一种负载bmp微球的3d打印多孔金属支架及其制备方法

一种负载bmp微球的3d打印多孔金属支架及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物医学材料【技术领域】，具体涉及一种负载BMP微球的3D打印多孔金属支架及其制备方法。本发明在3D打印钛支架的每一个孔洞中，搭建一个含负载微球的三维微支架。不仅克服了现有技术中孔径过大导致细胞只能在其孔壁二维空间上攀附生长，难以在整个孔洞内三维层次的生长的难题，还通过在三维微支架内填充负载rhBMP-2或rhBMP-7的壳聚糖微球，为细胞提供了更好的生长、分化环境，进一步促进骨组织与支架相结合。本发明提供的含负载微球的三维微支架，使众多由于疾病、事故等原因导致的骨组织缺损患者完全治愈成为可能，也可作为一种新型的椎间融合器，适用于脊柱融合手术，具有重要的临床应用价值。
【专利说明】一种负载BMP微球的3D打印多孔金属支架及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学材料【技术领域】，具体涉及一种含负载微球的三维微支架及其 制备方法。

【背景技术】
[0002] 钛及其合金由于具有优良的力学性能和生物相容性，广泛应用于临床医学骨修复 和骨植入领域。然而，致密的钛及其合金的弹性模量远高于人骨模量，易造成"应力屏蔽"效 应，引起骨坏死、畸变和植入体松动等问题。多孔钛及其合金由于具有独特的孔隙结构，拥 有与被替换的骨骼硬组织相匹配的性能，能够有效减弱或消除应力屏蔽效应。因此，多孔钛 及其合金具有广阔的应用前景，成为当前研究热点。然而，传统的多孔金属材料制备工艺的 影响因素过多、流程复杂、无法一次成型，并普遍存在孔隙结构不能精确控制、内部孔隙连 通率差等问题。
[0003] 3D打印通过CT等扫描数据的处理，由计算机设计构建，可以将钛合金打印成符合 需求的个性化多孔连通复杂结构，不仅给骨长入提供了空间，也因为多孔结构降低了钛合 金的弹性模量，实现了与正常骨组织弹性模量的匹配，且不必担心降解时间与机体需求的 不匹配，成为了 3D打印在骨科发展的重要方向。
[0004] 然而，3D打印多孔钛合金支架本身却没有生物活性，没有细胞可以识别的位点，且 目前市面上各种3D打印多孔钛合金材料，孔径通常较大，直径约300-1500um，对于细胞平 均20-30um直径来说，显然过于空旷，细胞只能在其孔壁二维空间上攀附生长，不能实现在 整个孔洞内三维层次的生长，进而也无法实现支架内长入充足的骨量。
[0005] 本发明创造性的在多孔钛的每一个孔洞中，搭建一个含负载微球的三维微支架， 将给细胞的增殖、分化提供一个良好的环境。在这个体系中，多孔钛结构只负责提供力学强 度，三维微支架则提供细胞最佳生长环境，抛弃了传统观念中金属支架的设计必须满足最 适合细胞生长孔径的限制，尽可能将其制备成大孔洞和高孔隙率结构，从而实现了金属的 最少化和骨长入量的最大化；而内部三维微支架则不再受首先满足力学强度的限制，尽可 能采用最利于骨生长的材料，营造出结构疏松、具有细胞识别位点、适合细胞攀附生长的三 维仿生微支架，为细胞提供最好的生长微环境，从而实现两者的优势互补。
[0006] 此外，单纯植入体内的支架往往不能满足临床需要，导致植骨失败，这是因为支架 植入人体后，其中心部位营养物质供应不足，氧分压低，不能满足中心部位的种子细胞生 长、增殖、分化和成骨的需要，导致种子细胞停止生长甚至死亡，使成骨效应丧失，其根本 原因在于组织工程骨骨诱导效应不强；另外，支架的成骨效应欠佳也是制约人工骨支架发 展的一个重要原因。为此，国内外研究了三种方法解决其骨化活性：一种是采用联合细胞培 养，将培养的细胞与人工骨支架复合，将不同类型的细胞进行混合培养，通过细胞间存在着 精细的相互调控关系来促进细胞的生长分化。联合细胞培养的优点是活细胞能促进成骨效 应，但操作繁琐，培养周期长，临床不易于推广。另外一种方法就是采用显微外科手术来促 进其骨诱导效应，目前主要有预购带血管蒂筋膜瓣包裹人工骨、带血管蒂肌瓣包裹人工骨 支架。缺点也很明显，就是先需行预购手术，增加了病人的痛苦。还有一种方法就是采用细 胞生长因子来促进其骨诱导效应，方法简便，临床易于推广。相对来说，采用细胞生长因子 促进人工骨支架骨化活性具有显著地临床应用优势。
