一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法，属于医药或功能食品制备【技术领域】。该方法是首先将牛乳白蛋白进行脱钙处理，形成去折叠化状态，然后采用不饱和脂肪酸通过阴离子交换层析技术对乳白蛋白组分进行适当的分子修饰，形成乳蛋白脂肪酸修饰物，此修饰物经体外细胞模型试验，证明其可显著诱导人乳腺癌细胞凋亡（包括雌激素受体阳性和阴性细胞），但对正常人乳腺细胞无显著影响。本发明可为开发乳腺癌防治药物及抗乳腺癌的功能食品提供支持，同时也为乳清蛋白的高值化利用以及配方奶粉的优化提供新的参考，对于促进乳品的精深加工也具有积极的意义。
【专利说明】一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法，具体涉及一种诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法。属于医药或功能食品制备【技术领域】，利用本发明制备的牛乳蛋白脂肪酸修饰物可诱导人乳腺癌细胞的凋亡，而对正常人乳腺细胞无显著影响。
【背景技术】
[0002]癌症已经成为危害人类身体健康的第一杀手，并成为全球最大的公共卫生问题之一，癌症发病率逐年上升，预计到2020年全球每年将有1600万新增癌症患者，每年有1000万人死于癌症(国际抗癌联盟Π(Χ，2011)。
[0003]虽然世界各国对癌症的研究投入了巨大的财力、物力和人力，但总体来说对癌症的治疗研究进展缓慢，人类对绝大部分晚期肿瘤仍然束手无策，癌症治疗费用居高不下，因此，欧美等一些发达国家已逐步将研究的重心从治疗转向预防，越来越重视癌症预防药物以及抗癌功能食品的研究与开发。长期以来，我国将本就有限的卫生资源过度集中于晚期癌症的治疗，而忽视癌症的预防，每年癌症病人的医疗费用高达千亿，占全国医疗卫生总费用的20%以上。
[0004]世界卫生组织指出，三分之一甚至一半以上的癌症都是可以预防的。而且癌症预防的成本，也远远低于癌症治疗的成本。近些年来，癌症化学预防，即利用天然或者合成的化合物来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展过程的手段，越来越受到重视。从食物中寻找各种抗癌因子并开发相应的预防药物或功能食品、辅助治疗食品等成为重要的课题。其中蛋白质及其结合物类抗癌物质由于无毒副作用，受到越来越多的关注和重视。
[0005]乳腺癌是严重威胁人们生命健康的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤发病率和死亡率的首位。我国发病率近五年来增长了三倍；在北京、上海、广州等大城市，其发病率以每年2%?8%的速度递增且趋向年轻化(中国抗癌协会，2011)。因此，开发针对乳腺癌高发人群的预防药物和抗癌功能食品具有重要的意义。
[0006]瑞典医学家Hakansson在研究母乳如何防止细菌及病毒粘附至婴儿呼吸道和胃肠道粘膜时，偶然发现了一个惊喜的结果:母乳中经不饱和脂肪酸修饰的乳蛋白能选择性地杀死某些癌细胞，而不会杀死正常细胞。此后一些研究者采用人乳蛋白通过体外制备的方法成功获得具有诱导细胞凋亡作用的人乳蛋白脂肪酸修饰物。然而，由于人乳白蛋白主要存在于人类母乳中，来源非常有限，难以较大规模的制备。如果能够采用牛乳蛋白代替人乳蛋白获得具有人乳蛋白脂肪酸修饰物类似的抗癌活性的牛乳蛋白脂肪酸修饰物，将为开发乳腺癌防治药物及抗乳腺癌的功能食品带来广阔的前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物及其制备方法。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物采用不饱和脂肪酸通过阴离子交换层析技术对乳蛋白组分进行适当的分子修饰，形成乳蛋白脂肪酸修饰物，此修饰物经体外细胞模型试验，证明其可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，但对正常乳腺细胞无显著影响。其制备方法包括如下步骤:
(1)在温室下，将乳白蛋白溶于0.05?lmmol/L EDTA, l(T20mmol/L Tris-HCl,ρΗ8.(Γ8.5溶液中，(T4°C过夜以去除Ca2+，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α -乳白蛋白；蛋白质终浓度调节至5(Γ?20μΜ;
(2)在温室下，将不饱和脂肪酸(油酸或亚油酸)混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入l(T20mmOl/L Tris-HCl (pH8.0?8.5)，溶液内乙醇终浓度不超过2% (V/V)，油酸或亚油酸的终浓度控制在50(Γ?800μΜ范围；
(3)将步骤(2)所述的溶液加入至DEAE-Sepharosefast flow阴离子柱,采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散；
(4)将步骤(I)所述乳白蛋白溶液加入至经步骤(3)所述脂肪酸预处理的阴离子柱中，并采用低离子浓度梯度:0.2M NaCl, 1mM Tris, ρΗ8.(Γ8.5洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液:1M NaCl，1mM Tris, ρΗ8.0?8.5洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，至少换4次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。
[0009]上述的牛乳蛋白组分来自以新鲜牛乳或乳粉为原料分离纯化所得到的α -牛乳白蛋白或重组型α-牛乳白蛋白，其纯度达到电泳纯。
[0010]上述的不饱和脂肪酸为油酸或亚油酸。
[0011]上述的乳腺癌细胞包括雌激素受体阳性和雌激素受体阴性乳腺癌细胞。
[0012]步骤(4)所述的α-乳白蛋白和脂肪酸的摩尔浓度控制在1:1(Γ15。
[0013]本发明所制备的牛乳蛋白脂肪酸修饰物能显著诱导人乳腺癌细胞(包括雌激素受体阳性和雌激素受体阴性)。
[0014]本发明的有益效果是:
(1)该修饰物经体外细胞模型试验，证明其可显著诱导人乳腺癌细胞凋亡(包括雌激素受体阳性和阴性细胞)，但对正常人乳腺细胞无显著影响；
