万年蒿提取物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种万年蒿提取物，其中含有总黄酮化合物。总黄酮化合物包括以下一种或几种：6-甲氧基-槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷、异鼠李素、万寿菊素-3-O-β-D-葡萄糖苷、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁、5，7，4′-三羟基黄酮、3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、山奈酚、3，5，7，4′-四羟基-6-甲氧基黄酮、3’，4’，5，7-四羟基黄酮、5，7，4′-三羟基-6，3′-二甲氧基黄酮、5，7，4′-三羟基-6-甲氧基黄酮、槲皮苷、7，3′，4′-三甲基槲皮素、5-羟基-7，4′-二甲氧基黄酮、5，4′-二羟基-7-甲氧基黄酮芜花素、5，7-二羟基-4′-甲氧基黄酮、5，7，3′-二羟基-4-甲氧基黄酮及衍生物。本发明的万年蒿提取物对肝损伤具有显著的预防和治疗效果。
【专利说明】万年蒿提取物及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药【技术领域】，尤其涉及万年蒿提取物及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 菊科蒿属植物约350种以上，广布于北半球的温带地区，欧、亚、北美，少数种分 布到非洲、南亚及中美洲等热带地区，中国（不包括分出的絹篙属Seriphidium(Bess.) ?〇1」&1^.)有170种以上，各地均产，其中如黄花蒿4.31111皿1^，青蒿4.3口13〇63]^11〇6，茵陈 蒿A.capillarisThunb?和A.argyiLevl.etVant?等均入药，尤以艾的用途最广，黄花蒿 可治疟疾，还可制酒饼。
[0003] 万年蒿，草本、亚灌木或小灌木，揉之常有香味；叶互生，常分裂；头状花序小，异 性，盘状，常弯垂，排成圆锥花序、穗状花序或总状花序；花全部管状；缘花雌性，1列，纤细， 2-3齿裂；盘花两性，结实或不孕；花序托裸露或有托毛；瘦果小，有沟纹，无冠毛。头状花序 含同性花的种类已分出另立为絹蒿属。
[0004] 肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种特点突出的病理状态，严重威胁着人类健康。 各种有害因素诸如药物、病毒、酒精、生物等可能致使肝功能有不同程度的损害，从而使肝 脏的解毒、排泄功能及贮备和再生能力降低，肝血流量减少，代谢负荷加重，从而发生内环 境紊乱，肝细胞坏死和凋亡，进而造成肝损伤。各种有害因素导致的肝损伤主要有药物性肝 损伤、病毒性肝损伤、酒精性肝损伤、免疫性肝损伤等类型，全世界有数十亿人曾经或正忍 受着肝损伤的痛苦。以病毒性肝损伤病因中的乙型肝炎病毒为例，全世界有20亿人感染过 乙型肝炎病毒（HBV)，其中3. 78亿人转化成慢性感染，0. 5-1. 2亿人死于肝硬化、肝衰竭、肝 癌等。药物性肝损伤、酒精性肝损伤患者也同样不计其数。肝损伤的长期存在往往会导致 肝纤维化，是进而诱发肝硬化，肝功能衰竭，甚至肝癌的重要始动因素。因此预防和治疗肝 细胞损伤是临床上肝病治疗的重要环节之一，是抑制肝纤维化、肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积、 肝硬化以及肝癌等疾病发生和发展的基础。
[0005] 治疗和预防肝损伤，在临床上没有特别好的办法。因此目前临床上对疗效明确、副 作用低的抗肝损伤药物的需求十分强烈。万年蒿是在吉林省延边地区有着广泛应用基础的 具有鲜明特点的一个朝药。万年蒿为菊科蒿属植物万年蒿ArtemisiasacrorumLedeb.的 干燥地上部分，在长白山地区应用万年蒿膏剂，预防和治疗各种肝损伤疾病，有悠久的民间 应用历史。在治疗胁痛等肝炎症状时，老百姓愿意选用万年蒿作为首选药物。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种万年蒿提取物及其制备方法和用途。
[0007] 本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的万年蒿提取物中包含总黄酮化合物。万年蒿提取物中总黄酮化合物含量 大于50% (重量百分比含量）。