[0007] 本发明中为了使三维微支架植入骨组织后能够更好诱导间充质干细胞向成骨细 胞分化，促进骨组织与支架相结合，发明人制备出了一种载药缓释三维微支架。所述载药缓 释三维微支架采用壳聚糖微球等良好的药物控释载体，rhBMP-2等具有较强的成骨诱导活 性因子，制成缓释的微球，然后通过胶原将微球充填于带孔的的三维支架内，制备的载药缓 释三维微支架为细胞提供了更好的生长环境，进一步促进骨组织与支架相结合。
[0008] 本发明克服了现有技术的弊端，提供了一种载药缓释三维微支架，提高了现有支 架的性能，使众多由于疾病、事故等原因导致的骨组织缺损患者完全治愈成为可能，给越来 越多的患者带来希望，具有重要的临床应用价值。


【发明内容】

[0009] 本发明的目的在于提供一种含负载微球的支架，所述支架包括3D打印的金属支 架、填充在3D打印的金属支架内部的三维微支架以及填充于三维微支架内的负载微球。
[0010] 进一步，通过将CT图像导入三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，在计算 机中建立多孔结构的三维模型，3D打印制得金属支架；三维图像软件优选Mimics或CAS。 优选的，得到目标骨组织的三维图像，以平均孔柱为lOO-lOOOum、孔径为300-3000um，以正 六面体、正十二面体结构单位充填、扩展该图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型。优 选孔柱为300um、孔径为1500um的正十二面体结构单位充填、扩展该图像，得到个性化的多 孔连通三维数字模型。所述3D打印制得金属支架选自多孔纯钛支架、多孔纯镁支架、多孔 钛合金支架、多孔钽铌合金中的一种或几种，优选多孔钛支架。
[0011] 所述三维微支架由明胶溶液、羟基磷灰石形成的凝胶组成。所述羟基磷灰石粉末 优选为纳米羟基磷灰石粉末。
[0012] 进一步，轻基磷灰石被替换为磷酸|丐、硫酸|丐、聚酯（polyesters),聚二氧 六环酮（polydioxanone),聚富马酸二轻丙酯（propylene fumarate，PPF)、聚原酸酯 (polyorthoesters)、聚酐（polyanhydrides)以及聚氨酯（polyurethanes)等的一种或几 种。
[0013] 进一步，明胶被替换为胶原、葡萄糖胺聚糖、纤维蛋白、真丝、壳聚糖、海藻酸钠、透 明质酸一种或几种。
[0014] 进一步，以戊二醛溶液或EDC/NHS作为交联剂加入明胶溶液、羟基磷灰石形成的 混合液中。
[0015] 负载微球即"负载物"与微球载体连接制备的"负载物-载体结合物"。可以改善和 控制负载物在体内的转运和代谢，实现附着物的缓释和定向，提高生物利用度和治疗指数。
[0016] 进一步，所述"负载物"选自一种或几种细胞和/或一种或几种药物和/或一种或 几种生长因子和/或一种或几种基因。
[0017] 所述细胞选自下列中的一种或几种：软骨细胞、骨髓基质细胞、上皮细胞、内皮细 胞、骨髓间充质干细胞。
