硫化氢在制备治疗炎症性贫血药物中的用途的制作方法

本发明属药物制药领域，涉及硫化氢在制药中的新的药物用途，尤其涉及硫化氢在制备治疗炎症性贫血药物中的用途。

背景技术：

现有技术公开了铁是一切生命体不可缺少的必需微量元素，也是人体中最丰富的过渡金属元素；研究显示，铁稳态必须借助于铁离子的吸收、摄取、利用、储存各个环节间的协调，其中任何一个环节出现问题，都将导致铁含量的变化；铁含量过高或者过低都将影响机体的生物学活性；如，铁缺乏会引发以贫血为主要临床症状的机体代谢紊乱；缺铁性贫血是全世界范围内最常见的一种营养素缺乏病，在发展中国家尤为突出；有统计显示，在中国缺铁性贫血的发病率2002年为15％。

研究报道，硫化氢(hydrogen sulfide，H₂S)是一种重要的气体小分子，其已成为继NO和CO之后的第三种生物气体信号分子(gasotransmitter)；催化H2S生成的酶遍布于机体循环、呼吸、免疫、神经、消化和生殖等各个系统；上述酶包括CBS(cystathionine beta-synthase，胱硫醚β-合酶),CSE(cystathionine gamma-lyase，胱硫醚γ-裂解酶；也名as gamma-cystathionase)和3-MST(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-巯基丙酮酸硫基转移酶)；所述CBS和CSE主要存在于细胞浆中，而所述3-MST主要存在于线粒体内(Predmore et al.,2012)；硫氢化钠(Sodium hydrosulfide，NaSH)是一种常用的硫化氢的快速释放剂，其被广泛用于硫化氢的研究；与上述其它两种生物气体信号分子NO和CO一样,所述H₂S具有扩张血管的作用以及在炎症反应中有重要的功能(Paul and Snyder,2012)。然而，迄今为止，尚未见有关硫化氢与铁代谢是否有关以及硫化氢对炎症性贫血的作用的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供硫化氢在制药中的新的药用用途，尤其涉及硫化氢在 制备治疗炎症性贫血药物中的用途。

本发明中，进行了硫化氢对正常小鼠以及炎症性贫血小鼠血清铁的影响实验，在细胞和动物水平观察研究硫化氢是否通过影响铁代谢蛋白影响血清铁的机制等；本发明中，以C57B6为小鼠模型，采用脂多糖和硫氢化钠进行干预，6和24小时后检测血清铁，不饱和铁结合能力，总铁结合能力和载铁饱和度，以及利用western blot检测脾脏样本摄铁蛋白TFR以及排铁蛋白FPN蛋白表达水平；同时利用腹腔诱导的原代巨噬细胞为细胞模型，用脂多糖和硫氢化钠干预6小时和24小时，western blot检测摄铁蛋白TFR以及排铁蛋白FPN蛋白表达水平；实验结果显示：生理情况下，硫化氢通过增加TFR蛋白表达显著增加小鼠血清铁及载铁饱和度；针对炎症性贫血小鼠模型，硫化氢通过抑制脂多糖导致的TFR和FPN蛋白下降，显著抑制脂多糖导致的血清铁和载铁饱和度的下降；针对腹腔诱导的原代巨噬细胞，生理情况下，硫化氢显著的增加TFR蛋白表达，针对脂多糖处理的细胞模型，硫化氢可抑制脂多糖导致的TFR的下降。

