一种含重组hCREG蛋白的医疗器械及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种含重组hCREG糖蛋白的医疗器械，其表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白，在该医疗器械中重组hCREG糖蛋白可与多种药物联合使用，医疗器械在植入人体以后，通过器械载带的重组hCREG糖蛋白的持续释放来抑制血管平滑肌细胞增殖，并促进血管壁再内皮化，使损伤血管壁迅速愈合，从而防止医疗器械管腔内血栓的发生，减少病人术后服用抗血栓和血小板药物的时间。
【专利说明】-种含重组hCREG蛋白的医疗器械及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物工程和生物工程医疗器械的制备，具体地说，涉及一种含重 组hCREG蛋白的医疗器械及其制备方法。属于生物工程和植入体内的介入医疗器械领域。 技术背景
[0002] 心血管疾病严重威胁着人类健康，据WHO报道，每年因心血管疾病死亡的人数 高达全球死亡总数的30%。经心血管介入植入手术时治疗严重心血管疾病的主要趋 势，但是介入瓣膜，封堵器，支架等医疗器械易造成血栓和赘生物的形成，发生血管狭窄 (restenosis, RS)，影响手术成功率，显著降低手术获益。
[0003] 研究表明，血管内皮功能损伤和血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell，VSMCs)过度增殖/迁移是RS发生的重要环节。介入术后血管再狭窄的原因尚不完 全清楚，目前认为血管内皮功能损伤正是RS重要的始动因素。近年研究发现，血管内皮细 胞（endothelial cells, Ecs)不仅是内膜表面的单层细胞，同时是一个具有内分泌功能的 器官，保证完整的血管内皮结构对维持血管稳态具有重要意义。
[0004] 大量研究证实，动脉中膜VSMCs向内膜的增殖/迁移是RS发展并最终形成的关键 环节。当血管壁受到球囊或支架损伤后，动脉中膜VSMCs表型发生改变（由静息/收缩状 态转变为增殖/合成表型），VSMCs不断增殖并向内膜迁移，同时过度合成和分泌大量细胞 外基质，导致血管新生内膜形成并引起再狭窄。
[0005] 鉴于ECs和VSMCs在介入术后RS发生中的重要地位，寻找有效靶点加速损伤内皮 的修复和/或抑制VSMCs的过度增殖/迁移已成为目前RS防治研究领域的两大主要方向。 [0006]目前，装载血管平滑肌细胞增殖抑制剂（雷帕霉素及其类似物、紫杉醇）的药物洗 脱支架（drug-eluting stent，DES)是临床预防再狭窄最常用的治疗手段。尽管DES的应 用有效降低了术后短期内的再狭窄发生率，但研究表明，DES在抑制血管平滑肌细胞增殖的 同时也延缓了内皮修复，从而引起支架内膜化不完全、血栓形成等心血管不良事件，最终削 弱了其抗再狭窄的远期疗效。
[0007] 近来，越来越多的学者将目光投向了具有生物相容性的蛋白类药物涂层支架上。 目前国内外在研的蛋白洗脱支架主要有：1.抑制血管损伤后炎症反应类支架，包括装载 TNF-α抗体支架、装载环状R⑶多肽支架等；2.加速血管内皮化进程的血管内皮生长因子 (bFGF和VEGF)释放支架；3.通过抗凝和保持正常凝血平衡而抑制局部血栓形成的补体蛋 白C释放支架等。
[0008] 2007年，世界知名心血管病专家Serruys在"医疗器械5-10年展望"中提出：生物 可吸收并兼备"抑制增生"和"加速内皮化"功能的支架将是未来5-10年理想支架的标准。
[0009] 人 ElA 激活基因阻遏子（cellular repressor of ElA-stimulated genes, CREG) 是1998年美国哈佛大学医学院Gill从子宫颈内膜癌Hela细胞cDNA文库中克隆的一个新 的转录相关调控因子。其早期研究认为，CREG可与外源性腺病毒蛋白E1A、哺乳动物体内转 录因子E2F家族蛋白竞争性结合在靶基因的启动子区，阻遏ElA蛋白和E2F对靶基因的转 录并抑制细胞增殖。进一步研究发现，CREG属于小分子量分泌型糖蛋白，在分化成熟的组 织细胞中广泛表达，但在未分化组织如胚胎干细胞和畸胎瘤细胞中表达水平很低。Veal等 将外源性CREG基因导入体外培养的肿瘤细胞中，发现CREG基因表达可以显著抑制肿瘤细 胞增殖并诱导其分化；同样地，在没有特异性诱导剂存在的情况下，添加分沁型的CREG蛋 白可以单独诱导体外培养ES细胞和畸胎瘤细胞向神经细胞分化。上述研究提示：CREG作 为小分子量的分泌型糖蛋白，可以诱导并维持组织或细胞分化。