[0018] 所述因子选自下列中的一种或几种：生长因子：TGFP，表皮生长因子（EGF)，血小 板衍生生长因子（PDGF)，神经生长因子（NGF)，血管生长因子（VEGF)、集落刺激因子（CSF)， 肝细胞生长因子，胰岛素样生长因子，胎盘生长因子）；分化因子；细胞因子，例如白介素 (如 IL1，IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11，IL-12, IL-13， IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 或 IL-21，每种或 α 或 β)，干扰素（例 如IFN-α，IFN-β和IFN-γ )，肿瘤坏死因子（TNF)，IFN-Y诱导因子（IGIF)，骨形成蛋白 (BMP);趋化因子（如MIPs (巨噬细胞炎性蛋白），例如MIPla和MIPl β ;MCPs (单核细胞 趋化蛋白），例如MCPl，2或3 ;RANTES (调控正常T-细胞表达和分泌的激活））和营养因子。 例如，生长因子可选自TGF-β 1，TGF-P2, TGF-P3, TGF-P4, TGF-βδ或TGF-β超家族的 任何其他成员包括激活素类，抑制素类，以及骨形成蛋白包括BMP I，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5， BMP6, BMP7组成的组。
[0019] 所述药物选自下列中的一种或几种：抗感染、镇痛的药物、抗癌药物、促进骨愈合 药物、防止骨溶解的药物。进一步的，所述药物选自：美福仙、两亲酶素、新霉素、莫匹罗星、 多粘菌素 B、抗真菌药、喳诺酮类、常规的镇痛剂（扑热息痛、曲马多、可待因、奈福泮等）、非 类固醇类抗炎药（NSAID)、AINS(酮基布洛芬、吲哚美辛）、吗啡衍生产品一种或几种。
[0020] -般来说，主要的载体物质包括：（1)天然来源的聚合物，如胶原、纤维蛋白、 透明质酸、大豆或藻类衍生物、壳聚糖、羟基化烷烃的聚合物等。在哺乳动物的结缔组 织与骨头的非矿物质成分中，胶原是最常见的蛋白质，并且在细胞浸润和创伤修复中 具有一定的地位。藻酸盐是一种在海藻表面大量存在的非免疫原性的多糖，因为其具 有凝胶性质，在组织工程中运用较广。壳聚糖（chitosan)是一种由乙酰氨基葡萄糖 (N-acetyl-D-glucosamine)和甲壳质的N-脱乙酰作用制备而成的带正电荷的多糖，它因 具有良好的生物相容性、螯合性及可降解性而著称。透明质酸是另一种天然高分子，在创伤 修复中起着重要的作用，透明质酸及其衍生物已经在生物医学和组织工程应用中大范围被 研究，其形式有凝胶、海绵、填充物和眼外科手术中的皮下注射粘胶。纤维蛋白就是一种与 凝血有关的蛋白质，纤维蛋白胶是利用纤维蛋白原和凝血酶的反应制成具有强大點合力的 纤维蛋白凝块，其本身具有促进毛细血管形成的作用，可以加速创伤的愈合。其他天然聚 合物有明胶、葡聚糖、纤维素等。（2)无机物质和陶瓷，如羟基磷灰石、磷酸三钙与硫酸盐、还 有生物玻璃与金属等。轻基磷灰石（hydroxyapatite, HA)具有骨传导性，能与骨形成直接 的键合，从1970年开始被广泛地用作临床的骨替代材料，其中仅有多孔状的羟基磷灰石被 研发为支架作为BMPs的缓释载体（微粒、粉末、颗粒、薄片以及块体）。无机材料中的磷酸 钙骨水泥，陶瓷与涂层被证明为多功能的载体，被研发为可植入和可注射的载体，它们能在 体内原位固化并且可用于传递生物活性生长因子（在低温条件下避免了蛋白质的变性）， 具有显著的成骨效应。生物活性玻璃是一种具有硬的、以致密硅为基础的生物活性物质，因 其良好的骨传导和骨融合性能可以直接与骨形成键合，研究发现生物玻璃在体外可引导大 量的局部的骨形成，在体内可增加 BMPs的效力，支持成骨细胞的生长，通过刺激表型的合 成（以碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙蛋白来标记）促进成骨细胞的分化。（3)人工合成可生 物降解聚合物，如聚乳酸、聚乙醇酸及它们的共聚物、聚乙醇酸与聚乙二醇的共聚物和生物 降解材料聚已内酯等；聚乳酸，又称聚丙交酯，是由单个含有羧基和羟基的聚乳酸分子脱水 缩合而成的聚合物，其降解产物为乳酸，可直接参与体内代谢。（4)结合了各种材料或其他 生物分子的的复合载体材料。