[0009]所述的总黄酮化合物包括下列化合物的一种或几种：6_甲氧基-槲皮万寿菊 素-7_〇- 0 -D-匍萄糖苷、懈皮素-3_〇- 0 -D匍萄糖苷、异鼠李素、万寿菊素-3_〇- 0 -D-匍 萄糖苷、金合欢素-7-0-P-D-葡萄糖苷、芦丁、5，7，4'-三羟基黄酮、3，3 '，4 '，5，7-五羟基 黄酮、5,7,4'-三羟基-3'-甲氧基黄酮、山奈酚、3,5,7,4'-四羟基-6-甲氧基黄酮、 3'，4'，5,7_四羟基黄酮、5,7,4，-三羟基_6,3，-二甲氧基黄酮、5,7,4，-三羟基-6-甲 氧基黄酮、槲皮苷、7,3'，4'-三甲基槲皮素、5-羟基_7,4'-二甲氧基黄酮、5,4'-二 羟基-7-甲氧基黄酮芜花素、5,7_二羟基-4'-甲氧基黄酮、5,7,3'-二羟基-4-甲氧基 黄酮及其衍生物。
[0010] 本发明的万年蒿提取物的制备方法如下：以万年蒿干品或者新鲜采集的万年蒿的 地上部分为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、聚酰胺柱层析法、正相柱 层析法、反相柱层析法，凝胶工艺中的一种或多种工艺，并结合浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干 燥制备成万年蒿提取物。
[0011] 在溶剂提取法和溶剂萃取法中，选用水、甲醇、乙醇、正丁醇、或其它低级脂肪醇中 的一种或几种做溶媒，在室温浸提或超声提取，或加热下浸提或者回流提取，提取次数是一 次或者多次。
[0012] 大孔吸附树脂法中，选用常压或加压柱层析，树脂采用HPD-100、HPD-300、D-101、 X-5、H103、AB-8，DA-201、HPD-400、NKA-9、S-8、HPD-500 型号的树脂，洗脱溶剂采用水、甲醇、 乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗 脱或梯度洗脱。
[0013] 聚酰胺柱层析法中，选用常压或加压柱层析，所用柱填料为聚酰胺，洗脱溶剂采用 水、甲醇、乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时进行固定 浓度的洗脱或梯度洗脱。
[0014] 反相柱层析法中，选用常压或加压柱层析，洗脱溶剂采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含 含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
[0015] 正相柱层析法中，选用常压或加压柱层析，洗脱溶剂采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙 酯、石油醚、正丁醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗 脱。
[0016] 本发明的万年蒿提取物具有预防和治疗脂肪肝、药物性肝损伤、病毒性肝损伤、酒 精性肝损伤和/或免疫性肝损伤疾病的功效。
[0017] 本发明的万年蒿提取物可以制成用于治疗肝损伤的保健品或药物，所述的药物是 将所述的化合物以及药学上可接受的药物制成液体、固体、半固体，口服或非口服，胶囊剂、 散剂、丸剂、片剂、口服液、注射剂等药学上可接受的任何剂型。
[0018] 本发明的药物能够抑制肝纤维化、肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积、肝硬化以及肝癌等 疾病的发生和发展。
[0019] 本发明得到的药物的活性成分是从万年蒿提取得到，其来源广泛，对肝损伤具有 显著的疗效。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是95%EE(万年蒿提取物一部分）细胞增殖和脂质蓄积的影响的示意图。
[0021] IfepG2细胞以不同浓度（0,25,50，100iig/ml)的95%EE处理24h。细胞增殖以 MTS法进行测试（A)。IfepG2细胞以不同浓度（0,25,50，100iig/ml)的95%￡￡处理2处，然 后用OilRed0染色。IfepG2细胞以不同浓度（0,25,50，100iig/ml)的95%EE处理24h， 甘油三酯含量以分光光度法进行测试并表达成Ug甘油三酯/mg蛋白质（C)。数据表达成 平均值土S.E。#，*#分别代表和未处理的对照组相比p< 0. 01和p< 0. 001。
[0022] 图2是50%￡￡，95%￡￡和1￡(各为万年蒿提取物一部分）对11印62细胞中41^1( 和ACC磷酸化的影响的示意图。
[0023] 细胞以50%EE，95%EE和WE以标示浓度分别处理24h。提取蛋白质并用pAMPK， △1^1(，口八(1^(^，和0-3(31：；[11抗体进行蛋白质印迹分析。0-3(31：；[11蛋白水平用做；[1^611^1 control0