[0010] 本发明研究人员自1999年应用mRNA差异显示技术，首次从体外培养的人胸廓内 动脉VSMCs中成功克隆了人CREG基因，经过数年的一系列基础研究证实：
[0011] I. CREG表达与体外培养VSMCs的增殖及分化高度相关，提示CREG参与了 VSMCs分 化表型的转化调控。VSMCs在去血清体外培养时呈CREG高表达状态，其分化表型标志物表 达同时增高，而在加入血清刺激后（即：体外模拟血管内膜损伤造成VSMCs暴露），VSMCs中 CREG的表达明显降低，其分化表型标志物表达随之下调；应用逆转录病毒载体介导外源性 CREG过表达后发现，体外培养VSMCs的增殖明显受抑，细胞呈现分化表型；相反，通过反义 RNA技术抑制VSMCs中CREG的表达后，VSMCs分化能力明显减弱、增殖能力和凋亡能力均显 著增加。
[0012] 2. CREG参与了血管正常生理功能的维持，其表达下调可能是血管病理损伤的始动 机制之一。关于CREG在病理损伤血管中的表达研究发现，CREG在正常哺乳动物血管壁大 量表达，并且在血管ECs中的表达强度显著高于VSMCs ;体外实验证实CREG过表达可以促 进内皮细胞的迁移和增殖，同时升高VEGF的表达，血管病理损伤后，CREG蛋白在血管壁的 表达明显下调，CREG蛋白的表达抑制效应在血管ECs中表现更为显著，提示CREG参与了血 管内皮的损伤修复反应。
[0013] 3.动物在体实验表明，CREG过表达有利于减少介入术后RS的发生。大鼠颈动脉 经球囊拉伤后，CREG表达与损伤血管中的VSMCs增殖能力呈负相关；通过逆转录病毒和腺 病毒载体分别介导CREG基因过表达发现，球囊损伤后大鼠及兔颈动脉新生内膜的形成受 到显著抑制，有效降低了 RS的发生。
[0014] 本发明研究人员与哈佛大学医学院Gill实验室研究证实CREG蛋白是成熟生物体 内维持组织和细胞分化的重要分子，在肿瘤细胞诱导分化和抑制损伤血管VSMCs去分化、 促进内皮功能恢复中均具有积极的生物学功能。因此，发明人提出设想：以CREG为切入点， 深入探讨介入术后RS的发生机制，并开发新型的重组人源性ElA激活基因阻遏子（human cellular repressor of ElA-stimulated genes, hCREG)生物蛋白洗脱支架。
[0015] 蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的重要方式，生物体内大约50%的蛋 白质都是糖基化蛋白，包括酶、载体蛋白、激素、毒素、各种凝集素和结构蛋白等。作为分泌 型糖蛋白，hCREG蛋白在合成过程中进行正确的糖基化修饰是其保证其具有正常结构和功 能的基本条件。Veal等研究发现，CREG为分泌型糖蛋白，通过自分泌和旁分泌发挥其生物 学功能；Alessandra Di Bacco研究也证实，CREG诱导的细胞生长抑制依赖于M6P/IGF2R， 而M6P/IGF2R优先与糖基化的CREG结合，只有极少量与非糖基化的CREG结合。上述研究 提示，无论从生物相容性、经济实效性以及效应最大化的角度而言，成功获取人源性hCREG 糖蛋白对于未来新型支架的临床应用研究都至关重要。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的是提供一种含重组hCREG糖蛋白的医疗器械，支架表面分布的重组 hCREG糖蛋白可持续释放来抑制血管壁平滑肌细胞增殖，并促进血管再内皮化，促进损伤血 管壁的愈合，防止支架内血栓的发生，减少病人术后服用抗血栓和血小板药物的时间。
[0017] 本发明的另一目的是提供一种含重组hCREG糖蛋白的医疗器械的制备方法。
