一种透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方法及其应用的制作方法

一种透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明之涉及透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方法及其应用，可有效解决用透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备，及在制备治疗肿瘤药物中的应用问题，通过水热合成法制备二氧化钛纳米管，然后以二氧化钛纳米管为前驱物,利用光照还原煅烧法制备表面修饰Au的二氧化钛纳米管，通过巯金键将巯基乙酸连接在Au掺杂的二氧化钛纳米管上，透明质酸通过亚烷基二胺为连接臂和Au掺杂二氧化钛纳米管表面修饰的巯基乙酸共价连接，在水介质中形成纳米层；透明质酸为分子量等于或低于400kd，并等于或高于600道尔顿，连接臂为碳原子数2-12的亚烷基二胺结构，本发明靶向性强，可将光动力学治疗、光热治疗、化疗结合起来，更有效的实现癌症的综合治疗。
【专利说明】一种透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方法 及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药，特别是一种透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方 法及其应用。

【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤已超过心血管疾病，成为城市居民首要致死病因，严重威胁着人类的生 命与健康。目前，医学上普遍釆用化学疗法、放射线疗法和外科手术来治疗癌症。化学疗法 通过药物来摧毁癌细胞，但是存在靶向性差和剂量限制毒性的问题；放射线疗法是使用电 离辖射杀伤癌细胞并使肿瘤妻缩，可是在临床治疗时正常组织也会受到相应的福射损伤； 外科手术是通过切除肿瘤组织来达到治疗癌症的目的，但是其对人体创伤较大，而且常因 为癌细胞已经扩散而导致疗效较差。因此，随着光敏物质和激光技术的不断发展，光动力学 疗法为癌症治疗提供了一种微创而又有效的治疗途径。
[0003] 二氧化钛（TiO2)是一种常用的光催化剂，具有湿敏、气敏、介电效应、光电转换、光 致变色及优越的光催化等性能，因而广泛用于传感器、介电材料、自洁材料等领域。并且相 关研究发现，TiO 2化学和光稳定性好、对生物体的毒性较小，在细胞水平是一种相当安全的 材料，因而近些年来TiO2在作为药物载体进行生物体内光动力学治疗基础研究方面已取得 一系列进展，是极有潜力的光动力学治疗材料。而二氧化钛纳米管（TiNTs)较纳米粉体有 着更大的比表面积及特异性的中空结构，故在药物载体方面有着更加诱人的应用前景。
[0004] 然而，尽管二氧化钛纳米管（TiNTs)是一种极具潜力的光动力学治疗载体材料， 但要实现其在肿瘤治疗中的应用，仍面临诸多挑战，如：二氧化钛作为一种η型半导体，能 带隙较宽，光生电子-空穴复合几率较高以及对太阳光利用率较低；在水中稳定性不好，表 面能高，生理条件下容易聚沉；在生物体内的相容性有待于进一步改善等。至关重要的是， 二氧化钛纳米管本身不具肿瘤细胞靶向性，难以实现药物的靶向转运及高效、低毒的光动 力学联合化疗。因此，若能适当将功能化，提高其生物相容性，同时解决其靶向性缺陷，将会 大大提高其在医药领域的应用。但至今未见有用透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管 及其应用的公开报导。


【发明内容】

[0005] 针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种透明质酸修 饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方法及其应用，可有效解决用透明质酸修饰的Au掺杂 二氧化钛纳米管的制备，及在制备治疗肿瘤药物中的应用问题。
[0006] 本发明解决的技术方案是，该透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方 法，是通过水热合成法制备二氧化钛纳米管，然后以二氧化钛纳米管为前驱物，利用光照 还原煅烧法制备表面修饰Au的二氧化钛纳米管；通过巯金键将巯基乙酸连接在Au掺杂 的二氧化钛纳米管上，透明质酸通过亚烷基二胺为连接臂和Au掺杂二氧化钛纳米管表面 修饰的巯基乙酸共价连接，在水介质中形成纳米层；所述透明质酸为分子量等于或低于 400kd，并等于或高于600道尔顿的低分子量透明质酸；所述连接臂为碳原子数2-12的亚烷 基二胺结构，具体包括以下步骤：