[0021] 优选壳聚糖微球负载骨形成蛋白。更优选的，壳聚糖微球负载rhBMP-2或 rhBMP-7。
[0022] 根据不同的反应介质和体系特性，壳聚糖微球的制备方法可分为乳化-交联法、 复凝聚法、喷雾干燥法和乳化-溶剂蒸发法等。此外，还有复乳法、膜乳化法、pH值调节法、 超声-浸泡-研磨法等方法。
[0023] 乳化-交联法
[0024] 乳化-交联法是将壳聚糖的稀酸溶液加入到含有乳化剂的油相中，通过机械搅 拌、超声或匀相乳化等方式得到W/0型乳液，再加入一定量的交联剂，交联剂扩散到水相 中，将壳聚糖交联成微球，经过滤、溶剂洗涤、干燥得到最终的壳聚糖微球。
[0025] 复凝聚法
[0026] 凝聚法又称沉淀法，在壳聚糖的稀酸溶液中边搅拌边缓慢滴加阴离子的沉淀剂， 如海藻酸钠、梭甲基纤维素钠等，降低壳聚糖的溶解度，继续搅拌一段时间后，壳聚糖微球 即从稀酸溶液中析出。复凝聚法是利用两种带有相反电荷的高分子聚合物与壳聚糖以离子 间相互作用交联形成复合微球，材料的溶解度降低，自溶液中析出，共沉淀成微球。此种方 法不需要有机溶剂，而且制备的微球载药率高。
[0027] 喷雾干燥法
[0028] 喷雾干燥法是将壳聚糖溶液经喷雾，雾化成微小的液滴，再与惰性的热气流接触， 液滴中水分和溶剂瞬间蒸发形成壳聚糖微球。喷雾干燥法制备的壳聚糖微球主要作为药物 载体。此方法制备快速、可重复性高，但是壳聚糖微球往往呈多孔结构，小分子的药物释放 过快，再加上壳聚糖溶液经高温处理，容易使药物变性或溶剂爆炸危险，因此，喷雾干燥法 一般不适用于缓释药物体系。
[0029] 乳化-溶剂蒸发法
[0030] 乳化-溶剂蒸发法又称油相干燥法，在制备W/0型乳液或0/W/C)型乳液后，通过 加热或减压方法除去壳聚糖溶液中的有机溶剂使微球固化，也可在溶剂蒸发后对微球进行 化学交联。
[0031] 更优选的，3D打印多孔钛支架；支架内部填充的三维微支架由I型胶原和纳米级 别的羟基磷灰石形成，通过胶原将负载rhBMP-2或rhBMP-7的壳聚糖微球填充三维微支架 内。
[0032] 进一步的，得到含负载微球三维微支架具有多孔疏松结构，平均直径为 50-100 μ m〇
[0033] 本发明的另一个目的在于提供一种含负载微球的三维微支架的制备方法，所述制 备方法包括：
[0034] 1)将CT图像导入三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，在计算机中建立多 孔结构的三维模型；
[0035] 2)依据步骤1)中的三维模型打印支架；
[0036] 3)将明胶用去离子水溶解后，将包载有负载物的壳聚糖微球加入到胶原溶液中， 再加入纳米羟基灰石粉形成浓度为5-10mg/ml的浓度，以EDC/NHS为交联剂，将以上混合液 充分混合；
[0037] 4)将步骤3)得到的混合液滴加到支架上，并进行冷冻干燥，得到负载微球的三维 微支架。
[0038] 进一步，所述制备方法还包括，在得到含负载微球的三维微支架后，将含负载微球 的三维微支架进行灭菌，独立分装处理。优选将含负载微球的三维微支架放入环氧乙烷灭 菌箱中进行灭菌。
[0039] 进一步，明胶用去离子水溶解后，配制成0. 5_20g/ml的浓度，将包载有负载物的 壳聚糖微球按l_20mg/ml加入到胶原溶液中。
[0040] 优选的，本发明提供的一种含负载微球的三维微支架的制备方法，所述制备方法 包括：