[0018] 本发明的再一目的是提供一种含重组hCREG糖蛋白的血管洗脱支架在抑制血管 壁平滑肌细胞增殖、防治血管再狭窄中的应用。
[0019] 为了实现本发明目的，本发明提供一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架，其采用 重组hCREG糖蛋白均匀涂布于血管洗脱支架表面。
[0020] 所述重组hCREG糖蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0021] 1)重组基因载体的构建：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开 放读码框，终止密码突变的hCREG RT-PCR引物如下：上游引物为5' -aa ggatcc atggccgggctatcccgc-3'（SEQ ID NO. 1)，下游引物为：5，-gc gaattc Gcactgaactgtgacat tataatattcttctgg-3'（SEQ ID勵.2)，其中大写字母代表0/6突变的终止密码。构建带有 his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3. 1-his/myc-hCREG。重组hCREG蛋 白氨基酸序列（SEQ ID NO. 3)如下：
[0022] MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDffD EASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDW GALATISTLEAVRGRPFAD VLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTN FCKKHGFDPQ SPLCVHIMLSGTVTKVNETEMDIAKHSLFIRHPEM KTffPSSHNWFFAKLNITNIffVLDYFGGPKIVTPEEYYNVTV QCEF CRYPAQffRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH
[0023] 2)重组人源性 CREG 蛋白的表达应用 lipofectamine2000 将 pcDNA3. 1-his/ myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收 集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分 析法进行重组CREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮 兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度。
[0024] 3)蛋白提纯根据6XHis亲和层析原理，应用Ni-NTA柱（美国Invitrogen公司） 纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱（GE Healthcare Bio-Sciences AB)脱 盐。
[0025] 4)重组蛋白生物学活性鉴定将纯化的重组CREG蛋白添加于10%血清培养的 VSMCs培养基中，用流式细胞仪分析细胞周期观察重组CREG蛋白对VSMCs增殖的影响，鉴定 重组CREG蛋白的生物学活性。
[0026] 所述重组hCREG糖蛋白可以与选自于下述各类药物活性组分的一种或几种联合 使用：免疫抑制剂及抗炎药物、抗增殖药物、促再内皮化药物、抗细胞迁移药物、细胞间基质 调节剂以及其他细胞外基质蛋白。
[0027] 所述抗增殖药物包括西罗莫司，他克莫司，艾罗莫司，免疫抑制剂ABT-578,地塞米 松，咪唑立宾，雷帕霉素，紫杉醇及其衍生物，放线菌素，长春新碱及其衍生物，他汀类药物， 2-氯去氧腺苷，核酶，巴马司他，溴氯哌喹酮，普罗布可，可选用其中任一种或几种。