[0024] 图3是95%EE对HepG2细胞中AMPK和ACC磷酸化的影响的示意图。
[0025] 细胞以100iig/ml95%EE在不同的标示时间里进行处理（A)。细胞以不同的标 示浓度的95%EE处理24h(B)。细胞以compoundC预处理2h，然后用95%EE处理24h(C， 〇)。提取蛋白质并以口六1^1(，六1^1(4六〇：，六〇：和0-&(^111进行蛋白质印迹分析。0- &(^111 蛋白质水平用做internalcontrol。数据表达成平均值土S.E(n= 3)，**代表和未经处 理的对照组相比，P < 0.01。
【具体实施方式】
[0026] 下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0027] 实施例1.万年蒿提取物的制备方法
[0028] 取500g干品万年蒿加入水浸泡0. 5_3h后加热0. 5_3h，过滤得到滤液I，残渣中加 水再加热〇. 5_3h，得到滤液II，合并滤液I和II，得到万年蒿水提液。将万年蒿水提液上样 于预处理过的大孔吸附树脂柱中，依次用水和10% -95%乙醇洗脱。10% -95%乙醇洗脱液 浓缩后冷冻干燥至干，即得到万年蒿提取物。
[0029] 实施例2.万年蒿提取物中总黄酮含量测定
[0030] 黄酮标准曲线：
[0031] 试剂：芦丁，甲醇
[0032] 芦丁对照品溶液配制
[0033] 精密称取5.0mg芦丁，加甲醇，溶解并定容至100ml，即得50iig/ml。
[0034] 吸取芦丁对照品溶液 0,1. 0ml，2. 0ml，3. 0ml，4. 0ml，5. 0ml，6. 0ml，7. 0ml，于 10ml 容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，测定波长：360nm。结果如下：
[0035] y= 0. 1371x+0. 0093R2 = 0. 9999
[0036] 供试品（万年蒿50%乙醇洗脱物）溶液的制备：
[0037] 取样品溶液1ml于蒸发皿中，加lg聚酰胺粉吸附，于恒温干燥箱中，50°C挥干溶 齐U，转入层析柱中，用30ml石油醚洗脱，弃去石油醚，再用100ml甲醇洗脱总黄酮，收集洗脱 液，加压蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至25ml容量瓶中，即得。
[0038] 供试品吸光度测定：
[0039] 取1ml供试品聚酰胺粉洗脱物，放入25ml容量瓶中，加甲醇定容至25ml，再从 25ml中取出lml，加甲醇稀释10倍，测吸光度为0. 316,计算得到总黄酮含量为28. 115mg/ ml〇
[0040] 换算结果：
[0041] 总黄酮成分含量为68. 2 %。
[0042] 实施例3.万年蒿提取物中化学成分的分离和结构鉴定
[0043] 万年蒿提取物采用二氯甲烷、乙酸乙酯等溶液进行萃取，萃取液分别通过反相硅 胶柱、S印hadexLH-20凝胶柱、制备型HPLC、0DS低压柱等各种分离方法，经甲醇-水等系 统梯度洗脱，分离得到20个黄酮类化合物。通过波谱解析和文献对照，确定其化学结构分 别为：1)6_甲氧基-槲皮万寿菊素-7-0-P-D-葡萄糖苷、2)槲皮素-3-0-P-D葡萄糖苷、 3)异鼠李素、4)万寿菊素-3-0-0-D-葡萄糖苷、5)金合欢素-7-0-0-D-葡萄糖苷、6)芦 丁、7)5,7,4'-三羟基黄酮、8)3,3'，4'，5,7-五羟基黄酮、9)5,7,4'-三羟基-3'-甲氧 基黄酮、10)山奈酚、11)3,5,7,4'-四羟基-6-甲氧基黄酮、12)3'，4'，5,7_四羟基黄酮、 13)5,7,4'-三羟基_6,3'-二甲氧基黄酮、14)5,7,4'-三羟基-6-甲氧基黄酮、15)槲 皮苷、16)7,3'，4'-三甲基槲皮素、17)5-羟基_7,4'-二甲氧基黄酮、18)5,4'-二羟 基-7-甲氧基黄酮芜花素、19)5,7_二羟基-4'-甲氧基黄酮、20)5,7,3'-二羟基-4-甲 氧基黄酮及其衍生物等。
[0044] 万年蒿提取物中黄酮类化合物的波谱数据分别如下：
[0045] 化合物1 :6-甲氧基-槲皮万寿菊素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷
[0046] iH-NMRGOOMHz，（CD3)2C0)Sppm:12. 42(1H，s，5-0H)，7. 89(1H，d，J= 2. 01Hz， H-2'），7. 46(1H，dd，J= 2. 04,8. 34Hz，H-6'），6. 82(1H，d，J= 8. 46Hz，H-5'），6. 47(1H， s，H-8)，5. 12(1H，d，J= 7. 26Hz，H-l"），3. 75(3H，s，6-0CH3).
