内容】
】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供皮肤来源间充质干细胞的用途。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢功能修复或改善卵巢组织微环境的药物中的应用。[0008]皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢颗粒细胞形成、促进卵泡发育转录因子表达和/或抑制卵巢组织中炎症发生的药物中的应用。
[0009]所述的卵泡发育转录因子是Nobox、Nanos3或Lhx 8。
[0010]所述的抑制卵巢组织中炎症发生是指抑制促炎因子TNF-a、TGF-β、IL_8、IL_6、IL-1 β或IFNy的表达。
[0011]皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢损伤动物的体重增加和/或改善卵巢损伤动物生育能力的药物中的应用。
[0012]所述的卵巢损伤动物是卵巢损伤小鼠。
[0013]所述的皮肤来源间充质干细胞为雄性来源。
[0014]本发明优点在于:
本发明通过采用鼠尾静脉的方式将来自红色荧光蛋白(RFP)转基因小鼠(雌性/雄性)的皮肤间充质干细胞(F-SMSCs/M-SMSCs)注入到化疗药物诱导的卵巢早衰小鼠体内，交配实验及小鼠产仔量分析评估小鼠卵巢功能情况，免疫荧光的方法示踪其在卵巢组织中的分布及分化方向，实时定量PCR方法检测其对卵巢组织微环境及卵泡发育的影响，研究发现:在细胞移植组中小鼠的体重明显增加，并且生育能力得到明显改善；RFP阳性的皮肤间充质干细胞可迁移到损伤的卵巢组织，并且分化为卵巢颗粒细胞(RFP+-AMH+);在细胞移植后第7天，卵巢组织中促炎因子TNF-a、TGF-P、IL-8、IL-6、IL-1 β及IFN Y的mRNA的表达明显降低，而与卵泡发育相关的转录因子Nobox、Nanos3及Lhx 8的mRNA表达明显升高。以上结果表明皮肤间充质干细胞在抑制卵巢组织中炎症发生、修复卵巢组织微环境及促进损伤卵巢功能恢复方`面具有重要意义。
[0015]虽然现有技术报道了皮肤来源间充质干细胞可以表达生殖细胞特异性蛋白并形成卵母样的细胞，以及骨髓间充质干细胞对免疫损伤卵巢具有修复作用，但是形成卵母样的细胞并不代表就一定能促进卵巢的修复，另外，骨髓间充质干细胞不同于皮肤来源间充质干细胞，因此也并未给出皮肤来源间充质干细胞对卵巢具备修复作用的启示，再者，以上现有技术并未提示皮肤来源间充质干细胞可以使得卵巢早衰小鼠的体重明显增加并改善其生育能力，也未阐明皮肤来源间充质干细胞可分化为卵巢颗粒细胞，同时未发现骨髓间充质干细胞具有抑制卵巢组织中炎症发生的作用，可见本发明拓展了皮肤来源间充质干细胞的用途，有助于将其应用于更多的领域。
[0016]【【专利附图】
【附图说明】】
附图1AB⑶、图1EF、图1GH是皮肤间充质干细胞SMSCs的特点及分化。(A-B):雌性小鼠皮肤来源间充质干细胞(F-SMSCs) ; (C-D):雄性小鼠皮肤来源的间充质干细胞(SMSCs)；(E):流式细胞仪检测F-SMSCs细胞表型，96%的F-SMSCs细胞表达CD73，3.4%的F-SMSCs表达0ct4，但不表达⑶45、⑶34及⑶14 ； (F):流式细胞仪检测M-SMSCs细胞表型，92%的M-SMSCs 细胞表达 CD73，3.9% 的 M-SMSCs 表达 0ct4，但不表达 CD45、CD34 及 CD14 ； (G-H):在体外诱导分化条件下，F-SMSCs及M-SMSCs细胞能够分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。Scale bars, 50 μ m0
