X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的致病基因及其编码蛋白质和应用的制作方法
【专利摘要】本发明鉴定了与X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病相关的显性致病基因-PHEX基因的新发突变。具体地，发明人以X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病患病家系为研究对象，对该家系中的患病个体和非患病个体进行了外显子组测序和比较，意外地在PHEX基因中发现一个移码缺失突变(c.1553delT,p.F518Sfs*4)，该突变造成其编码的蛋白质的翻译错误并提前中断。在此基础上，本发明提供了突变的PHEX基因及其编码蛋白质和应用，包含突变的PHEX基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。利用该突变的PHEX基因，可以对X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病进行分子诊断和患病风险评价。该突变基因及其编码蛋白质还可作为治疗该类X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的药物靶点。
【专利说明】X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的致病基因及其编码蛋白 质和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人体变异的基因，尤其涉及一种X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病 的致病基因-PffiX基因。本发明还涉及突变的PHEX基因及其编码蛋白质和应用，包含突变 的PHEX基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 低磷酸盐血症性拘偻病（hypophosphatemic rickets, HR)为家族性的或罕见为 获得性的疾病，它与一般佝偻病不同，其发病原因是由于肾小管对磷的再吸收障碍，从而血 磷下降，尿磷增多，肠道对磷、钙的吸收不良而影响骨质钙化，形成佝偻病。其临床特点主 要包括身材矮小、佝偻病、低磷血症、近端肾小管重吸收磷障碍以及活性维生素D生成不足 等。女性患者骨骼疾病较男性为轻，可仅表现为低磷酸盐血症。HR目前发现主要有四种家 系遗传模式，包括X-连锁显性遗传HR (XLHR，MM 307800)，常染色体显性遗传HR (ADHR，MM 193100)，常染色体隐性遗传HR(ARHR1, MM241520,以及ARHR2, MM613312)，罕见的X-连锁 隐性遗传HR(300554)。至今为止，HR已经发现7个易感基因和6个致病基因。
[0003] 其中，X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病（XLHR)是最常见的遗传性佝偻病，发病率约 为1:12000,典型特征为肾小管重吸收磷减少、活性维生素D生成不足以及骨矿化不全。该 病多发生于儿童，主要临床表现为双下肢弯曲、走路无力、腿痛、骨质疏松、生长迟缓以及多 发性骨折。该病在儿童阶段表现为佝偻病，在成人阶段则表现为骨关节畸形。尽管可以通 过手术的方式予以改善症状，但手术治疗会给患儿家庭带来沉重的经济负担，疗效也因人 而异，严重影响患者的生活质量。所以，只有明确其基因突变特点，才能从遗传筛查和基因 诊断及治疗入手，避免患儿出生，纠正遗传缺陷，最终从根本上解决问题。
[0004] XLHR遗传方式多属X连锁显性遗传，其致病基因是位于X染色体上的PHEX基 因（（憐酸盐调节基因，可参见 Holm IA, Huang X，Kunkel LM. Mutational analysis of the PEX gene in patients with X-linked hypophosphatemic rickets[J]. Am J Hum Genet, 1997, 60(4) :790-797)。该基因位于染色体Xp22. 1，包含2247bP跨22个外显子 的编码区，编码一条由749个氨基酸构成的蛋白质。最初该基因被认为可以导致调节磷 平衡的FGF23失活，PHEX蛋白分为N末端的胞质区，很小的跨膜区和大部分的细胞外区， 其中在细胞外区有高度保守的半胱氨酸残基和在17号编码区的Zn结合区。该蛋白属于 II型整合膜锌依赖性肽链内切酶家系，参与骨和牙本质矿化以及肾磷酸盐吸收（可参见： Morey M, PHEXro-Feijoo L, Barreiro J et al. Genetic diagnosis of X-linked dominant Hypophosphatemic Rickets in a cohort study:tubular reabsorption of phosphate and 1, 25(OH)2D serum levels are associated with PHEX mutation type. BMC Med Genet 2011:12:116 ；Carpenter TO, Imel EA, Holm IA et al. A clinician's guide to X-linked hypophosphatemia. J Bone Miner Res 2011:26:1381_1388)。卩册父在鼠骨、鼠牙、 人类胎儿骨、人肺和成人卵巢都是表达PffiX/Phex的mRNA，以骨和牙齿的表达水平最高。 PHEX基因导致低磷血症的机制目前尚不清楚，其中一种解释为该基因突变导致另一种酶代 偿性上调，此酶的过度表达最终导致了 XLHR的表型特征（可参见：任利彬，叶玲.X连锁磷 酸盐调节基因的进展[J].国际口腔医学杂志，2008, 35(4) :399-401)。据文献报道，芬兰地 区的PHEX基因的突变检测率在家系病例中为100% (5/5)，在散发病例中为93% (14/15); 中国台湾汉族人当中PHEX基因的突变检测率在家系中为100% (3/3)，在散发病例中为 43% (3/7)(可参见 Tyynismaa H，Kaitila I，Nanto_Salonen K，Ala_Houhala M，Alitalo T. Identification of fifteen novel PHEX gene mutations in Finnish patientswith hypophosphatemic rickets[J] ? Hum Mutat，2000, 15(4) :383-384 ;Jap TS，Chiu CY，Niu DM, Levine MA. Three novel mutations in the PHEX gene in Chinese subjects with hypophosphatemic rickets extends genotypic variability[J]. Calcified Tissue Int，2011，88(5):370-377)。目前已发现在PHEX基因编码区的突变有329个，包括终止突 变、错义突变、缺失和/或插入、拼接位点突变（WWW. phexdb. mcgill. ca)。