(2)该修饰物的开发为开发乳腺癌防治药物及抗乳腺癌的功能食品奠定了基础，同时也为乳清蛋白的高值化利用以及配方奶粉的优化提供新的参考，对于促进乳品的精深加工也具有积极的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为MTS法检测乳蛋白脂肪酸修饰物对人乳腺癌细胞的毒性影响；图々采用的细胞模型为雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7，图B采用雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231为细胞模型；从图中可以看出乳白蛋白油酸修饰物(BLA-OA) 50-400 μ g/ml浓度下对两种乳腺癌细胞均具有显著的细胞毒性，而乳白蛋白(BLA)和油酸(OA)单独处理并未表现出明显的细胞毒性；
图2为MCF-7和MDA-MB-231细胞经乳蛋白脂肪酸修饰物处理后置于倒置镜下观察到的细胞形态，处理100 μ g/ml乳蛋白脂肪酸修饰物处理24小时后，两种细胞生长均受到抑制，并出现贴壁生长细胞典型的凋亡形态变化现象，细胞由贴壁而脱落，浮悬于培养液中，细胞体积缩小，变圆，核颜色加深，细胞透明度和细胞粘附力降低；
图3为MCF-7和MDA-MB-231细胞经乳蛋白脂肪酸修饰物处理后在荧光显微镜下观察细胞核染色后的形态；从图中可以看出两种乳腺癌细胞模型经400 μ g/ml作用后(24小时)，可观察到细胞核浓染，且向周边集聚，有呈半月形，有的出现了 DNA荧光碎片，呈颗粒块状荧光的凋亡细胞。未加药的正常对照组细胞胞核呈现弥散均匀荧光，形态无明显变化；
图4为经不同浓度乳蛋白脂肪酸修饰物处理24小时后的DNA琼脂糖凝胶电泳结果；从图中可以看出经50和100μ g/ml乳蛋白脂肪酸修饰物处理后，两种细胞的DNA经凝胶电泳均可以看到典型的DNA ladder，且处理浓度高者出现的梯状条带更明显；
图5为流式细胞仪检测细胞周期的分布；图A采用的细胞模型为雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7，图B采用雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231为细胞模型；从图中可以看出乳白蛋白油酸修饰物处理后，两种乳腺癌细胞中均可看到sub-Gl期细胞显著增加，且呈剂量依赖型。
【具体实施方式】
[0016]下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0017]实施例1
在温室下，将乳白蛋白溶于0.05mM EDTA, 1mM Tris-HCl，pH8.5溶液中，0?4°C过夜以去除Ca2+，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α-乳白蛋白；蛋白质终浓度为100 μ M ;在温室下，将油酸混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入1mM Tris-HCl (ρΗ8.5)，溶液内乙醇终浓度不超过2% (V/V)，油酸的终浓度为500 μ M ;将上述脂肪酸溶液加入至DEAE-S印harose fast flow阴离子柱，采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散；将上述乳白蛋白溶液加入至经脂肪酸预处理的阴离子柱中；并采用低离子浓度梯度(0.2M NaCiaOmM Tris，pH8.5)洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液(1M NaCl, 1mM Tris,pH8.5)洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，换4次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。
[0018]实施例2
在温室下，将乳白蛋白溶于lmmol/L EDTA, 20mM Tris_HCl，pH8.0溶液中，0?4°C过夜以去除Ca2+，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α-乳白蛋白；蛋白质终浓度为50μΜ;在温室下，将油酸混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入20mM Tris-HCl (pH8.0)，溶液内乙醇终浓度不超过2% (V/V)，油酸的浓度为800 μ M ;将上述脂肪酸溶液加入至DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱,采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散；将上述乳白蛋白溶液加入至经脂肪酸预处理的阴离子柱中；并采用低离子浓度梯度(0.2M NaCiaOmM Tris，pH8.0)洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液(1M NaCl, 1mM Tris, pH8.0)洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，换5次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。
[0019]实施例3
在温室下，将乳白蛋白溶于0.08mM EDTA, 15mM Tris-HCl，pH8.2溶液中，0?4°C过夜以去除Ca2+，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α-乳白蛋白；蛋白质终浓度为120 μ M ;在温室下，将亚油酸混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入15mM Tris-HCl (pH8.2)，溶液内乙醇终浓度不超过2% (V/V)，亚油酸的终浓度为1800 μ M ;将上述脂肪酸溶液加入至DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱,采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散；将上述乳白蛋白溶液加入至经脂肪酸预处理的阴离子柱中；并采用低离子浓度梯度(0.2M NaCiaOmM Tris，pH8.5)洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液(1M NaCiaOmM Tris, pH8.5)洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，换6次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。
[0020]实施例4