[0028] 药物层由一种或多种药物组成，药物层和重组hCREG糖蛋白的分布为层状结构， 或为支架外管腔和支架内管腔两个不同表面分别分布药物层和重组hCREG糖蛋白层。
[0029] 本发明所述医疗器械，其金属材料选自钛、钴、钽、镍钛合金、镍钛锘合金、医用不 锈钢、医用可降解合金材料如铝镁合金，也可以选用聚合物材料，其包括可降解或不可降解 材料，可降解材料如PCL、PGA、PLLA、PCLA、PLGA等。
[0030] 所述医疗器械表面均勻分布0. 5 μ m-5 μ m的微孔。
[0031] 通过微孔吸附的药物/蛋白洗脱支架，微孔的大小决定了蛋白/药物的承载量。微 孔越大，承载量越大，但是微孔的存在不能影响支架的功能和物理性能。研究表明，孔径应 不大于撑柱和桥筋宽度的5%。应根据所选支架的支架丝宽度决定微孔的孔径。本发明综 合市场上的支架性能参数，确定了可接受的孔径范围为〇. 5 μ m-5 μ m。
[0032] 医疗器械的重组hCREG或药物涂层不含聚合物载体，其直接分布在材料表面或表 面的微孔中。材料内、外表面均可，可以单独涂一面，也可以内外两面都涂；可以内外两面涂 同一种药物，也可内外两面涂不同的药物。
[0033] 本发明所述医疗器械的制备方法，其采用如下任意方法制成：
[0034] 将重组hCREG与药物分别溶于溶剂中，通过直接喷涂、浸涂或者两种方法联用等 方法涂覆于医疗器械表面；
[0035] 或采用静电喷涂或者阳极极化方法喷涂或浸涂到支架表面。浸泡48小时终止吸 附，_55°C真空干燥机中冻干。
[0036] 其中，用于重组hCREG的溶剂为蒸馏水、生理盐水、pH值为3. 0-9. 0的硼酸盐缓冲 溶液、pH值为8. 0-10. 0碳酸盐缓冲溶液、pH值为3. 0-9. 0醋酸盐缓冲溶液、浓度为1-20% 的乙醇溶液或pH值为3. 0-9. 0磷酸盐缓冲溶液。
[0037] 重组 hCREG 的浓度为 0· 01-1. 6mg/ml。优选 I. 6mg/ml。
[0038] 药物的溶剂为链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代 烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等等，可以优选丙酮、四氢呋喃、三氯甲烷、二氯甲 烧。
[0039] 本发明所述的静电喷涂或者阳极极化喷涂或浸涂的方法，可采用CN101337093A 公开的方法进行。
[0040] 本发明所述的医疗器械可以为心脏瓣膜，心脏封堵器，血管支架，人造血管，导管， 起搏器，起搏器导子，除颤器等医疗器械中的一种或多种医疗器械的组合。
[0041] 本发明含重组hCREG的血管洗脱支架在用于抑制血管壁平滑肌细胞增殖、防治血 管再狭窄中的应用。
[0042] 本发明通过支架表面分布的重组hCREG的持续释放来抑制血管壁平滑肌细胞增 殖，并促进血管再内皮化，促进损伤血管壁的愈合，防止支架内血栓的发生，减少病人术后 服用抗血栓和血小板药物的时间。
[0043]目前蛋白/药物洗脱支架一般选用聚合物作为载体，但是经过长期临床试验，聚 合物作为载体的缺点逐渐被发觉。用聚合物做载体，增加了支架壁厚，影响通过性。聚合 物载体一般载药量偏低，单一满足治疗浓度，释放机制为表面脱附，难以克服突释严重的现 象，而且，药物释放完毕后，聚合物载体留存在支架表面，从而引起晚期的过敏和炎症，这将 成为晚期血栓的重要原因。另一方面，未加保护的蛋白质在疏水性高分子涂层上的不可逆 吸附，很容易导致蛋白质变性失活，不可降解的聚合物及抗增生药物影响内皮覆盖是血栓 形成的主要原因。
[0044] 本发明采用无载体涂覆技术，可以避免载体带来的过敏和炎症反应，药物释放后 成为裸支架，导致晚期血栓和炎症的可能性更低，安全性高。若是采用完全可降解支架，在 介入术后的一段时间内，支架使血管得到机械性支撑，并借助洗脱出的药物，防止再狭窄。 之后支架即缓慢降解，并完全被组织完全吸收，晚期支架血栓的发生应该降低，无需长期的 抗血小板药物治疗，没有后顾之忧。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1为本发明获得纯化的重组野生型CREG-myc/his融合蛋白的电泳分析，显示蛋 白纯度在95%以上。