[0005] 最近，外显子组测序（exome sequencing)被成功地应用于发现稀有单基因疾 病的致病基因，如Freeman - Sheldon综合症的MYH3基因，Schinzel-Giedion综合征的 SETBP1基因，以及严重大脑畸形的WDR62突变等（可参见：A. Hoischen，B.W. van Bon，C. Gilissen, P. Arts, B. van Lier, M. Steehouwer, P. de Vries, R. de Reuver, N. Wieskamp, G. Mortier, K. Devriendt, M. Z. Amorim, N. Revencu, A. Kidd, M. Barbosa, A. Turner, J. Smith, C. Oley, A. Henderson, I. M. Hayes, E. M. Thompson, H. G. Brunner, B. B. de Vries, J. A. Veltman,De novo mutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedion syndrome, Nat Genet 42 (2010) 483-485 ；K. Bilguvar, A. K. Ozturk, A. Louvi, K. Y. Kwan, M. Choi, B. Tatli, D. Yalnizoglu, B. Tuysuz, A. 0. Caglayan, S. Gokben, H. Kaymakcalan, T. Barak, M. Bakircioglu, K. Yasuno, W. Ho, S. Sanders, Y. Zhu, S. Yilmaz, A. Dincer, M. H. Johnson, R. A. Bronen, N. Kocer, H. Per, S. Mane, M. N. Pamir, C. Yalcinkaya, S. Kumandas, M. Topcu, M. Ozmen,N.Sestan,R.P.Lifton,M.W. State,M.Gunel,Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain malformations, Nature 467 (2010) 207-210 ；S. B. Ng, E. H. Turner, P. D. Robertson, S. D. Flygare, A. W. Bigham, C. Lee, T. Shaffer, M. Wong, A. Bhattachar jee, E. E. Eichler, M. Bamshad, D. A. Nickerson, J. Shendure，Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes，Nature 461 (2009)272-276)。全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因疾病 候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体（包括患者及 正常对照）的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。
[0006] 因此，本研究利用外显子组测序技术区寻找X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病 (XLHR)的致病基因，以期为XLHR的患者治疗提供全新的理论依据，丰富和完善XLHR疾病的 诊断流程，从而对XLHR患者的临床诊断提供更多的支持和参考。
【发明内容】
[0007] 本发明的主要目的在于利用外显子组测序技术鉴别X-连锁低磷酸盐血症性佝偻 病（XLHR)致病基因新的突变位点。在此基础上，提供突变的PHEX基因及其编码蛋白质和 应用，包含突变的PffiX基因的载体、宿主细胞以及试剂盒，以对X-连锁低磷酸盐血症性佝 偻病进行分子诊断和患病风险评价，为进一步治疗该病提供设计药物的靶点，同时为阐明 该病的致病机制提供理论基础。
[0008] 因此，一方面，本发明提供了一种突变的PHEX基因，所述突变的PHEX基因导致 X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的发生，其基因序列如SEQ ID N0:2所示。野生型PHEX基 因序列如SEQ ID NO: 1所示，编码区具有2250个碱基，与野生型的PHEX基因序列相比，该 突变的PHEX基因发生了移码缺失突变（c. 1553delT，p. F518Sfs*4)，即SEQ ID NO: 1中第 1553位后面紧接着的碱基T缺失了，只有2249个碱基，导致了第1553位后所有的碱基序 列发生移码。从而使得PHEX基因编码的氨基酸序列第518位的苯丙氨酸变成了丝酰胺，第 518位以后的氨基酸序列也发生改变，直至第521位亮氨酸密码子突变为终止密码子，使得 多肽链合成中断。
[0009] 第二方面，本发明还提供了 SEQIDN0:2序列编码的蛋白质，由于突变的PHEX基 因在第1553位后发生了移码缺失突变，导致其编码的氨基酸序列从518位发生变化，到第 521位即终止，使得突变的PHEX蛋白质只有520个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDN0:3所 示。而野生型的PHEX蛋白质序列有749个氨基酸，比突变型的PHEX蛋白质序列长得多。
[0010] 在本发明的第三方面，提供了含有上述突变PffiX基因的载体。
[0011] 在本发明的第四方面，提供了被上述载体转化或转导的宿主细胞或者被上述突变 的PHEX基因直接转化或转导的宿主细胞。
[0012] 在本发明的第五方面，提供了上述的突变的PHEX基因在作为治疗X-连锁低磷酸 盐血症性佝偻病的药物靶点或制备X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病诊断试剂盒中的应用。