[0007] (1)二氧化钛纳米管的合成：将NaOH置于烧杯中，加入去离子水，冰浴下搅拌使 其溶解，冷却至室温，成质量浓度为40g/100ml的溶液，再加入TiO 2纳米颗粒粉末，NaOH与 TiO2纳米颗粒粉末的重量比为2000 : 1，超声分散15min，140-160°C加热24-35h，冷至室 温，再依次用〇. lmol/L HCl溶液和去离子水清洗至pH值为7的中性，抽滤，除去液体，得固 体物，固体物60°C真空干燥，得干燥物，研磨，成二氧化钛纳米管（TiNTs)，避光保存；
[0008] (2)Au掺杂二氧化钛纳米管的制备：将氯金酸（AuCl4H)固体加入蒸馏水中搅拌， 将其完全溶解，成200mg/ml的溶液，再按照氯金酸中Au与二氧化钛纳米管质量比为1 : 50-100加入二氧化钛纳米管，将其避光超声振荡lh，使其分散均匀，再避光搅拌12h，使其 充分吸附，将分散液用紫外光照射3h，静置6_8h，过滤，弃去滤液，得固定体，固体物80°C干 燥18h，再以速度为2°C /min升温至500°C，保持3h，待冷却至室温，研细，得Au掺杂的二氧 化钛纳米管（Au@ TiNTs);
[0009] (3)巯基乙酸修饰二氧化钛纳米管：将Au掺杂的二氧化钛纳米管加入超纯水溶解 成lmg/ml的溶液，向溶液中加入巯基乙酸，每150-200mg Au掺杂的二氧化钛纳米管制成的 溶液中加入巯基乙酸l〇_15mg，避光搅拌24h，透析，抽滤，50°C真空干燥，得巯基乙酸修饰 的Au掺杂的二氧化钛纳米管；
[0010] (4)氨化透明质酸的合成：将180-220mg透明质酸（HA)溶于l〇-15ml有机溶剂 中，45-55°C油浴溶解2-3h，加入400-500mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、 260-320mg羟基琥珀酰亚胺，室温活化30min，然后加入到8-12ml浓度为0. 5M的亚烷基 二胺溶液中，室温反应12_48h，再加入预冷的丙酮进行沉淀，抽滤得沉淀物；沉淀物加水复 溶，透析，冷冻干燥得氨化的透明质酸（NH 2-HA);
[0011] 所述的有机溶剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜的一种；
[0012] (5)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的合成：将巯基乙酸修饰的Au 掺杂的二氧化钛纳米管和氨化透明质酸按照1:1.5-2的质量比溶于反应溶剂中，按照 1:1. 4-1.8 (氨化透明质酸：EDC)的质量比加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺 (EDC)、1:1. 5-2. 0 (氨化透明质酸：NHS)的质量比加入羟基琥珀酰亚胺（NHS)进行活化，室 温反应12-36h ;再加入丙酮进行沉淀，抽滤得沉淀物，加水复溶沉淀物，透析，冷冻干燥即 得透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管（HA-AuO TiNTs);所述的反应溶剂为水、或甲酰 胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或N，N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂， 或其它类似溶剂以及其它类似溶剂的混合物。
[0013] 本发明采用贵金属（Au、Pt、Pd等）修饰二氧化钛，通过改变体系中的电子分布， 影响二氧化钛的表面性质，进而拓展其吸收光谱至可见光，从而改善其光催化活性。在贵金 属中，Au较之Pt、Pd价廉易得，毒性小且具有杀菌作用，另外金纳米粒有着卓越的光热转 换特性，在近红外光的照射下产热性能较好，这样形成的复合药物载体就成为一种极具潜 力的光动力学兼光热治疗载体材料；同时采用具有良好生物相容性、肿瘤细胞靶向性的天 然多糖--透明质酸，将其羧基通过简单的亚烷基二胺为连接臂，与巯基乙酸修饰的Au掺 杂二氧化钛纳米管共价连接，构建了一种新型光热治疗联合光动力学治疗的纳米载体。该 载体合成工艺简单，并将二氧化钛纳米管卓越的光催化性能及强大的药物负载特性，金纳 米粒显著的光热敏感性，透明质酸独特的肿瘤细胞靶向性、辅助的抗肿瘤活性、良好的生物 相容性有机的整合于一体，加之可以物理负载具有抗肿瘤活性的药物，，既可克服传统肿瘤 治疗的非靶向性难题，降低治疗过程中对正常组织的损伤，具有高效、可控的优势，并且，其 将光动力学治疗、光热治疗、化疗很好的结合起来，更有效的实现癌症的综合治疗，是治疗 癌症药物上的创新，经济和社会效益巨大。

【具体实施方式】
[0014] 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0015] 本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：