本发明实验结果证实，所述的硫化氢可用于制备治疗炎症性贫血的药物。

本发明中，提供了有关缩略词备注说明如下：

CON(control)对照，

NaSH(Sodium hydrosulfide)硫氢化钠，

LPS(Lipopolysaccharide)脂多糖，

Body Weight体重，

FPN(Ferroportin)细胞膜铁转运蛋白，

TFR(Transferrin Receptor)转铁蛋白受体，

Serum iron血清铁，

UIBC(unsaturated iron-binding capacity)不饱和铁结合力，

TIBC(total iron-binding capacity)总铁结合力，

TF(％)载铁饱和度，

Western blot蛋白质印记法(免疫印迹法)。

附图说明

图1显示了生理情况下腹腔注射硫氢化钠以后，C57B6小鼠血清铁增加；炎症情况下，硫氢化钠可以抑制脂多糖导致的血清铁的下降；其中，8周龄C57B6 小鼠，适应性喂养一周后，按体重随机分为4组，每组5只，CON组一次性腹腔注射PBS；NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight；LPS组一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小时和24小时后摘眼球取血；图1A,注射6小时后各实验组血清铁的含量；图1B,注射24小时后各实验组血清铁的含量；图1C,注射6小时后各实验组血清不饱和铁结合能力；图1D,注射24小时后血清不饱和铁结合能力。

图2显示了生理情况下腹腔注射硫氢化钠以后，C57B6小鼠血清铁增加；炎症情况下，硫氢化钠可抑制脂多糖导致的血清铁的下降，其中，8周龄C57B6小鼠，适应性喂养一周后，按体重随机分为4组，每组5只；CON组一次性腹腔注射PBS；NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight；LPS组一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小时和24小时后摘眼球取血；图2A,注射6小时后各实验组血清总铁结合能力；图2B,注射24小时后各实验组血清总铁结合能力；图2C,注射6小时后各实验组血清载体饱和度；图2D,注射24小时后各实验组血清载体饱和度。

图3显示了生理情况下腹腔注射硫氢化钠以后，TFR蛋白表达量增加；炎症情况下，硫氢化钠可以抑制脂多糖导致的TFR的下降，其中，8周龄C57B6小鼠，适应性喂养一周后，按体重随机分为4组，每组5只；CON组一次性腹腔注射PBS；NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight；LPS组一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小时后摘眼球取血，并取脾脏，Western Blot检测脾脏内TFR的含量，Image J软件作灰度分析，GraphPad软件作图。

图4显示了生理情况下腹腔注射硫氢化钠以后，FPN蛋白表达无显著变化；炎症情况下，硫氢化钠可抑制脂多糖导致的FPN的下降；其中8周龄C57B6小鼠，适应性喂养一周后，按体重随机分为4组，每组5只；CON组一次性腹腔注射PBS；NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight；LPS组一次性腹腔注射脂多糖1mg/kg Body Weight；LPS+NaSH组一次性腹腔注射硫氢化钠5mg/kg Body Weight和1mg/kg Body Weight，6小时后摘眼球取血，并取脾脏，Western Blot 检测脾脏内FPN的含量，Image J软件作灰度分析,GraphPad软件作图。

图5显示了C57B6小鼠腹腔诱导的原代巨噬细胞，生理情况下，硫氢化钠增加TFR蛋白的表达；炎症情况下，硫氢化钠抑制脂多糖导致的TFR蛋白的下降；其中，8周龄的C57B6小鼠，适应性喂养一周后，每只小鼠腹腔注射1ml的3％的巯基乙酸培养基，三天后收集原代巨噬细胞，按照每孔2×10⁶个细胞接种于6孔板，CON组加PBS,NaSH组给予终浓度200μmol硫氢化钠，LPS组给予1μg/ml的脂多糖，LPS+NaSH组给予终浓度200μmol硫氢化钠和1μg/ml的脂多糖，24小时后收集细胞，Western Blot检测细胞内TFR蛋白的表达。

具体实施方式

实施例1

材料和方法：

1.动物C57B6雄性小鼠，8周龄，适应性喂养一周后，按体重随机分为四组，分别为空白对照组(CON)，硫氢化钠组(NaSH)，脂多糖组(LPS)，脂多糖和硫氢化钠组(LPS+NaSH)，每组5只。小鼠按照100μl/10g给药，腹腔注射，空白对照组给予PBS,硫氢化钠组按照5mg/kg Body Weight硫氢化钠，脂多糖组按照1mg/kg Body Weight脂多糖，脂多糖和硫氢化钠组同时给予5mg/kg Body Weight硫氢化钠和1mg/kg Body Weight脂多糖。给药6小时和24小时以后，摘眼球取血，常规解剖取脾脏；