[0013] 在本发明的第六方面，提供了一种用于诊断X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的试 剂盒，所述试剂盒包含能够特异性扩增PffiX基因的引物，或能够特异性检测PHEX基因突变 的探针。
[0014] 在一个优选的实施方案中，所述引物或探针序列为SEQ ID NO: 1或2所示的序列 中第1553位前后15?30bp长的序列。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述引物包括上游引物 5, -AGTTGCTCCTTCCTATGCTGA-3，，下游引物 5, -AGACTCCGCTTCTCAC CAAT-3，。
[0016] 在本发明的第七方面，提供了一种抗体，所述抗体与上述SEQ ID N0:2序列编码的 蛋白质特异性结合，且不作用于野生型PffiX基因所编码的蛋白质。
[0017] 在本发明的第八方面，提供了一种X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病治疗剂，所述治 疗剂包含上述所述的抗体。
[0018] 本发明通过外显子组测序技术首次发现了 PHEX基因的新发突变，且有此突变的 PHEX基因可以导致X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的发病。一方面，为XLHR的发病机制研 究奠定重要基础，有可能为XLHR的患者治疗提供全新的理论依据，丰富和完善XLHR疾病的 诊断流程，从而对XLHR患者的临床诊断提供更多的支持和参考；通过检测受试者是否携带 有PHEX基因致病突变，可以早期筛查X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病突变基因携带者，提供 优生优育指导；也可为X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病患者提供新的分子诊断依据。特别 地，本发明所提供的诊断试剂盒可用于快速、有效地预测或诊断X-连锁低磷酸盐血症性佝 偻病。另一方面，本发明可以为治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病提供可能的药物靶点。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是某4代X染色体显性遗传XLHR家系图，其中正方形表示男性，圆圈表示女 性；带斜线表示死亡，实心为患病个体，空心为正常个体；
[0020] 图2为图1所示家系中正常人（III: 3) sanger图；
[0021] 图3为图1所示家系中患者（111:1)杂合p.F518Sfs*4突变sanger图；
[0022] 图4为图1所不家系中（IV: 2)杂合p. F518Sfs*4突变sanger图。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进 行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围以权利要求 书限定的范围为准。
[0024] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语 和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本 发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0025] 在本发明中，"PHEX基因"为磷酸盐调节基因，其基因表达6. 6kb转录子，2247bp编 码序列仅TOEX基因mRNA的35 %，剩余65%为非编码序列（UTRS)。PHEX和中性肤链内切 酶基因家族有高度的同源性，其家族包括中性肤链内切酶、Kell抗原及内皮素转换酶1等。 小鼠骨、小鼠牙齿、人胎儿骨、人肺及成人卵巢都表达Phex/PHEX mRNA，在骨及牙齿检测到 相对高水平的表达。PffiX的生理学相关底物还没有被确切鉴定出，PHEX蛋白质在调节磷酸 盐、维生素D及骨矿物代谢的作用机制是未知的。对PHEX基因突变的研究，国外学者大多 发现了一系列PffiX基因的突变，包括无义突变、错义突变、拼接突变、插入及缺失。经预测 检测到的大部分PHEX突变可能导致截短的PHEX蛋白质产物，部分为单个氨基酸改变的错 义突变，经预测可能改变了高度保守的氨基酸。1999年Filisetti等人也报导了在15外显 子及17外显子有高密度的突变。除这一丛外，没有检测出其它的突变/热点。推测多数突 变可能导致PffiX蛋白质翻译后修饰的方式及二级结构的改变。
[0026] 在本发明中，术语"外显子"是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA对 应于基因中的部分。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。 外显子和内含子都是对于基因而言的，编码的部分为外显子，不编码的为内含子，内含子没 有遗传效应。
[0027] 在本发明中，术语"外显子捕获"与"芯片杂交"可互换使用，指的是探针对文库中 外显子区域的DNA片段进行特异性选择和结合的过程。DNA分子正常情况下是双链，因此捕 获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分 子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显 子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯 片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂交完毕后，通过变性等方法收集捕获的 序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。
[0028] 在本发明中，"高通量测序"是指采用三种第二代测序平台进行高通量测序： 454FLX(Roche 公司）、Solexa Genome Analyzer(Illumina 公司）和 Applied Biosystems 公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管 测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的不同，读取长度从 25bp到450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数。