[0047] 13C-匪R(75MHz，DMS0-d6)Sppm:145. 26 (C-2)，133. 43(C-3)，178. 11 (C-4)， 156. 72 (C-5)，131. 70 (C-6)，152. 84 (C-7)，94. 22 (C-8)，151. 98 (C-9)，104. 76 (C-10)，122.06(01 ' )，116.64(C-2 ' )，157.95(C-3 ' )，148.91(C-4 ' )，115.65(C-5 ')， 121. 67 (C-6 ' )，101. 31 (C-l ")，74.55 (C-2 ")，76.96 (C-3 ")，70.41 (C-4 ")， 78.02(C-5" )，61.45(C-6" )，60.43(6-0CH3).
[0048] 化合物2 :槲皮素-3-0- 0 -D葡萄糖苷
[0049] iH-NMRGOOMHz^DsOD)Sppm:7.68(lH，dd，J= 2. 10Hz，H-2,），7.56(lH，dd，J= 2. 1，9. 00Hz，H-6'），6. 83(lH，d，J= 8. 40Hz，H-5'），6. 36(lH，d，J= 2. 10Hz，H-8)，6. 17(1H， d，J= 2. 10Hz，H-6)，5. 23 (1H，d，J= 7. 20Hz，3-0-glu)，3. 30-3. 71 (m-sugar-H)?
[0050] 13C-NMR(75MHz，CD30D)Sppm:58. 46 (C-2)，135. 60 (C-3)，179. 50 (C-4)， 163. 06(C-5)，99. 87(C-6)，166. 02(C-7)，94.69 (C-8)，159.00 (C-9)，105.68 (C-10)， 123. 06(C-1 ' ),115. 99(C-2 ' ), 145. 91 (C-3 ' ), 149. 85 (C-4 ' ), 117. 54 (C-5 '), 123. 19 (C-6 ' )，104. 20 (C-l ")，75.72 (C-2 ")，78.10 (C-3 ")，71.20 (C-4 ")， 78.39(C-5" ) ,62.53 (C-6" )?
[0051] 化合物3:异鼠李素
[0052] iH-NMRGOOMHz^DsOD)Sppm:7.73(lH，d，J= 2. 10Hz，H-2，），7.63(lH，dd，J= 2. 10,8. 70Hz，H-6，），6. 88 (1H，d，J= 8. 70Hz，H_5，），6. 38 (1H，d，J= 2. 10Hz，H_8)， 6. 18 (1H，d，J= 2. 10Hz，H-6)，3. 59 (3H，s，-〇CH3)?
[0053] 13C-NMR(75MHz，CD30D) :148. 78(C-2)，137. 23(C-3)，177. 34(C-4)，162. 52(C-5)， 99. 28 (C-6)，165. 72 (C-7)，94. 43 (C-8)，158. 25 (C-9)，104. 49 (C-10)，124. 15 (C-1'）， 116. 22(C-2,），147. 99 (C-3,），146. 24 (C-4'），115. 98(C-5'），121. 66(C-6'）， 65. 10(3' -〇CH3)。
[0054] 化合物4 :万寿菊素-3-0- 0 -D-葡萄糖苷
[0055]iH-NMRbOOMHzADpD)Sppm:6. 49(lH，s)，3. 87(3H，s)，7. 70(lH，d，J=2. 00Hz)， 7. 58 (1H, dd, J = 2. 00, 2. 00Hz),6. 86 (1H, d, J = 8. 50Hz),5. 27 (1H, d, J = 7. 50Hz), 5. 27 (1H，d，J=7. 50Hz)，3. 26?3. 57(m，suger-H)。
[0056]13C-NMR(125MHz，CD3OD) :159. 19(C-2)，135. 34(C-3)，179. 76(C-4)，153. 87(C-5)， 132. 80(C-6)，159. 07(C-7)，95. 03(C-8)，153. 87(C-9)，106.12 (C-10)，123.22 (C-l，）， 117. 60(C-2'），145. 92 (C-3,），149. 66 (C-4'），116. 03(C-5,），123. 15(C-6'）， 104.37(01 " )，75.75(C-2 " )，78.39(C-3 " )，71.29(C-4 " )，78.14(C-5 ")， 62. 62 (C-6 " )，60. 96 (6-0CH3)。
[0057] 化合物5 :金合欢素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷
[0058]iH-NMRbOOMHzADpD)Sppm:8. 04 (2H，d，J= 8.00Hz)，7. 11 (2H，d，J= 8.00Hz)， 5. 08 (1H，d，J= 7. 50Hz)，3. 87 (3H，s，0CH3)，3. 22 ?3. 81 (m，sugar-H)。