[0046] 图2为本发明重组hCREG糖蛋白洗脱支架体外洗脱曲线，横坐标为释放的时间，纵 坐标为支架上重组hCREG糖蛋白的残留百分比。
[0047] 图3为HE染色显示4周时裸金属支架组内膜明显增厚。Metal是金属裸支架组， SRL为雷帕霉素洗脱支架组，CREG为重组hCREG洗脱支架组。
[0048] 图4为⑶31染色显示4周时重组hCREG组内皮化程度明显增强。Metal:金属裸 支架组，SRL雷帕霉素洗脱支架组，CREG :重组hCREG洗脱支架组。
[0049] 图5为本发明支架电镜图。其中A图为纳米微孔裸支架电镜图，B图为重组hCREG 糖蛋白洗脱支架电镜图。
【具体实施方式】
[0050] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0051] 实施例1重组hCREG糖蛋白及其冠脉支架的制备
[0052] -、制备微米孔重组hCREG糖蛋白洗脱支架
[0053] I. 1重组hCREG糖蛋白的制备
[0054] I. I. 1重组基因载体的构建自1999年应用mRNA差异显示技术，首次从体外培养 的人胸廓内动脉VSMCs中成功克隆了人CREG基因，用RT-PCR技术扩增终止密码突变的 hCREG开放读码框，终止密码突变的hCREG RT-PCR引物如下：上游引物为5' -aa ggatcc atggccgggctatcccgc-3'（SEQ ID NO. 1)，下游引物为：5，-gc gaattc Gcactgaactgtgacat tataatattcttctgg-3'（SEQ ID勵.2)，其中大写字母代表0/6突变的终止密码。
[0055] 构建带有his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3. 1-his/ myc-hCREG。重组hCREG蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO. 3)如下：
[0056] MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDffD EASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDW GALATISTLEAVRGRPFAD VLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTN FCKKHGFDPQ SPLCVHIMLSGTVTKVNETEMDIAKHSLFIRHPEM KTffPSSHNWFFAKLNITNIffVLDYFGGPKIVTPEEYYNVTV QCEF CRYPAQffRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH
[0057] I. L 2 重组人源性 CREG 蛋白的表达应用 lipofectamine2000 将 pcDNA3. 1-his/ myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收 集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分 析法进行重组CREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮 兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度。
[0058] I. I. 3蛋白提纯根据6XHis亲和层析原理，应用Ni-NTA柱（美国Invitrogen公 司）纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱（GE Healthcare Bio-Sciences AB) 脱盐。
[0059] I. 1. 4重组蛋白生物学活性鉴定将纯化的重组CREG蛋白添加于10%血清培养的 VSMCs培养基中，用流式细胞仪分析细胞周期观察重组CREG蛋白对VSMCs增殖的影响，鉴定 重组CREG蛋白的生物学活性结果说明hCREG能够显著地抑制VSMCs的增殖。