[0029] 在本发明中，术语"DNA文库"是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一 定大小的DNA片段混合物。DNA文库的制备方法为本领域技术人员所熟知。在一个优选例 中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。对反应的条件进行 一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。
[0030] 在本发明中，术语"突变"是指野生型的PHEX多核苷酸序列发生改变，成为变异 体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。在本发明中，变异体通过缺失野生型基因序 列的第1553位的T来实现。
[0031] 本发明还涉及与所述的PHEX核苷酸杂交且两个序列之间具有至少80%，较佳地 至少90%，更佳地至少95%，至少99 %同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下 与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
[0032] 本发明野生型或突变型PHEX核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重 组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤 其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方 法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组 法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从 增殖后的宿主细胞中分尚得到有关序列。
[0033] 本发明中，"载体"包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中， 所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在一个优选的实施方案中，所述载体是 商购可得的。在一个优选的实施方案中，所述载体包含与上述突变的PffiX基因可操作地连 接的表达控制序列，例如但不限于启动子，增强子和终止子。在一个优选的实施方案中，所 述载体任选地还包含选择标记。
[0034] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆 菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞， 例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。
[0035] 本发明还涉及到PHEX突变蛋白质，由于在SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列中第1553 位缺失了 T，使得PHEX基因编码的氨基酸序列第518位的苯丙氨酸变成了丝酰胺，第518位 以后的氨基酸序列也发生改变，直至第521位亮氨酸密码子突变为终止密码子，使得多肽 链合成中断，本发明的PffiX突变蛋白质具有SEQ ID N0:3所示的序列，与野生型PHEX氨基 酸序列的不同之处为只有520个氨基酸，缺失了后部分的229个氨基酸，因此不具有PHEX 蛋白质正常的功能。本发明的PffiX突变蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白 质，优选重组蛋白质，即使用重组技术从原核或真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆 虫和哺乳动物细胞）中产生。
[0036] 在本发明中，PHEX突变蛋白质还涉及具有与PHEX突变蛋白质相同功能的、SEQ ID NO. 3序列的变异形式。变异形式包括：同源序列、保守性变异体、诱导突变体等。发明还涉 及PHEX突变蛋白质类似物。这些类似物与PHEX突变蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的 差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。
[0037] 本领域技术人员公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本发明提供的突变 PHEX基因的用途包括但不限于：用作治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的药物靶点；制备 X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的诊断试剂盒中；用于产生疾病动物模型；为治疗X-连锁低 磷酸盐血症性佝偻病提供新的药物作用途径。
[0038] 本发明所述的"试剂盒"是指本领域技术人员以PHEX野生型或突变型核苷酸为基 因探针，根据基因杂交的原理，可以检测生物样本中是否存在与该探针序列互补的核苷酸 序列，因此使用这种试剂盒可以检测出样本中是否存在着本发明的基因突变位点。试剂盒 一般包括：引物、探针、核酸芯片、说明书等，还可能包括与活性成分相容的缓冲液、载体或 媒介等。
[0039] 在本发明中，"引物"指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为 寡核苷酸，例如含有至少 5 个碱基，例如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增 的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术 语"特异性扩增"是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特 异性扩增PHEX基因是指，在PCR反应中引物只扩增PHEX基因，而不扩增其他基因，此类引 物的设计是本领域技术人员公知的。
[0040] 在本发明中，术语"特异性检测PHEX基因突变的探针"是指探针能够区分出含有 突变的PHEX基因基因与不含有突变的PHEX基因。一般而言，可以通过控制杂交条件的严紧 性，使得探针能够区分出含有突变的基因与不含有突变的基因。例如，在高度严紧条件下， 与PHEX基因精确互补的探针可以与不含有突变的PHEX基因基因杂交，而不与甚至只包含 一个点突变的突变的PffiX基因杂交，从而将二者区分开。同样，还可以设计与突变的PHEX 基因基因精确互补的探针，从而其在高度严紧条件下与突变的PffiX基因杂交，而不与不含 有突变的PffiX基因杂交。在分子生物学领域中，探针的设计和杂交技术是熟知的。