在温室下，将乳白蛋白溶于0.07mM EDTA, 12mM Tris-HCl，pH8.1溶液中，0?4°C过夜以去除Ca2+，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α-乳白蛋白；蛋白质终浓度为60 μ M ;在温室下，将亚油酸混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入12mM Tris-HCl (pH8.4)，溶液内乙醇终浓度不超过2% (V/V)，亚油酸的终浓度为1000 μ M ;将上述脂肪酸溶液加入至DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱,采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散；将上述乳白蛋白溶液加入至经脂肪酸预处理的阴离子柱中；并采用低离子浓度梯度(0.2M NaCiaOmM Tris，pH8.4)洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液(IM NaCl，1mM Tris, pH8.4)洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，换4次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。
[0021]实施例5
在温室下，将乳白蛋白溶于0.09mM EDTA, 18mM Tris-HCl，pH8.4溶液中，0?4°C过夜以去除Ca2+，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α-乳白蛋白；蛋白质终浓度为100 μ M ;在温室下，将亚油酸混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入18mM Tris-HCl (pH8.1 )，溶液内乙醇终浓度不超过2% (V/V)，亚油酸的终浓度为1500 μ M ;将上述脂肪酸溶液加入至DEAE-S印harose fast flow阴离子柱，采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散；将上述乳白蛋白溶液加入至经脂肪酸预处理的阴离子柱中；并采用低离子浓度梯度(0.2M NaCiaOmM Tris,pH8.1)洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液(1M NaCiaOmM Tris, pH8.1)洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，换5次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。
【权利要求】
1.一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物，其特征在于:此修饰物是采用不饱和脂肪酸通过阴离子交换层析技术对牛乳蛋白组分进行分子修饰，形成的乳蛋白脂肪酸修饰物，此修饰物经体外细胞模型试验，证明其可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，但对正常乳腺细胞无显著影响。
2.根据权利要求1所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物，其特征在于:所述的牛乳蛋白组分来自以新鲜牛乳或乳粉为原料分离纯化所得到的α-牛乳白蛋白或重组型α-牛乳白蛋白，其纯度达到电泳纯。
3.根据权利要求1所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物，其特征在于:所述的不饱和脂肪酸为油酸或亚油酸。
4.根据权利要求1所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物，其特征在于:所述的乳腺癌细胞包括雌激素受体阳性和雌激素受体阴性乳腺癌细胞。
5.一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物的制备方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)在温室下，将乳白蛋白溶于0.05?lmmol/L EDTA、l(T20mmol/L Tris-HCl,ρΗ8.(Γ8.5溶液中，(T4°C过夜以去除Ca2+，经蛋白超滤管浓缩得到去折叠状态的脱钙α -乳白蛋白；蛋白质终浓度调节至5(Γ?20μΜ; (2)在温室下，将不饱和脂肪酸混合到无水乙醇中，超声充分溶解，制成脂肪酸储液；使用前取储液加入ΡΗ8.(Γ8.5，1(T20M Tris-HCl的缓冲液，得到脂肪酸溶液； (3)将步骤(2)所述溶液加入至DEAE-Sepharosefast flow阴离子层析柱,采用NaCl梯度洗脱对脂肪酸进行分散； (4)将步骤(I)所述脱钙α-乳白蛋白的水溶液5(Γ?20μΜ加入至经步骤(3)所述脂肪酸预处理的阴离子层析柱中，并采用低离子浓度梯度洗脱分别除去未结合的脂肪酸和乳蛋白，然后经高盐缓冲液洗脱，洗脱液经3.5Ku透析袋除盐，换4-6次水，最后冷冻干燥即得牛乳蛋白脂肪酸修饰物。
6.根据权利要求5所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的脂肪酸溶液内乙醇终浓度不超过2% (V/V)，不饱和脂肪酸的终浓度控制在50(Γ?800μΜ范围。
7.根据权利要求5所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物的制备方法，其特征在于:步骤(4)所述的低离子浓度梯度为0.2Μ NaCiaOmM Tris,ρΗ8.0?8.5。
8.根据权利要求5所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物的制备方法，其特征在于:步骤(4)所述的高盐缓冲液为IM NaCl, 1mM Tris, ρΗ8.(Γ8.5。
9.根据权利要求5所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物的制备方法，其特征在于:步骤(4)所述的α-乳白蛋白和脂肪酸的摩尔浓度控制在1:10?15。
10.根据权利要求5或6所述的一种可诱导人乳腺癌细胞凋亡的牛乳蛋白脂肪酸修饰物的制备方法，其特征在于:所述的不饱和脂肪酸为油酸或亚油酸。
【文档编号】A61K38/40GK104399065SQ201410551755
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】钟赛意, 刘寿春, 谌素华, 王维民, 秦小明 申请人:广东海洋大学