[0060] 2纳米微孔重组hCREG糖蛋白洗脱支架的制备
[0061] 2. 1纳米微孔金属裸支架的选择采用乐普（北京）医疗器械股份有限公司的纳米 微孔金属裸支架，该支架是在316L不锈钢金属裸支架的基础上，采用通用的电化学腐蚀的 方法使不锈钢金属裸支架的表面形成微米孔洞，微米孔大小在〇. 5 μ m-5 μ m之间。
[0062] 2. 2制备重组hCREG蛋白洗脱支架利用微米孔洞的物理作用吸附原理，通过立体 喷涂及浸入，溶剂采用pH为9. 6 (0. 05mol/l)的碳酸钠缓冲溶液中，将金属裸支架负载重组 hCREG糖蛋白液（I. 6mg/ml，于浸泡48小时终止吸附，-55。。真空干燥机中冻干。
[0063] 2. 3蛋白吸附效率测定
[0064] 采用1251放射性标记单抗的方法hCREG糖蛋白液在支架上的吸附及其在一定流 量下的释放进行了定量的检测。绘制体外蛋白释放曲线。见图2。
[0065] 从图2可以看出载有重组hCREG糖蛋白的支架在2小时测定时，支架表面的蛋白 含量为原始包被含量的85%，随后平稳下降，在28天以后，支架表面的蛋白含量仍然有原 始包被含量的12%。
[0066] 实施例2药物蛋白联合支架的制备
[0067] 本实施例的冠脉支架表面均匀分布有重组hCREG糖蛋白和雷帕霉素药物。雷帕霉 素药物分布在支架外层，支架内管腔分布本申请的重组hCREG糖蛋白。
[0068] 配置有微米孔的支架：其支架采用316L医用不锈钢基质，表面均匀配置有500 nm 左右的微孔。
[0069] 制备三面雷帕霉素药物支架：用丙酮溶液配置浓度为1 %的雷帕霉素药物。保护 支架的内表面，在支架的外表面喷涂雷帕霉素药物。
[0070] 制备重组hCREG蛋白洗脱支架：利用微米孔洞的物理作用吸附原理，将重组hCREG 糖蛋白固定到支架的内管腔。溶剂采用pH为9. 6(0. 05 mol/1)的碳酸钠缓冲溶液中，使金 属裸支架负载重组hCREG糖蛋白液（1.6 mg/ml)，于浸泡后48小时后终止吸附，-55°C真空 干燥机中冻干。
[0071] 此药物蛋白联合支架结合了药物支架和蛋白支架的优点，用于治疗严重血管狭 窄，可以同时达到抑制内膜增生和加速血管内皮化的疗效，减少服用抗血栓药物的剂量和 周期，将优于单纯药物支架或单纯蛋白支架的效果。
[0072] 实施例3双药物蛋白联合支架的制备
[0073] 本实施例的冠脉支架表面均匀分布有重组hCREG糖蛋白、雷帕霉素和紫杉醇药 物。雷帕霉素和紫杉醇药物分布在支架外表面，支架内管腔分布重组hCREG糖蛋白。
[0074] 配置有微米孔的支架：其支架采用316L医用不锈钢基质，表面均匀配置有500 nm 左右的微孔。
[0075] 制备三面雷帕霉素药物支架：保护支架的内表面，在支架的外表面喷涂雷帕霉素 和紫杉醇药物，药物浓度为I %，药物溶剂采用四氢呋喃，雷帕霉素和紫杉醇药物之间的质 量比值1 :1。
[0076] 制备重组hCREG蛋白洗脱支架（药物在外表面，蛋白在内表面）：利用微米孔 洞的物理作用吸附原理，将重组hCREG糖蛋白固定到支架的内管腔。溶剂采用pH为 9. 6(0. 05mol/l)的碳酸钠缓冲溶液中，使将金属裸支架负载重组hCREG糖蛋白液（1.0 mg/ ml)，于浸泡后48小时后终止吸附，-55°C真空干燥机中冻干。
[0077] 此双药物蛋白联合支架可以抑制血管新生内膜增生，加速血管内皮细胞修复，用 来治疗严重的心血管狭窄效果良好。
[0078] 实施例4完全可降解药物蛋白联合支架的制备
[0079] 采用北京乐普医疗的完全可降解聚合物支架，在其表面均匀分布有重组hCREG糖 蛋白。药物分布在支架外表面，重组hCREG糖蛋白分布在支架内管腔。可降解聚合物支架 表面无微孔。
[0080] 制备三面雷帕霉素药物支架：用丙酮溶液精确配置浓度为1 %的雷帕霉素药物， 保护支架内表面，在外表面喷涂雷帕霉素药物。