[0041] 本发明涉及对突变的PHEX蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其 是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于突变的PffiX蛋白质。较佳地，指那些能 与突变的PffiX蛋白质产物或片段结合但不识别和结合于野生型的PHEX蛋白质相关抗原分 子的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体 片段，如Fab，或（Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗 体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
[0042] 本发明的突变的PHEX蛋白质抗体可以用来鉴定突变的PHEX蛋白质。例如，可以 用一种可检测的分子例如荧光素异硫氰酸（FITC)来标记突变的PHEX蛋白质特异抗体，然 后让突变的PffiX蛋白质特异抗体与样品接触，再用荧光显微镜或流式细胞仪检测出与突 变的PHEX蛋白质特异抗体结合的样品，从而为预测或诊断患者是否存在X-连锁低磷酸盐 血症性佝偻病提供依据和指导。
[0043] 本发明的突变的PHEX蛋白质抗体还可以用来中和突变的PHEX蛋白质。如果有足 够的数据表明某个体的X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病与本发明突变PHEX蛋白质的存在相 关，可以考虑用突变的PHEX蛋白质特异性抗体中和这些致病突变PHEX蛋白质分子，从而缓 解患者的病症。
[0044] 实施例1 :样本获取
[0045] 发明人近几年在国内收集到一个XLHR的家系，共4代17个汉族家系成员（如图1 所示），疾病诊断基于低磷酸盐血症性佝偻病的家族史，临床和生化指标以及影像学证剧， 结合我们所收集到的家族性病例，提示XLHR的可能性较大。在家系中选取四例患者样本 (11:1，111:1，IV: 1 和 IV:2)、五例正常家系样本（11:2, 111:2, 111:3, 111:5 和 111:7)共九 例样本作为研究样本，每个样本采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80°C保存。
[0046] 随机收集500位无关正常个体作为二次验证样本，每位采集外周血样品2ml,加入 EDTA抗凝，-80°C保存。
[0047] 实施例2 :样本DNA制备
[0048] 采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA， 提取步骤如下：
[0049] (1)取 2ml 全血样本，加入 150ul OB Protease，2. lml Buffer BL 和 20ul RNase A,最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。
[0050] (2) 65°C水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次。
[0051] (3)加入2. 2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。
[0052] (4)将3. 5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤 柱，倒掉过滤液体,放回过滤柱。
[0053] (5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出 过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。
[0054] (6)加入3ml HB Buffer,洗漆过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤 液体，放回过滤柱。
[0055] (7)加入3ml DNA Wash Buffer, 4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体， 放回过滤柱。
[0056] (8)再次加入3ml DNA Wash Buffer, 4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液 体,放回过滤柱。
[0057] (9) 4000转离心15分钟，甩干过滤柱。
[0058] (10)将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的ElutionBuffer，室 温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。
[0059] (11)再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。
[0060] (12)利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的 0D260/0D280均位于1. 7?2. 0之间，浓度不少于200ng/ul，总量不少于30 ii g。
[0061] 实施例3 :外显子捕获与测序
[0062] 发明人米用 NimbleGen SeqCap EZ Exome Library V2 结合 Solexa 高通量测序技 术对选取的实施例1的样本（IV: 1)的外显子组序列进行了测序和数据分析，具体如下：
[0063] 1)将基因组DNA随机打断成150_200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上 接头制备杂交文库（参见http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa标准建库 说明书）。
[0064] 2)文库经纯化后经过连接介导PCR(ligation_mediated PCR(LM-PCR))的线性扩 增与SeqCap EZ Oligo pool进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测 序平台为Illumina Hiseq 2000,读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为50X。