[0059] 13C-NMR(125MHz，CD30D) :158. 94(C-2)，104. 83(C-3)，179. 14(C-4)，149. 12(C-5)， 103. 58(C-6)，153. 82(C-7)，77. 57(C-8)，144. 87(C-9)，1005. 30(C-10)，123.00 (C-l，），134. 77 (C-2,），117. 49(C-3,），145. 19(C-4,），116. 41(C-5'），123. 40 (C-6,）， 104.73(01 " )，70.51(C-2 " )，75.05(C-3 " )，61.82(C-4 " )，77.14(C-5 ")， 61.40(C-6" )，49.83(4'-0CH3)。
[0060] 化合物6:芦丁
[0061] iH-NMRbOOMHz，CD30D)Sppm:8. 03(1H，d，J= 9. 00Hz)，7. 58(1H，dd，J= 1. 00， 1. 00Hz), 6. 95 (1H, d, J = 8. 50Hz), 4. 98 (1H, d, J = 8. 00Hz), 4. 54 (1H, br s), 1. 08 (3H, d, J = 6. 0Hz，0CH3)，3. 35 ?4. 52 (m，sugar-H)。
[0062] 13C-NMR(125MHz，CD30D) :149. 40(C-2)，133. 30(C-3)，178. 87(C-4)，154. 01 (C-5)， 101. 88(C-6)，158. 90 (C-7)，77. 18(C-8)，152. 56(C-9)，106. 89(C-10)，123.59 (C-l，）， 116. 40(C-2,），134. 54 (C-3,），145. 07 (C-4'），117. 60(C-5,），123. 10(C-6,）， 104.78(01 " )，73.19(C-2 " )，76.31(C-3 " )，71.42(C-4 " )，75.00(C-5 ")， 61. 37 (C-6/7 ),l〇3.65(C-r" " ),70.84(C-3/" ),71.57(C-4/"), 68. 29 (C-5'"),17. 54(C-6/") 〇
[0063] 化合物7 :5，7，4'-三羟基黄酮
[0064] iH-NMRbOOMHz，DMS0-d6)Sppm:6. 19(1H，d，J= 2. 1Hz，H-6)，6. 48(1H，d，J= 2. 1Hz，H-8)，6. 74(1H，s，H-3)，6. 92(2H，d，J= 8. 8Hz，H-3，，H-5，），，7. 90(2H，d，J= 8.8Hz,H-2/ ).
[0065] 13C-NMR(125MHz,DMS〇-d6) 8ppm：164. 17(C-2) , 103. 04 (C-3) , 181. 77 (C-4), 157. 48 (C-5)，98. 90 (C-6)，163. 88 (C-7)，94. 16 (C-8)，161. 22 (C-9)，103. 77 (C-10)，121.38(C-1/ ),128. 56(C-2 ' ),116. 05 (C-3 ' ),161. 06 (C-4 ' ),116. 05 (C-5 '), 128. 56(C-6').
[0066] 化合物8 :3, 3'，4'，5, 7-五轻基黄酮
[0067] iH-NMRGOOMHzADWD)Sppm:6. 18(lH，d，J= 2. 0Hz，H-6)，6. 38(lH，d，J= 2. 0Hz， H-8)，7. 73(1H，d，J= 2. 1Hz，H-2，），6. 88(1H，d，J=8. 52Hz，H-5，），7. 63(1H，dd，J= 2. 19,8. 52Hz，H-6').
[0068] 13C-NMR(75MHz，CD30D)Sppm:147. 99 (C-2)，137. 24(C-3)，177. 34(C-4)， 158. 23 (C-5)，99. 22 (C-6)，162. 52 (C-7)，94. 39 (C-8)，165. 58 (C-9)，104. 52 (C-10)， 148. 77(C-1/ ),115. 98(C-2 ' ), 124. 14 (C-3 ' ), 146. 22 (C-4 ' ), 116. 22 (C-5 '), mKc-e' )?
[0069] 化合物9:5, 7,4'-三羟基-3'-甲氧基黄酮
[0070] iH-NMRbOOMHz，CD30D) S ppm :3. 97(3H，s，-〇CH3)，6. 19(1H，d，J = 2. 0Hz，H-6)， 6. 44(1H，d，J = 2. 0Hz，H-8)，6. 61(1H，s，H-3)，6. 90(1H，d，J = 8. 5Hz，H-5' ), 7. 48 (1H, d，J = 2.0Hz,H-2，），7.52(lH，dd，J = 8.5,2.0Hz，H-6，）?