[0081] 制备重组hCREG糖蛋白洗脱支架：溶剂采用pH为9. 6(0. 05mol/l)的碳酸钠缓冲 溶液，重组hCREG糖蛋白液浓度为0.01 mg/ml。用超声波立体喷涂技术将hCREG糖蛋白固 定到支架的管腔。
[0082] 本实施例的完全可降解药物蛋白联合支架可以抑制血管新生内膜增生，加速血管 内皮细胞修复，而且完全可吸收，用来治疗严重的心血管狭窄，可以减少抗血栓药物的服用 量，加速治愈，效果较好。
[0083] 试验例1重组hCREG糖蛋白洗脱支架的生物学效能评价
[0084] 1、重组hCREG糖蛋白洗脱支架的生物学效能评价
[0085] I. 1研究对象选择沈阳农业大学良种场培养的健康良种小型猪，雄性，月龄9-10 月，体重30-40公斤。
[0086] 1. 2实验分组分为纳米微孔金属裸支架组（METAL)【乐普（北京）北京医疗器械 股份有限公司】，雷帕霉素药物洗脱支架组（SRL)【Nano,乐普（北京）北京医疗器械股份有 限公司】及重组hCREG蛋白洗脱支架组（CREG)(本发明实施例1的支架）。分别在每头猪 的前降支、右冠及回旋支各植入一枚支架，支架随机置入，每组15枚支架，4周时处死，取标 本。
[0087] 1. 3支架置入模型的建立
[0088] I. 3. 1术前准备术前3天始每日喂服阿司匹林（300mg/d)和氯批格雷（75mg/d)。
[0089] 1. 3. 2麻醉肌注戊巴比妥0. 5mg/kg及氯胺酮10mg/kg麻醉动物。动物麻醉后仰卧 固定于手术台，建立静脉通路，气管插管及呼吸机辅助呼吸。
[0090] 1. 3. 3冠脉造影局部消毒后，穿刺右股动脉，经穿刺针送入导引钢丝，沿钢丝送入 6F股动脉鞘，经鞘管给予肝素200U/kg。经鞘管送入6F右冠指引导管分别行左右冠状动脉 造影。
[0091] 1. 3. 4支架植入术选择血管的近中段作为支架植入处，尽量避开分支血管。支架与 血管直径之比为I. 1?1. 2:1，选取靶血管时尽量避开大的血管分支。在体外用压力泵充 盈球囊至8 ATM释放支架，持续10s，待支架完全贴壁后撤出球囊。术后复查造影。撤出导 管，拔出股动脉鞘，术区局部加压止血。猪清醒后送回笼中继续喂养。
[0092] 2.新型支架抗RS发生的生物学效能评价
[0093] 2. 1复查时肉眼观察是否存在动脉瘤及支架内血栓，计算RS发生率。
[0094] 2. 2组织学处理介入术后的2周和4周分别复查冠脉造影，之后处死动物，即刻开 胸取出心脏，肉眼观察支架周围的心肌是否存在坏死、纤维化等表现。分离支架置入处冠状 动脉血管，留做组织学分析或Western blot用。
[0095] 2. 3形态学分析
[0096] A.将血管中的支架抽出，制成厚度5 μ m石蜡切片。苏木素-伊红（HE)染色，光镜 下观察VSMC的移行、增殖及内膜厚度变化，拍照以作记录。
[0097] B.将图像摄入计算机图像分析系统中进行图像编辑，测算外弹力膜内横截面积 (external elastic lamina area, EEL 截面积）、内弹力膜内横截面积（Intimal elastic lamina area，IEL截面积）、血管腔面积、新生内膜面积、中膜面积、管腔狭窄百分比及内膜 与中膜面积比。
[0098] 2. 4计算血管损伤积分
[0099] 评估血管损伤程度，评分方法如下：
[0100] 〇分：内弹力膜完好未受压；1分：内弹力膜受压，变形〈45° ;
[0101] 2分：内弹力膜受压，变形>45° ;3分：内弹力膜受压撕裂；4分：外弹力膜受压撕 裂。血管截面的损伤积分为单个金属柱杆积分的平均值。根据支架金属柱周围粒细胞数计 算炎症积分，〇分：无炎症细胞；
[0102] 1分：1_10个；2分：11-20个；3分> 20个，血管截面的炎症积分为单个金属柱杆 积分的平均值。具体见表1。
[0103] 表14周组形态学分析
[0104]
【权利要求】
1. 一种含重组hCREG糖蛋白的医疗器械，其特征在于，医疗器械的表面有重组hCREG糖 蛋白或其衍生物，所述重组hCREG蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2. 根据权利要求1所述的医疗器械，其特征在于，所述医疗器械是心脏瓣膜，心脏封堵 器，血管洗脱支架，人造血管，导管，起搏器，起搏器导子，除颤器等医疗器械中的一种或多 种医疗器械的组合。