[0017]附图2AB⑶、图2EF是不同实验组中小鼠体重及生殖器官重量的比较。(A):12周龄小鼠的体型图片(a:未经处理的对照组，b-c =F-SMSCs及M-SMSCs细胞处理组，d:正常对照组);(B):在整个实验过程中，未经处理组小鼠的体重明显下降，然而，从第2周开始，细胞移植组小鼠的体重明显高于对照组(**，P <0.01)； (C):卵巢图片(a:未经处理的对照组，b-c =F-SMSCs及M-SMSCs细胞处理组，d:正常对照组)；(D):细胞移植组中小鼠卵巢重量显著增加(**，P <0.01); (E):细胞移植组的子宫重量明显高于未治疗的对照组(*，P < 0.05 ；*，P < 0.01) ; (F):在整个实验过程中宫颈和阴道的重量无明显变化(**，P < 0.01)。
[0018]附图3是不同实验组中小鼠交配实验结果比较。(A):不同实验组中小鼠产仔后代图片；(B):细胞治疗组与未治疗组的产仔数量的比较。细胞移植组小鼠的产仔数量明显高于未处理的对照组(**，P < 0.01)。然而，正常对照组小鼠产生的幼崽的平均数量仍高于细胞处理组(**，P < 0.01)。
[0019]附图4是HE染色评估不同实验组中小鼠卵巢修复情况。(A):在正常对照组，小鼠卵巢组织切片中有大量发育不同阶段的卵泡；(B):在细胞未处理组，卵巢组织大量纤维化并且有大量凋亡细胞存在；(C-D):细胞移植后2个月的小鼠卵巢切片。
[0020]附图5是RFP转基因小鼠的皮肤间充质干细胞在化疗药物诱导卵巢早衰小鼠体内的表达情况。(A):细胞移植后第7天，将小鼠卵巢切片进行免疫荧光观察。箭头表示卵巢间质内的RFP阳性细胞。(B):细胞移植后第21天，在窦状卵泡周围可观察到RFP阳性细胞，图中星号表示窦状卵泡。(C):细胞移植后第28天，卵泡周围颗粒细胞中RFP阳性细胞。(D):细胞移植后2个月，在受体卵巢的窦状卵泡中RFP与AMH双标记的阳性细胞。
[0021]附图6是皮肤间充质干细胞对卵巢炎症反应的影响。(A):通过实时定量PCR分析卵巢组织中促炎症和抗炎症细胞因子基因mRNA的表达水平。在细胞移植后第7天，与未经处理的对照组相比细胞处理组小鼠卵巢组织中TNF-a、TGF-β、IL_8、IL_6、IL-1 β和IFN-y 基因 mRNA 表达水平明显降低(*ρ < 0.05，#Ρ < 0.01，*#Ρ < 0.01)。(B):不同组别小鼠卵巢中卵母细胞特异基因的表达。结果显示，细胞移植能够明显上调N0b0X、Nan0S3和Lhx 8基因mRNA的表达(#P < 0.01)。
[0022]【【具体实施方式】】
下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0023]实施例1
一、材料及方法
1、皮肤间充质干细胞(SMSCs)的分离
RFP转基因小鼠来自于上海交通大学BIO-X中心发育与生殖研究室。从RFP转基因成年雄性或雌性小鼠分离皮肤组织，放置于Hank’s平衡盐溶液中(HBSS)，将其修剪成Imm2组织块，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶37 ° C消化45分钟。将该细胞接种于6孔板中，培养于DMEM / F12培养基中，含有15%胎牛血清(Gibco)、1%的谷氨酰胺(Gibco )、1%青霉素/链霉素(Gibco)和4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)放置在含有5% CO2的37° C恒温箱中。每4-6天将细胞进行传代。
[0024]、流式细胞术分析
利用流式细胞仪对雌性-皮肤间充质干细胞(F-SMSCs)及雄性-皮肤间充质干细胞(M-SMSCs)细胞表面特异性标记物CD73、CD14、CD34、CD45以及0CT4进行分析。将SMSCs细胞(约I X IO6 cells)重悬在含有2%牛血清白蛋白的PBS中，分别加入PE标记的抗鼠⑶73及⑶14抗体，FITC标记抗鼠⑶34、⑶45及0CT4抗体，使用FC500流式细胞仪及Coulter CXP软件进行分析。[0025]、皮肤间充质干细胞的体外诱导分化
采用人骨髓间充质干细胞的功能鉴定试剂盒诱导皮肤间充质干细胞分化。骨细胞和软骨细胞分别使用羊抗鼠骨钙蛋白多克隆抗体及胶原蛋白II抗原多克隆抗体进行标记。冰冻切片的油红O染色为脂质染色。
[0026]、建立卵巢早衰动物模型