[0016] (1)二氧化钛纳米管的合成：称取40g NaOH置于烧杯中，加入去离子水，冰浴搅拌 使其溶解，冷却至室温，再加去离子水定容至IOOml，加入200mg TiO2纳米颗粒粉末，超声分 散15min，置入聚四氟乙烯内胆的反应釜中，在马弗炉中150°C加热24-35h，冷至室温，依次 用0. lmol/L HCl溶液和去离子水清洗至pH为7,用直径0. 22 μ m的微孔滤膜（水膜）抽 滤，真空干燥箱中60°C烘干，研磨，得二氧化钛纳米管（TiNTs)，避光保存；
[0017] (2) Au掺杂二氧化钛纳米管的制备：称取200mg的氯金酸固体置于烧杯中，加入蒸 馏水配成200mg/ml的溶液，搅拌溶解均匀，再向烧杯中按照氯金酸中Au与二氧化钛纳米管 质量比为1 : 50-100加入二氧化钛纳米管，避光置于超声波振荡器中振荡lh，使其分散均 匀，再避光搅拌12h，使其充分吸附，在紫外光下照射3h，静置6-8h，过滤，80°C下干燥18h， 再转入程序控温马弗炉中，以速度为2°C /min升温至500°C，并保持3h，冷却至室温后取出 研细，即得Au掺杂的二氧化钛纳米管（Au@ TiNTs);
[0018] (3)巯基乙酸修饰二氧化钛纳米管：称取175mg Au掺杂的二氧化钛纳米管，加入 175ml的超纯水配成溶液，向溶液中加入13mg的巯基乙酸，避光搅拌24h，用丽=3500的 透析袋透析，再用直径0.22 μ m的微孔滤膜（水膜）抽滤，真空干燥箱中50°C干燥，得巯基 乙酸修饰的Au掺杂的二氧化钛纳米管；
[0019] (4)氨化透明质酸的合成：取200mg透明质酸（HA)于l〇-15ml有机溶剂中，50°C油 浴溶解2-3h，加入450mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺及290mg羟基琥珀酰亚 胺进行活化，室温活化30min ;然后加入到IOml浓度为0. 5M的亚烷基二胺溶液中，室温反 应12-48h ;反应结束后加入预冷的丙酮进行沉淀，抽滤得沉淀物；加水复溶沉淀物，透析， 冷冻干燥，得氨化的透明质酸（NH2-HA);
[0020] (5)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的合成：将巯基乙酸修饰的Au掺 杂的二氧化钛纳米管和氨化透明质酸按照1:1.5-2的质量浓度比溶于反应溶剂中，按照 1:1. 4-1.8 (氨化透明质酸：EDC)的质量比加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺 (EDC)、1:1. 5-2. 0 (氨化透明质酸：NHS)的质量比加入羟基琥珀酰亚胺（NHS)进行活化，室 温反应12-36h，加入丙酮沉淀，抽滤得沉淀物，加水复溶沉淀物，透析，冷冻干燥即得透明质 酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管（HA-AuO TiNTs)。
[0021] 上述方法制备的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管，可用于制备抗肿瘤药 物组合物，实现用透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管在制备抗肿瘤药物组合物中的 应用，所述的药物组合物是透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管和药学活性或药理活 性分子制成载药纳米层，所述的药学活性或药理活性分子为难溶性抗肿瘤药物、水溶性药 物和核酸药物；
[0022] 所述的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管在制备抗肿瘤药物组合物中的应 用，所述的载药纳米层为透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管与水按重量比1?50 : 100的比例探头超声溶解，与经溶剂溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质处理，室温 搅拌24小时后采用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂及游离药物，冻干制得粒径 为10?IOOOnm的纳米层；
[0023] 所述的抗肿瘤药物组合物可用作光热治疗、光动力学治疗、联合化疗癌症药物，实 现在光热治疗、光动力学治疗、联合化疗癌症药物中的应用。
[0024] 由上述可知，本发明的目的是提供一种兼具抗肿瘤光动力治疗活性、光热治疗活 性、肿瘤细胞靶向性以及良好生物相容性的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管。该透 明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管合成工艺和化学结构均较为简单，避免了为提高生 物相容性、稳定性及靶向性而引入多种分子基团，并保留了二氧化钛所具有的光催化特性， 金纳米粒所具有的光热特性；此外，可物理负载抗肿瘤药物，共同达到治疗癌症的效果。