3. 根据权利要求1所述的医疗器械，其特征在于，所述重组hCREG糖蛋白是通过如下步 骤制备得到的： 1) 重组hCREG蛋白表达载体的构建：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放 读码框，引物如SEQ ID NO. 1、2所示；构建带有his标签蛋白的重组hCREG蛋白表达载体 pcDNA3. 1-his/myc-hCREG ； 2) 重组 hCREG 蛋白的表达：应用 lipofectamine2000 将 pcDNA3. 1-his/myc-hCREG 转 染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收集细胞培养 上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组hCREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分析法进行重 组hCREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组hCREG蛋白的定性，考马斯亮兰染色聚 丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度； 3) 蛋白提纯：应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱脱盐。
4. 根据权利要求1所述的医疗器械，其特征在于，所述重组hCREG糖蛋白可以与选自于 下述各类药物组分的一种或几种联合使用：免疫抑制剂及抗炎药物、抗增殖药物、促再内皮 化药物、抗细胞迁移药物、细胞间基质调节剂以及其他细胞外基质蛋白。
5. 根据权利要求4所述的医疗器械，其特征在于，所述抗增殖药物包括以下任一种或 几种：西罗莫司，他克莫司，艾罗莫司，免疫抑制剂ABT-578,地塞米松，咪唑立宾，雷帕霉 素，紫杉醇及其衍生物，放线菌素，长春新碱及其衍生物，他汀类药物，2-氯去氧腺苷，核酶， 巴马司他，溴氯哌喹酮，普罗布可。
6. 根据权利要求4所述的医疗器械，其特征在于，药物和重组hCREG糖蛋白的分布为层 状结构，或在两个不同表面分别分布药物和重组hCREG糖蛋白。
7. 根据权利要求1-6任意一项所述的医疗器械，其特征在于，医疗器械表面均匀分布 0? 5 y m_5 y m 的微孔。
8. 制备权利要求1-7任意一项所述医疗器械的方法，其特征在于，其采用如下方法制 成： 将重组hCREG糖蛋白与药物分别溶于溶剂中，通过直接喷涂、浸涂或二者结合的方法 分别涂覆于医疗器械表面； 或采用静电喷涂或者阳极极化方法浸涂到医疗器械表面。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用于重组hCREG的溶剂为蒸馏水、生理盐 水、pH值为3. 0-9. 0的硼酸盐缓冲溶液、pH值为8. 0-10. 0碳酸盐缓冲溶液、pH值为3. 0-9. 0 醋酸盐缓冲溶液、浓度为1% -20%的乙醇溶液或pH值为3. 0-9. 0磷酸盐缓冲溶液； 用于药物的溶剂为链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代 烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等等，可以优选丙酮、四氢呋喃、三氯甲烷、二氯甲 烧。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，重组hCREG的浓度为0. 01-1. 6mg/ ml 〇
【文档编号】A61L31/10GK104324420SQ201410564347
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】韩雅玲, 张娜, 邓婕, 闫承慧, 孙鸣宇, 陈永强, 崔凯, 蒲忠杰 申请人:乐普（北京）医疗器械股份有限公司