[0071]13C-NMR(125MHz，CD30D)Sppm:160. 89 (C-2)，104. 15 (C-3)，183. 79 (C-4)， 163. 13(C-5)，123. 75 (C-6)，166. 09 (C-7)，95.31 (C-8)，156. 19(C-9)，105. 39 (C-10)， 124. 69(C-1 ' ), 110. 70(C-2 ' ), 149. 58 (C-3 ' ), 152. 52 (C-4 ' ), 116.86(C-5 '), 121. 77 (C-6' ), 56. 72 (-〇CH3).
[0072] 化合物10:山奈酚
[0073] iH-NMRbOOMHzADWD)Sppm:6. 18(lH，d，J= 2. 0Hz，H-6)，6. 40(lH，d，J= 2. 0Hz， H-8)，6.90(2H，d，J= 9.0Hz，H-3，，H-5，），8.09(2H，d，J= 9.0Hz，H-2，，H-6，）?
[0074] 13C-NMR(125MHz，CD30D)Sppm:148. 15(C-2)，137. 17(C-3)，177. 44(C-4)， 158. 35 (C-5)，99. 38 (C-6)，165. 77 (C-7)，94. 55 (C-8)，162. 53 (C-9)，104. 56 (C-10)， 123. 81(C-1 ' ),130. 69(C-2 ' ), 116. 35 (C-3 ' ), 160. 57 (C-4 ' ), 116. 35 (C-5 '), 130. 69 (C-6').
[0075] 化合物11 :3, 5, 7,4'-四羟基-6-甲氧基黄酮
[0076] iH-NMRbOOMHz，CD30D)Sppm:3. 87(3H，s，-〇CH3)，6. 48(1H，s，H-8)，6. 89(2H，d，J =8. ) ,8. 07(2H,d,J=8.8Hz,H-2' ).
[0077] 13C-NMR(125MHz,CD30D)8ppm：148. 39 (C-2) , 136. 85 (C-3) , 177. 64 (C-4), 153. 67 (C-5)，132. 27 (C-6)，158. 50 (C-7)，94. 80 (C-8)，152. 98 (C-9)，105. 01 (C-10)， 123. 77(C-1/ ), 130. 72(C-2 ' ), 116. 33 (C-3 ' ), 160. 60 (C-4 ' ), 116. 33 (C-5 '), 130. 72 (C-6' ), 60. 99 (-OCH3).
[0078] 化合物12 :3'，4'，5, 7-四羟基黄酮
[0079] iH-NMRbOOMHz，CD30D)Sppm:7. 42(1H，dd，J= 2. 0,8. 0Hz，H-6，），7.39(lH，d， J= 2. 0Hz，H-2' )，6. 94(1H，d，J= 8. 5Hz，H-5' )，6. 75(1H，s，H-3)，6. 44(1H，d，J= 2. 0Hz，H-8)，6. 20(1H，d，J= 2. 0Hz，H-6).
[0080]13C-NMR(125MHz，CD30D)Sppm:164. 73 (C-2)，104. 62 (C-3)，183.66(C-4)， 162. 33 (C-5)，99. 78 (C-6)，165. 61 (C-7)，94. 75 (C-8)，158. 25 (C-9)，103. 89 (C-10)， 122.31(C-1/ ), 114. 22(C-2 ' ), 146. 78 (C-3 ' ), 150. 71 (C-4 ' ), 116. 01 (C-5 '), 120. 46 (C-6').
[0081] 化合物13:5,7,4，-三羟基-6,3，-二甲氧基黄酮
[0082] iH-NMRbOOMHz，CD30D)Sppm:3. 96(3H，s，-〇CH3)，3. 88(3H，s，-〇CH3)，6. 56(1H，s, H-3)，6. 61(1H，s，H-8)，7. 45(1H，d，J= 2. 0Hz，H-2，），6. 92(1H，d，J=8. 35Hz，H-5，）， 7.49(lH，dd，J= 2.0,8.35Hz，H-6，）?
[0083]13C-NMR(125MHz，CD30D)Sppm:166. 24(C-2)，103. 80 (C-3)，184. 23 (C-4)， 154. 70 (C-5)，132. 97 (C-6)，158. 90 (C-7)，95. 38 (C-8)，154. 70 (C-9)，105. 78 (C-10)， 123.78(C-1/ ), 110. 75(C-2 ' ), 149. 52 (C-3 ' ), 152. 13 (C-4 ' ), 116. 81 (C-5 '), 121. 76 (C-6' )，56. 71 (_0CH3)，60. 94 (_0CH3) ?