[0025] 本发明的另一个目的是提供包含上述透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的 药物组合物。
[0026] 本发明的另一个目的是提供上述透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管及包含 上述透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管药物组合物的制备方法。
[0027] 本发明的还有一个目的是提供上述透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管及其 药物组合物在医药领域中的应用。
[0028] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是通过水热合成法制备二氧化钛纳米 管，然后以自制的二氧化钛纳米管为前驱物，利用光照还原煅烧法制备了表面修饰Au的二 氧化钛纳米管；之后通过巯金键将巯基乙酸连接在Au掺杂的二氧化钛纳米管上，透明质酸 通过亚烷基二胺为连接臂和Au掺杂二氧化钛纳米管表面修饰的巯基乙酸共价连接，该药 物载体在水介质中可自发形成纳米层，再借助二氧化钛纳米管较强的药物负载能力，物理 负载抗肿瘤药物，构成透明质酸修饰的Au掺杂的二氧化钛纳米管药物组合物。由于二氧 化钛纳米管卓越的光催化性能以及金纳米粒强大的光热转换特性，故该体系可实现光热治 疗、光动力学治疗联合化疗，更加有效的实现对癌症的综合治疗。
[0029] 所述的抗肿瘤药物组合物，包含本发明所述的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛 纳米管和药学活性或药理活性分子。其中药学活性或药理活性分子为：难溶性抗肿瘤药物、 水溶性药物和核酸药物，比如：多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、顺钼、卡钼、柔红霉素、寡义反 核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种。
[0030] 所述的抗肿瘤药物组合物，可以用于注射、口服或植入给药。其中注射给药优选 注射剂、冻干粉针，口服给药优选片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂，植入给药优选自凝胶 齐IJ，溶液剂。
[0031] 并经有关实验得到了充分证明，有关实验资料如下：
[0032] 1、对本发明中的二氧化钛纳米管、Au掺杂二氧化钛纳米管进行紫外分光光度法扫 谱分析，证明金纳米粒的掺杂可以有效的将二氧化钛的吸收光谱由紫外光区扩展到可见光 区；对自制的二氧化钛纳米管、Au掺杂二氧化钛纳米管和透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛 纳米管进行透射电镜形态观察及水中的分散性测试可知，二氧化钛纳米管形态均一，内径 大，可以有效装载药物，Au在二氧化钛管上成功负载，透明质酸对Au掺杂二氧化钛纳米管 成功修饰后，其在水中的分散性明显改善。
[0033] 2、透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的光热效应实验
[0034] 配制一系列浓度的二氧化钛纳米管和透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管溶 液，采用808nm NIR激光仪以2 W/cm2的能量密度进行照射，并于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 IOmin测量溶液的温度，Au掺杂后的二氧化钛纳米管具有优良的光热转化作用，并且透明 质酸对Au掺杂二氧化钛纳米管的修饰并没有影响其光热特性。
[0035] 3、透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管对肿瘤细胞产生活性氧的测定实验
[0036] 将MCF-7乳腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞 培养在含胎牛血清（FBS) 10 %，青链霉素混合液1 %的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为 37°C、5% CO2，每2?3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，6孔板每孔加入 lml，铺板使待测细胞调密度至3 X IO4个/孔。置于5% C02, 37°C孵育24h，至细胞单层铺满 孔底，加入20 μ g/ml的实施例1中的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管，设置复孔为 2?4个。加药4h后，光照组放置在532nm激光2W中2min，保持光照过程中温度在37°C， 光照结束后加入活性氧探针，用铝箔包裹细胞版置于CO 2培养箱中孵育0. 5h，终止培养，吸 出含药培养基，每孔用3ml PBS洗2遍，用70%冰乙醇固定0. 5h，然后置于荧光显微镜下观 察活性氧产生情况。