2.制备血清：

摘眼球获得的血样室温放置1小时，4000转离心5分钟，取上清，再次4000转离心5分钟，取上清即为血清；

3.血清铁及不饱和铁结合能力检测

使用POINTE的Iron/TIBC Reagent Set试剂盒测量血清，检测铁的相关指标用：

A、血清铁

准备分别标记有blank，standard和sample的96孔板，每孔中加入100μliron buffer，在blank中加入20μl去离子水，在standard中加入20μl的Iron standard(500μg/dl)，在sample中加入样品20μl，以blank为0，用酶标仪测定560nm每个孔的吸收读数(A1)，每个孔中加入2μl的 iron color reagent，混合均匀，37度放置10分钟，以blank为0，用酶标仪测定560nm每个孔的吸收读数(A2)；

血清铁(μg/dl)＝(A2sample-A1sample)/(A2std-A1std)*concentration of St；

B、血清UIBC

准备分别标记blank，standard和sample的96孔板，每孔中加入80μl的UIBC buffer，在blank中加入40μl的去离子水，在standard中加入20μl去离子水和20μl的。standard，在sample中加入20μl的sample和20μl的standard，以blank为0，用酶标仪测定560nm每个孔的吸收读数(A1)，每孔中加入2μl的iron color reagent，混合均匀，37度放置10分钟，以blank为0，用酶标仪测定560nm每个孔的吸收读数(A2)

UIBC(μg/dl)＝Conc of std-(A2sample-A1sample)/(A2std-A1std)*Concentr ation of stdTIBC(μg/dl)＝血清铁+UIBC TF(％)＝血清铁/TIBC；

4，制备组织蛋白：

0.01克脾脏组织，加100μlRIPA裂解液,振荡器震荡，60赫兹，3分钟，13200转离心15分钟，取上清；

5，腹腔诱导的原代巨噬细胞

C57B6雄性小鼠，8周龄，适应性喂养一周后，3％巯基乙酸培养基腹腔注射，三天后常规处理小鼠，75％的乙醇溶液浸泡10秒，常规处理消毒腹部肌层；用10ml注射器吸10mlPBS注入腹腔，轻柔腹部后，用5ml注射器吸取细胞悬液，300g离心10分钟，将细胞稀释到1×10⁶/毫升，接种到6孔板，每孔加2毫升的细胞悬液，5％CO₂温箱孵育3h后，换液，并用PBS 2次，弃去未粘附细胞，加入DMEM高糖完全培养基(10％胎牛血清，1％的青霉素和链霉素)，24小时后加药处理细胞，对照组加PBS,硫氢化钠组加入200μmol终浓度的硫氢化钠，LPS组加入1μg/ml终浓度的脂多糖，硫氢化钠加脂多糖组加入200μmol终浓度的硫氢化钠和1μg/ml终浓度的脂多糖，分别于6小时和24小时后收集细胞；

6，制备细胞蛋白样品

细胞取出立即放冰上，用PBS洗三遍细胞，每孔加入60μl的加了蛋白酶抑制剂细胞裂解液，刮下细胞，收集到1.5ml的离心管，冰上静置三十分钟，超声 五次，13200转离心15分钟，吸上清。

实验结果显示：

1.在生理条件下，硫化氢显著增加血清铁和载铁饱和度，在炎症性贫血情况下，硫化氢可以显著的抑制血清铁和载体饱和度的下降；

其中，为了研究硫化氢对血清铁及对脂多糖诱导的炎症性贫血的作用，采用SPF级C57B6小鼠，8周龄，适应性饲养一周后按照体重随机分为四组，每组5只，一次性给药，实验利用了硫化氢的快速释放剂硫氢化钠。分别进行于6小时和24小时摘眼球取血离心收集血清。实验结果表明，生理情况下，注射6小时后，硫化氢增加血清铁，但没有显著性差异(图1A)，而注射24小时以后，可以极显著的增加血清铁的含量,P<O.O1(图1B)；注射6小时后和24小时后，硫化氢对不饱和铁结合能力没有显著的影响(图1C，1D)。炎症情况下，注射6小时后，硫化氢对脂多糖导致的血清铁的下降有轻微的上调作用，但没有显著性差异(图1A),而注射24小时后，硫化氢可以抑制脂多糖诱导的血清铁的下降，有显著性差异，p<0.05(图1B)；注射6小时和24小时后，硫化氢对脂多糖诱导的不饱和铁结合能力上调没有显著性的影响(图1C，1D)。综上可知，动物注射5mg/kg硫氢化钠可以显著的增加血清铁的含量以及改善脂多糖导致的炎症性贫血。