[0084] 化合物14:5, 7,4'-三羟基-6-甲氧基黄酮
[0085]iH-NMRbOOMHz，CD30D)Sppm:3. 89(3H，s，-〇CH3)，6. 58(1H，s，H-3)，6. 67(1H，s， H-8)，6.92(2H，d，J= 8.75Hz，H-3，，H-5，），7.84(2H，d，J= 8.75Hz，H-2，，H-6，）?
[0086] 13C-NMR(125MHz，CD30D) S ppm :164. 46 (C-2)，102. 46 (C-3)，184. 31 (C-4)， 152. 69 (C-5)，131. 70 (C-6)，，157. 66 (C-7)，94. 17 (C-8)，152. 69 (C-9)，104. 87 (C-10)，122.14(C-1' )，128.45(C-2' )，1116.15(03' )，161.32(C-4' )，116.15(C-5')， 128. 45 (C-6').
[0087] 化合物15 :槲皮苷
[0088] iH-NMRGOOMHz，Acetone-d6) S ppm :6. 25(1H，d，J = 2. 07Hz，H-6)，6. 46(1H，d，J =2. 07Hz，H-8)，7. 49(1H，d，J = 2. 07Hz，H-2，），7. 39(1H，dd，J = 2. 1，8. 34Hz，H-6，）， 6. 98(1H，d，J = 8. 34Hz，H-5' )，5. 28(1H，d，J = 1. 5Hz，H-l" )，3. 72(1H，dd，J = 3. 4， 9.4Hz，H-3" )，3.34-3.43(2H，m，H-4"，H-5" )，0.91((3H，d，J = 5.7Hz，-CH3).
[0089] 13C-匪R(75MHz，Acetone-d6)S ppm:158. 15(C-2)，135. 63(C-3)，179. 18(C-4)， 163. 06 (C-5)，99. 35 (C-6)，164. 77 (C-7)，94. 35 (C-8)，157. 63 (C-9)，105. 75 (C-10)， 122. 43(C-1 ' ),115. 99(C-2 ' ), 145. 68 (C-3 ' ), 148. 85 (C-4 ' ), 116. 56 (C-5 '), 122. 73 (C-6 ' ),l〇2. 57(C-1"), 71. 26 (C-2"), 71. 97 (C-3"), 72. 86 (C-4"),71.19(C-5" )，17.63(C-6" )?
[0090] 化合物16 :7,3'，4'-三甲基槲皮素
[0091] iH-NMRGOOMHzADCipS ppm:13. 08(lH，s，5-0H)，7. 53(lH，dd，J =8. 50,2. 00Hz， H-e' ) ,7. 34(1H,d,J= 2. 00Hz,H-2' ), 6. 98 (1H,d,J= 8. 50Hz,H-5' ),6. 61(1H,s, H-8), 6. 58 (1H,s,H-6), 4. 05 (3H,s, 0CH3), 3. 98 (3H,s, 0CH3), 3. 97 (3H,s, 0CH3).
[0092] 化合物17:5-羟基-7,4'-二甲氧基黄酮
[0093] iH-NMRGOOMHzJDCip S ppm :7. 87 (2H，d，J = 8.85Hz，H-2，，6，），7.04 (2H，d，J =8. 85Hz，H-3，，5，），6. 60(1H，s，H-3)，6. 51(1H，d，J = 2. 10Hz，H-8)，6. 39(1H，d，J = 2. 10Hz，H-6)，3. 91 (3H，s，0CH3)，3. 90 (3H，s，0CH3) ?
[0094] 13C-匪R(75MHz，DMS0-d6)Sppm:164. 51 (C-2)，104. 41 (C-3)，182. 47 (C-4)， 162. 24 (C-5)，98. 04 (C-6)，165. 29 (C-7)，92. 64 (C-8)，157. 06 (C-9)，104. 92 (C-10)， 123. 63(C-1 ' ),128. 06(C-2 ' ), 114. 65 (C-3 ' ), 162. 61 (C-4 ' ), 114. 52 (C-5 '), 128. 06 (C-6，），55. 79 (0CH3)，55. 54 (0CH3) ?
[0095] 化合物18 :5,4'-二羟基-7-甲氧基黄酮
[0096]iH-NMRGOOMHzJMSO-cOSppm:3. 86 (3H，s，0CH3)，6.37 (lH，d，J= 2.08Hz，H-6)， 6. 76(1H，d，J= 2. 08Hz，H-8)，6. 86(1H，s，H-3)，7. 11(2H，d，J= 8. 85Hz，H-3，，5，）， 8. 02(2H,d,J= 8. 85Hz,H-2' ,6' ), 10. 63 (1H,br.s, 4' -OH), 12. 93 (1H,s, 5-〇H).