[0041] 1)将CT图像导入Mimics或CAD等三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，平 均孔柱为lOO-lOOOum、孔径为300-3000um，以正六面体、正十二面体结构单位充填、扩展该 图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型；
[0042] 2)采用EOS M280金属材料3D打印机，以钛合金（Ti-6A1-4V)为原料，依据设计模 型打印多孔钛支架；
[0043] 3)将明胶用去离子水溶解后，配制成0. 5-20g/ml的浓度，然后将包载有rhBMP-2 或rhBMP-7的壳聚糖微球按l-20mg/ml加入到胶原溶液中，再加入纳米羟基灰石粉形成浓 度为5-10mg/ml的浓度，以EDC/NHS为交联剂，将以上混合液充分混合；
[0044] 4)将步骤3)得到的混合液滴加到支架上，并进行冷冻干燥，得到负载微球的三维 微支架；
[0045] 5)将上述三维微支架放入环氧乙烷灭菌箱中进行灭菌，独立分装处理。
[0046] 本发明的目的在于还提供上述三维微支架在骨缺损修复、及骨界面（骨一骨； 骨一支架）的融合中的应用。当三维微支架负载细胞和/或药物和/或生长因子和/或基 因时，所述三维微支架还可以用于预防疾病复发，减轻疼痛，有利于骨早日恢复负重功能， 促进神经功能恢复，提高生活质量。

【专利附图】

【附图说明】
[0047] 图1.依据三维数字模型打印的多孔钛支架
[0048] 图2.负载微球的三维微支架
[0049] 图3.负载微球的三维微支架电镜扫描图（3000 X)

【具体实施方式】
[0050] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0051] 实施例1制备钛合金-明胶/HA三维微支架
[0052] 制备钛合金-明胶/HA三维微支架：
[0053] 1)将CT图像导入Mimics或CAS三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，以孔 柱为300um、孔径为1500um的正十二面体结构单位充填、扩展该图像，得到个性化的多孔连 通三维数字模型；
[0054] 2)采用EOS M280金属材料3D打印机，以钛合金为原料，依据设计模型打印多孔钛 支架（见图1);
[0055] 3)将牛胶原用去离子水溶解后，配制成lg/ml的浓度，然后将包载有rhBMP-2的壳 聚糖微球按5mg/ml加入到胶原溶液中，再加入纳米轻基灰石粉形成浓度为5-10mg/ml的浓 度，用EDC/NHS为交联剂，将以上混合液充分混合；
[0056] 4)将步骤3制得的壳聚糖微球胶原溶液滴加到支架上，并进行冷冻干燥，得到负 载微球的三维微支架（见图2);
[0057] 5)将上述支架放入环氧乙烷灭菌箱中进行灭菌，独立分装处理。
[0058] 实施例2三维微支架的表征
[0059] 1、三维微支架孔隙率的测定
[0060] 采用改良液体位移法测量人工骨支架的孔隙率。在量筒中置入体积为Vl无水乙 醇，将三维人工骨支架材料放入量筒中，Smin后负压抽吸空气，使无水酒精完全充满于支架 材料的空隙中，记录此时的体积为VZ，再将材料取出记录这时的酒精体积为Vs。按以下公 式计算三维仿生人工骨支架的孔隙率：
[0061] 孔隙率=(V1-V3V(V2_V3) X100%
[0062] 2、三维微支架力学性能分析
[0063] 采用万能力学机测定支架材料的压缩力学性能。以BAM人工骨作为对照。加载速 度为5mm/min，支架材料压扁的最大压力为F (N)，根据公式P = F/A (A为受压面积），求得抗 压强度。根据公式E= σ/ε求得弹性模量。为应力，ε为应变）。
[0064] 结果见表1。
[0065] 表1三维微支架的表征

【权利要求】
1. 一种三维微支架，所述支架包括3D打印的金属支架、填充在3D打印的金属支架内部 的三维微支架以及填充于三维微支架内的负载微球。