同时,本发明检测了注射6小时和24小时血清总铁结合能力，实验结果表明硫化氢无论在生理还是炎症性情况下，对血清总铁结合能力没有显著影响(图2A,图2B)。对于载铁饱和度，注射6小时在生理和炎症情况下硫化氢对载铁饱和度都没有影响(图2C)；注射24小时后，生理情况下，硫化氢可以显著增加载铁饱和度P<0.05(图2D),炎症情况下，硫化氢可以抑制脂多糖导致的载铁饱和度的下降，具有极显著差异(P<0.0001)(图2D)。

2.在生理条件下，硫化氢显著增加小鼠脾脏TFR表达，在炎症性贫血情况下，

硫化氢可以显著的抑制脂多糖诱导的TFR的下降；其中，

硫化氢可以显著的增加血清铁及载铁饱和度，同时还可以改善脂多糖诱导的的炎症性贫血，进一步实验检测了铁摄取的主要蛋白TFR以及铁排出的蛋白FPN的蛋白表达情况，结果显示，在生理情况下，动物腹腔注射5mg/kg硫氢化钠6小时后，可以极显著的增加铁摄取蛋白TFR的表达(P<0.01)。动物腹腔注射 1mg/kg的脂多糖6小时后，导致TFR蛋白表达下降(P<0.01),而同时注射硫氢化钠和脂多糖，硫氢化钠可以逆转TFR的下降，使TFR蛋白的表达上升到正常对照组TFR蛋白表达水平，与正常对照组没有显著性差异(P>0.05)(图3)。

3.在生理条件下，硫化氢对小鼠脾脏FPN没影响表达，在炎症性贫血情况下，硫化氢可以显著的抑制脂多糖诱导的FPN的下降，其中，

鉴于Ferroportin(FPN)是目前已知的唯一的往细胞外运输非血红素铁的通道蛋白，它主要表达在巨噬细胞、十二指肠上皮细胞及肝脏实质细胞，生理条件下，C57B6小鼠腹腔注射5mg/kg的硫氢化钠对铁输出蛋白FPN没有影响，腹腔注射1mg/kg的脂多糖可以显著的降低FPN蛋白的表达水平(P<0.0001),同时注射脂多糖和硫氢化钠可以极显著的逆转脂多糖导致的FPN的下降(P<0.0001)(图4)，本实验结果表明，硫化氢可以显著的抑制的脂多糖诱导的FPN蛋白水平的的下降；

本实验结果进一步证实，生理条件下硫化氢可以显著的增加小鼠血清的水平，其是通过增加摄铁蛋白TFR蛋白表达水平，使进入血清的铁的显著增加；炎症条件下，硫化氢可以改善脂多糖诱导的炎症性贫血，其是通过抑制脂多糖导致的TFR及FPN蛋白表达水平的下降，从而使进入血清的铁增加。

4.在生理条件下，硫化氢显著增加小鼠腹腔诱导的巨噬细胞的TFR的表达，在炎症性贫血情况下，硫化氢可以显著的抑制脂多糖诱导的TFR的下降，其中，利用巯基乙酸培养基腹腔诱导的原代巨噬细胞，研究硫化氢单一因素对铁代谢蛋白的影响，结果表明，200μmol的硫氢化钠孵育细胞24小时后可以显著的增加TFR的表达(P<0.01)，加入1μg/ml的脂多糖可以显著的使TFR表达的下降(P<0.0001),而同时加入硫氢化钠和脂多糖，则可以逆转脂多糖导致的TFR蛋白表达水平的下降，使TFR蛋白表达水平与对照组没有显著性差异(P>0.05)。