[0065] 3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1. 7进行 处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2. 20#比对参考基因组Hgl9 (参考Li R, Li Y, KristiansenK,et al, SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008,24 (5):713-714 ；Li R, Yu C, Li Y, et al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009,25 (15):1966-1967, 通过参考的方式将其全文并入本文），以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利 用 SOAP snp (可参见：Li R, Li Y, Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res 2009, 19(6) :1124_1132,通过参考的 方式将其全文并入本文）确定祀区域的基因型。Indel (insertion-deletion,插入/缺失 标记）米用BWA (通过Burrows-Wheeler变换比对）（version 0? 5. 9_rl6)比对到参考基因 组 Hgl9(snpl32)，然后利用 GATK (Genome Analysis Toolkit) (version vl. 0.4705)确定 indel 的类型。（可参见 Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2010 ;26 (5):589-595 ;McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al. The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 2010 ；20(9):1297-1303)〇
[0066] 结果，在患者（IV: 1)中发现有113054个单核苷酸多态性（SNPs)和11889处的插 入 / 缺失，随后对结果通过 dbSNP 数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/SNP/ snp_su_ary.cgi),千人基因组数据库（www. 1000genomes.org/)，HapMap 数据库（http:// hapmap. ncbi. nlm. nih. gov/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知变异和影响蛋白功能较 小的位点（包括intron，intergenic，UTR，同义突变），并利用SIFT软件进行SNP功能预 测，最终得到59个杂合可能具有致病意义的SNP位点和23个Indel。
[0067] 实施例4 : Sanger法测序验证
[0068] 由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，因此我们进一步利用Sanger测序法， 对上述59个杂合可能具有致病意义的SNP位点和23个Indel进行验证。分别对实施例1 中的4名患者、5名家系内正常人和500名家系外正常人基因进行检测，针对PHEX基因的外 显子序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得PHEX有关序列，根据序列测 定结果属于突变型还是野生型，验证PffiX与XLHR疾病之间相关性。具体方法步骤如下 ：
[0069] 1.DNA 提取
[0070] 采集4名患者、5名家系内正常人和500名家系外正常人的外周血，利用常规 酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所 得的每个标本基因组DNA的0D260/0D280均位于1. 7-2. 0之间，浓度不少于200ng/ul，总量 不少于30 u g。
[0071] 2.弓丨物设计及PCR反应
[0072] 引物设计参考人类基因组序列数据库hgl9/build36. 3,具体见下。
[0073] 引物序列：
[0074]
【权利要求】
1. 一种突变的PffiX基因，其特征在于：所述突变的PHEX基因导致X-连锁低磷酸盐血 症性佝偻病的发生，其基因序列如SEQ ID N0:2所示。
2. -种如权利要求1所述的突变的PHEX基因编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质 的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
3. -种载体，其特征在于：所述载体含有如权利要求1所述的突变的PHEX基因。
4. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为权利要求3所述的载体 转化或转导的宿主细胞。
5. 如权利要求1所述的突变的PHEX基因在作为治疗X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的 药物靶点或制备X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病诊断试剂盒中的应用。
6. -种用于诊断X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包 含能够特异性扩增PffiX基因的引物，或能够特异性检测PHEX基因突变的探针。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述引物或探针序列为SEQ ID NO: 1或2 所示的序列中第1553位前后15?30bp长的序列。
8. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述引物包括上游引物 5-AGTTGCTCCTTCCTATGCTGA-3'，下游引物 5-AGACTCCGCTTCTCACCAAT-3'。
9. 一种抗体，其特征在于：所述抗体与权利要求2所述的蛋白质特异性结合，且不作用 于野生型PHEX基因所编码的蛋白质。
10. -种X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病治疗剂，所述治疗剂包含权利要求9所述的抗 体。
【文档编号】A61K39/395GK104450727SQ201410640242
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】肖晶晶, 谌于蓝, 徐凤萍, 邓昊 申请人:深圳华大基因科技有限公司, 深圳华大基因研究院