[0037] 对荧光显微镜结果进行记录，可知透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管在可 见光照射下肿瘤细胞内可以产生大量活性氧，可作为光敏剂用于对肿瘤进行光动力学治 疗。
[0038] 4、使用光照射本发明的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管对肿瘤细胞生长 的抑制活性的测定。
[0039] 通过光照射本发明的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管在体外抗肿瘤活 性：将MCF-7乳腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞培 养在含胎牛血清（FBS) 10%，青链霉素混合液1 %的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为 37 °C、5 % CO2，每2?3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔 加入200μ1，铺板使待测细胞调密度至5X10 3个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。置于 5%〇)2,371：孵育2411，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度（12.5、25、50、 100 μ g/ml)的实施例1中的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管，设置复孔为4?6 个，共分为4组，具体分组如下：（1)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管组；（2)透明质 酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管-808nm激光组；（3)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳 米管-532nm激光组；(4)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管-808nm-532nm联合激光 组；其中激光组放置在532nm或808nm激光2W中2min，保持光照过程中温度在37°C，光照 结束后用铝箔包裹细胞版置于CO 2培养箱中孵育24h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包 裹细胞版置于CO2培养箱中孵育24h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μ I PBS洗2 遍，加入预冷的1〇%?^Α20〇μ1，4?放置lh。倒掉固定液。每孔用去离子水洗5遍，甩干， 空气干燥。每孔加入1〇〇μ 1的SRB溶液，静置放置lOmin，未与蛋白结合的SRB用1 %醋酸 洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μ1 lOmmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515nm处测定 每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对 照组均为扣除空包对照组后的值。
[0040] 已经证实当用808nm激光或532nm激光照射细胞时，都会影响MCF-7肿瘤细胞的 增殖，其中联合激光组抑制肿瘤生长的效果最明显。
[0041] 光照射时，本发明的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的体内抗肿瘤活性 测定：取小鼠 S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射 0. 3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠 S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度 为2X IO6个/ml的细胞悬液,皮下接种于小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7d后,取其中30 只肿瘤体积> IOOmm3昆明小鼠，随机分为5组，每组6只。