选取6周龄ICR野生型雌性小鼠，通过腹腔注射白消安(30 mg/kg)和环磷酰胺(120mg/kg)建立卵巢早衰动物模型(参考 Meirow D, H Biederman, RA Anderson and WHWallace.(2010).Toxicity of chemotherapy and radiation on female reproduction.Clin Obstet Gynecol.53: 727-739.)。同样选取年龄匹配雌性小鼠腹腔注射DMSO作为实验对照组。所有动物实验均在上海机构动物保健和使用委员会批准下进行。
[0027]、皮肤间充质干细胞移植，体重及组织器官重量评估及交配实验
白消安和环磷酰胺化疗药物注射后I周，通过腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)将动物麻醉，将体积约为6 μ L含有皮肤间充质干细胞的细胞悬液(2 X IO6Cells)经鼠尾静脉注入小鼠体内(F-SMSCs组:20只，M-SMSCs组:25只)，而对照组按照同样方式给予同等剂量的细胞培液(15只)。
[0028]在细胞移植后的第1、2、3、4、5、6、7及8周将不同实验组动物麻醉处死，收集组织器官(包括:脑、肺、心脏、肝脏、脾脏、脂肪、卵巢、阴道及子宫颈)并对收集的器官重量做好记录，于-80度冰箱保存。
[0029]在化疗处理后分别在细胞处理组、未处理组及正常对照组选取雌性小鼠进行为期一个月的交配实验，并对每窝产量数量进行记录。
[0030]、免疫荧光` 固定后的卵巢组织经OCT包埋制备成5 μ m厚度的切片，经PBS常规漂洗后在封闭液中室温孵育30分钟封闭非特异性抗原的活性后，切片分别入兔多克隆抗体RFP (1:200)、兔多克隆抗体AMH (1:200) 4°C孵育过夜，PBS漂洗后，入抗兔IgG-FITC及IgG- TRITC(1:200)避光孵育，PBS漂洗后封片。使用Leica DMI3000荧光显微镜观察荧光信号。
[0031]、RNA 提取及 real-time PCR 分析
使用总RNA抽提试剂盒(天根公司)快速提取新鲜卵巢组织中RNA。将每个样品中总量为50(^g RNA进行反转录合成cDNA，进行实时定量PCR，引物序列见表1。所有的反应在25μ?反应体系中进行。反应体系设置:95° C预变性5分钟；95° C 30秒，60° C 30秒40个循环；72° C 30秒。PCR结束后对每个样本中的循环阈值(CT)进行数据分析。mRNA水平的变化以18S RNA水平做内参。
[0032]表1 PCR 引物
【权利要求】
1.皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢功能修复或改善卵巢组织微环境的药物中的应用。
2.皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢颗粒细胞形成、促进卵泡发育转录因子表达和/或抑制卵巢组织中炎症发生的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的卵泡发育转录因子是Nobox、Nanos3 或 Lhx 8。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制卵巢组织中炎症发生是指抑制促炎因子 TNF- α、TGF- β、IL-8、IL-6、IL-1 β 或 IFN Y 的表达。
5.皮肤来源间充质干细胞在制备促进卵巢损伤动物的体重增加和/或改善卵巢损伤动物生育能力的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的卵巢损伤动物是卵巢损伤小鼠。
7.根据权利要求5所 述的应用，其特征在于，所述的皮肤来源间充质干细胞为雄性来源。
【文档编号】A61K35/32GK103816184SQ201410051261
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】赖东梅, 程蔚蔚, 张秋婉, 董张丽 申请人:中国福利会国际和平妇幼保健院