[0097] 化合物19 :5, 7-二羟基-4'-甲氧基黄酮
[0098] iH-NMRGOOMHzJMSO-cOSppm:3. 87 (3H，s，0CH3)，6.20 (lH，d，J= 1.80Hz，H-6)， 6. 50(1H，d，J= 1. 80Hz，H-8)，6. 84(1H，s，H-3)，6. 93(2H，d，J= 8. 70Hz，H-3，，5，）， 7.95(2H，d，J= 8.70Hz，H-2，，6，），10.63(lH，br.s，4，-0H)，12.97(lH，s，5-0H).
[0099] 化合物20 :5，7，3'-二羟基-4-甲氧基黄酮
[0100] 1H-NMR(300MHz,ACETONE) 8ppm：6. 14 (1H,s, 6-H), 6. 44 (1H,s, 8-H), 6. 50 (1H, s, 3-H), 7. 00 (1H,d,J= 8. 40Hz, 5 ' -H), 7. 37 (1H,d,J= 1. 80Hz, 2 ' -H), 7. 41 (1H,m, 6' -H), 12. 86(1H,s,5-0H) ,3. 82(3H, 8,4' -〇CH3).
[0101] 万年蒿提取物中黄酮类化合物的化学结构式如下：
[0102]
【权利要求】
1. 万年蒿提取物，其特征在于：所述的万年蒿提取物中含有总黄酮化合物。
2. 如权利要求1所述的万年蒿提取物，其特征在于：万年蒿提取物中总黄酮化合物含 量大于50%。
3. 如权利要求1所述的万年蒿提取物，其特征在于：所述的总黄酮化合物包括下列化 合物的一种或几种：6-甲氧基-槲皮万寿菊素-7-0-β -D-葡萄糖苷、槲皮素-3-0-β -D 匍萄糖苷、异鼠李素、万寿菊素_3_〇- β -D-匍萄糖苷、金合欢素-7_〇- β -D-匍萄糖苷、芦 丁、5,7,4'-三羟基黄酮、3,3'，4'，5,7-五羟基黄酮、5,7,4'-三羟基-3'-甲氧基黄 酮、山奈酚、3,5,7,4'-四羟基-6-甲氧基黄酮、3'，4'，5,7_四羟基黄酮、5,7,4'-三羟 基_6,3'-二甲氧基黄酮、5,7,4'-三羟基-6-甲氧基黄酮、槲皮苷、7,3'，4'-三甲基 槲皮素、5_羟基_7,4'-二甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-7-甲氧基黄酮芜花素、5,7_二羟 基-4'-甲氧基黄酮、5,7,3'-二羟基-4-甲氧基黄酮及其衍生物。
4. 如权利要求1-3任一项所述的万年蒿提取物的制备方法，其特征在于：以万年蒿干 品或者新鲜采集的万年蒿的地上部分为原料，采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂 法、聚酰胺柱层析法、正相柱层析法、反相柱层析法，凝胶工艺中的一种或多种工艺，并结合 浓缩干燥、冷冻干燥、喷雾干燥制备成万年蒿提取物。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：溶剂提取法和溶剂萃取法中，选用水、 甲醇、乙醇、正丁醇、或其它低级脂肪醇中的一种或几种做溶媒，在室温浸提或超声提取，或 加热下浸提或者回流提取，提取次数是一次或者多次。
6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：大孔吸附树脂法中，选用常压或加压柱 层析，树脂采用 HPD-100、HPD-300、D-101、Χ-5、Η103、AB-8, DA-201、HPD-400、NKA-9、S-8、 HPD-500型号的树脂，洗脱溶剂采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或含水丙 酮中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
7. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：聚酰胺柱层析法中，选用常压或加压柱 层析，所用柱填料为聚酰胺，洗脱溶剂采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或 含水丙酮中的一种或多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
8. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：反相柱层析法中，选用常压或加压柱 层析，洗脱溶剂采用水、甲醇、乙醇、丙酮或含含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮中的一种或多 种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
9. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：正相柱层析法中，选用常压或加压柱层 析，洗脱溶剂采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、二氯甲烷、氯仿中的一种或 多种，洗脱时进行固定浓度的洗脱或梯度洗脱。
10. 如权利要求1-3任一项所述的万年蒿提取物在预防和治疗脂肪肝、药物性肝损伤、 病毒性肝损伤、酒精性肝损伤和/或免疫性肝损伤疾病中的用途。
【文档编号】A61P37/02GK104257715SQ201410549512
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】朴光春, 元海丹 申请人:朴光春