具体分组如下：（1)对照组（NS 组）：生理盐水；（2)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管组；（3)透明质酸修饰的Au掺 杂二氧化钛纳米管_808nm激光组；(4)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管-532nm激 光组；（5)透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管-808nm-532nm联合激光组。5组均采用 静脉给药的方式，其中激光组（532nm或808nm激光），功率均为2W，给药3h后激光照射肿 瘤部位，一次照射时间为2min。每2d给药一次，每次注射生理盐水或者10mg/ml的透明质 酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管ΙΟΟμ 1，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活 状态，每2d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径（A)与短径（B)，按公式肿瘤体积

【权利要求】
1. 一种透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方法，其特征在于，通过水热合 成法制备二氧化钛纳米管，然后以二氧化钛纳米管为前驱物，利用光照还原煅烧法制备表 面修饰Au的二氧化钛纳米管；通过巯金键将巯基乙酸连接在Au掺杂的二氧化钛纳米管上， 透明质酸通过亚烷基二胺为连接臂和Au掺杂二氧化钛纳米管表面修饰的巯基乙酸共价连 接，在水介质中形成纳米层；所述透明质酸为分子量等于或低于400 kd，并等于或高于600 道尔顿的低分子量透明质酸；所述连接臂为碳原子数2-12的亚烷基二胺结构，具体包括以 下步骤： (1) 二氧化钛纳米管的合成：将NaOH置于烧杯中，加入去离子水，冰浴下搅拌使其溶 解，冷却至室温，成质量浓度为40g/100ml的溶液，再加入Ti02纳米颗粒粉末，NaOH与Ti02纳米颗粒粉末的重量比为2000 : 1，超声分散15min，140-160°C加热24-35h，冷至室温，再 依次用〇. lmol/L HC1溶液和去离子水清洗至pH值为7的中性，抽滤，除去液体，得固体物， 固体物60°C真空干燥，得干燥物，研磨，成二氧化钛纳米管，避光保存； (2) Au掺杂二氧化钛纳米管的制备：将氯金酸固体加入蒸馏水中搅拌，将其完全溶解， 成200mg/ml的溶液，再按照氯金酸中Au与二氧化钛纳米管质量比为1 : 50-100加入二氧 化钛纳米管，将其避光超声振荡lh，使其分散均匀，再避光搅拌12h，使其充分吸附，将分散 液用紫外光照射3h，静置6-8h，过滤，弃去滤液，得固定体，固体物80°C干燥18h，再以速度 为2°C /min升温至500°C，保持3h，待冷却至室温，研细，得Au掺杂的二氧化钛纳米管； (3) 巯基乙酸修饰二氧化钛纳米管：将Au掺杂的二氧化钛纳米管加入超纯水溶解成 lmg/ml的溶液，向溶液中加入巯基乙酸，每150-200mg Au掺杂的二氧化钛纳米管制成的溶 液中加入巯基乙酸l〇_15mg，避光搅拌24h，透析，抽滤，50°C真空干燥，得巯基乙酸修饰的 Au掺杂的二氧化钛纳米管； (4) 氨化透明质酸的合成：将180-220mg透明质酸溶于10-15ml有机溶剂中，45-55°C 油浴溶解2-3h，加入400-500mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、260-320mg羟基 琥珀酰亚胺，室温活化30min，然后加入到8-12ml浓度为0. 5M的亚烷基二胺溶液中，室温反 应12-48h，再加入预冷的丙酮进行沉淀，抽滤得沉淀物；沉淀物加水复溶，透析，冷冻干燥 得氨化的透明质酸； 所述的有机溶剂为甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜的一种； (5) 透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的合成：将巯基乙酸修饰的Au掺杂的二氧 化钛纳米管和氨化透明质酸按照1 : 1.5-2的质量比溶于反应溶剂中，按照氨化透明质酸： 1-乙基-(3_二甲基氛基丙基）碳二亚胺为1 : 1. 4-1. 8的质量比加入1_乙基-(3_二 甲基氨基丙基）碳二亚胺、氨化透明质酸：羟基琥珀酰亚胺为1 : 1.5-2. 0的质量比加入 羟基琥珀酰亚胺进行活化，室温反应12-36h ;再加入丙酮进行沉淀，抽滤得沉淀物，加水复 溶沉淀物，透析，冷冻干燥即得透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管； 所述的反应溶剂为水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或N，N-二 甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂。