2. 根据权利要求1所述的三维微支架，其特征在于，所述金属支架选自多孔纯钛支架、 多孔纯镁支架、多孔钛合金支架、多孔钽铌合金中的一种或几种。
3. 根据权利要求1所述的三维微支架，其特征在于，所述三维微支架由明胶溶液、纳米 羟基磷灰石组成。
4. 根据权利要求1所述的三维微支架，其特征在于，所述负载微球中的负载物选自一 种或几种细胞和/或一种或几种药物和/或一种或几种生长因子和/或一种或几种基因。
5. 根据权利要求4所述的三维微支架，其特征在于，所述细胞选自下列中的一种或 几种：软骨细胞、骨髓基质细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨髓间充质干细胞；所述因子选自下 列中的一种或几种：生长因子、细胞因子、分化因子、趋化因子、MCPs单核细胞趋化蛋白、 RANTES和营养因子；所述药物选自下列中的一种或几种：抗感染、镇痛的药物、抗癌药物、 促进骨愈合药物、防止骨溶解的药物。
6. 根据权利要求4所述的三维微支架，其特征在于，所述因子选自下列中的一种或几 种：TGFP，表皮生长因子EGF，血小板衍生生长因子TOGF，神经生长因子NGF，血管生长因子 VEGF、集落刺激因子CSF，肝细胞生长因子，胰岛素样生长因子，胎盘生长因子；白介素，干 扰素，肿瘤坏死因子TNF，IFN-y诱导因子IGIF，骨形成蛋白BMP ;MIPs巨噬细胞炎性蛋白。
7. 根据权利要求1所述的三维微支架，其特征在于，所述微球选自天然来源的聚合物、 无机物质和陶瓷、人工合成可生物降解聚合物或结合了各种材料或其他生物分子的的复合 载体材料中的一种或几种。
8. 根据权利要求1所述的三维微支架，其特征在于，所述微球选自下列中的一种或几 种：胶原、透明质酸、大豆或藻类衍生物、羟基化烷烃的聚合物、壳聚糖、明胶、葡聚糖、纤维 素；羟基磷灰石、磷酸三钙、硫酸盐、生物玻璃；聚乳酸、聚乙醇酸及它们的共聚物、聚乙醇 酸与聚乙二醇的共聚物、生物降解材料聚已内酯。
9. 根据权利要求1所述的三维微支架，其特征在于，所述负载微球为负载rhBMP-2或 rhBMP-7的壳聚糖微球。
10. 根据权利要求1所述的三维微支架，其特征在于，所述三维微支架具有多孔疏松结 构，平均直径为50-100 iim。
11. 一种三维微支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括： 1) 将CT图像导入三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，在计算机中建立多孔结 构的三维模型； 2) 依据步骤1)中的三维模型打印支架； 3) 将明胶用去离子水溶解后，将包载有负载物的负载微球加入到胶原溶液中，再加入 纳米羟基灰石粉形成浓度为5-10mg/ml的浓度，并加入EDC/NHS为交联剂来交联明胶，将以 上混合液充分混合； 4) 将步骤3)得到的混合液滴加到支架上，并进行冷冻干燥，得到负载微球的三维微支 架。
12. 根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中明胶溶用去离子 水溶解后，配制成〇. 5-20g/ml的浓度，然后将包载有负载物rhBMP-2或rhBMP-7的壳聚糖 微球按l-20mg/ml加入到胶原溶液中。
13.权利要求1-10任意一项所述的三维微支架或权利要求11-12任意一项所述的制备 方法在骨缺损修复中的应用。
【文档编号】A61L27/46GK104353121SQ201410682987
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】吴贵, 尹博, 王海, 吴志宏, 邱贵兴 申请人:吴志宏