2. 根据权利要求1所述的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的制备方法，其特征 在于，由以下步骤实现： (1)二氧化钛纳米管的合成：称取40g NaOH置于烧杯中，加入去离子水，冰浴搅拌使其 溶解，冷却至室温，再加去离子水定容至100ml，加入200mg Ti02纳米颗粒粉末，超声分散 15min，置入聚四氟乙烯内胆的反应釜中，在马弗炉中150°C加热24-35h，冷至室温，依次用 0. lmol/L HC1溶液和去离子水清洗至pH为7,用直径0. 22 y m的微孔滤膜抽滤，真空干燥 箱中60°C烘干，研磨，得二氧化钛纳米管，避光保存； (2) Au掺杂二氧化钛纳米管的制备：称取200mg的氯金酸固体置于烧杯中，加入蒸馏水 配成200mg/ml的溶液，搅拌溶解均匀，再向烧杯中按照氯金酸中Au与二氧化钛纳米管质量 比为1 : 50-100加入二氧化钛纳米管，避光置于超声波振荡器中振荡lh，使其分散均匀， 再避光搅拌12 h，使其充分吸附，在紫外光下照射3h，静置6-8h，过滤，80°C下干燥18h，再 转入程序控温马弗炉中，以速度为2°C /min升温至500°C，并保持3h，冷却至室温后取出研 细，即得Au掺杂的二氧化钛纳米管； (3) 巯基乙酸修饰二氧化钛纳米管：称取175mg Au掺杂的二氧化钛纳米管，加入175ml 的超纯水配成溶液，向溶液中加入13mg的巯基乙酸，避光搅拌24h，用MW=3500的透析袋透 析，再用直径0.22 的微孔滤膜抽滤，真空干燥箱中50°C干燥，得巯基乙酸修饰的Au掺杂 的二氧化钛纳米管； (4) 氨化透明质酸的合成：取200mg透明质酸于10-15ml有机溶剂中，50°C油浴溶解 2-3h，加入450mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺及290mg羟基琥珀酰亚胺进行活 化，室温活化30min ;然后加入到10ml浓度为0. 5M的亚烷基二胺溶液中，室温反应12-48h ; 反应结束后加入预冷的丙酮进行沉淀，抽滤得沉淀物；加水复溶沉淀物，透析，冷冻干燥，得 氨化的透明质酸； (5 )透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管的合成：将巯基乙酸修饰的Au掺杂的二氧 化钛纳米管和氨化透明质酸按照1:1. 5-2的质量浓度比溶于反应溶剂中，按照氨化透明质 酸：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为1:1. 4-1. 8的质量比加入1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳二亚胺、氨化透明质酸：羟基琥珀酰亚胺为1:1.5-2.0的质量比加入羟 基琥珀酰亚胺进行活化，室温反应12-36h，加入丙酮沉淀，抽滤得沉淀物，加水复溶沉淀物， 透析，冷冻干燥即得透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管。
3. 权利要求1或2所述方法制备的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管在制备抗 肿瘤药物组合物中的应用，所述的药物组合物是透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管 和药学活性或药理活性分子制成载药纳米层，所述的药学活性或药理活性分子为难溶性抗 肿瘤药物、水溶性药物和核酸药物。
4. 根据权利要求3所述的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管在制备抗肿瘤药物 组合物中的应用，其特征在于，所述的载药纳米层为透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米 管与水按重量比广50 : 100的比例探头超声溶解，与经溶剂溶解的抗肿瘤药物混合，经超 声或高压均质处理，室温搅拌24小时后采用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂及 游离药物，冻干制得粒径为l(Tl〇〇〇 nm的纳米层。
5. 根据权利要求3所述的透明质酸修饰的Au掺杂二氧化钛纳米管在制备抗肿瘤药物 组合物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物组合物在光热治疗、光动力学治疗、联合 化疗癌症药物中的应用。
【文档编号】A61K41/00GK104368003SQ201410652133
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】张慧娟, 陈倩倩, 冀嫣丹, 焦晓静, 侯琳, 张振中, 张红岭 申请人:郑州大学