褐藻胶寡糖及其衍生物在治疗炎症中的应用的制作方法

本发明涉及褐藻胶寡糖及其衍生物及其在治疗炎症方面的应用。

背景技术：

炎症(Inflammation)是指生物组织受到外伤、出血或病原感染、异物等刺激，激发的生理反应。炎症反应涉及一些特定自体活性物质，如前列腺素类和白三烯类物质，及特定炎性细胞因子，如白介素类等物质的变化。炎症的发生除清除异物、消除感染外。过度的炎症反应还能够损伤机体自身物质。目前，常用抗炎药物除对因使用抗生素外，主要是甾体和非甾体抗炎药物。

褐藻胶是褐藻细胞壁的主要组成成分，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸通过1,4-糖苷键连接形成的线性阴离子多糖。褐藻胶是一种高分子化合物，分子量较大，一般在几万至几百万道尔顿之间。褐藻胶来源丰富，并已广泛应用于食品、化工和医药业等。褐藻胶具有抗凝血、抗病毒、抗菌、提高免疫力、抗肿瘤和抗炎等多种生物活性。

但由于褐藻胶分子量较大，使其在药物应用方面受到一定的限制。因此通过各种降解方法制备的褐藻胶寡糖，包括甘露糖醛酸寡糖、 古罗糖醛酸寡糖、甘古糖醛酸寡糖及其衍生物，在糖化学、糖生物学、糖工程以及糖类药物等研究领域具有重要的研究价值。可以使用很多方法降解褐藻胶得到褐藻胶寡糖，包括酶解法、化学降解法和物理降解法。

技术实现要素：

本发明提供一种褐藻胶寡糖及其衍生物在治疗炎症中的用途。本发明所述褐藻胶寡糖是褐藻胶水解降解产物。优选地，本发明所述褐藻胶寡糖是分子量在300-4500Da范围内的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐是选自β-D-甘露糖醛酸通过1，4糖苷键连接形成的甘露糖醛酸寡糖或还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其药学上可接受的盐。优选地，本发明涉及式(I)或式(II)的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明提供在氧化剂存在下制备的还原端1位为羧基的式(II)的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明还提供所述各种褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐用于制备治疗炎症的药物中的用途。本发明还涉及用于治疗炎症的本发明所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。本发明还涉及一种治疗炎症的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受 盐。

本发明在一个方面涉及下列结构式(I)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

式(I)中，n表示0-20的一个或多个整数，例如n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一个或多个整数。

本发明中还涉及由下列结构式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

式(II)中，n表示0-20的一个或多个整数，例如n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的一个或多个整数。

上述式(I)和(II)中，优选n＝0-10，更优选n＝2-8，最优选n＝4。n＝0-10的褐藻胶寡糖(优选n＝2-8，最优选n＝4)的生物效果较佳的原因尚不清楚，可能是它们较易被机体细胞识别和接受。在一些实施方式中，n还可以是选自所述0-20范围内的一个或多个整数。

本发明所述的例如式(I)和(II)褐藻胶寡糖可以采用专利号为ZL200580009396.5中的方法制备及进行结构鉴定。在本发明的一个较 佳实施方式中，结构式(I)所示的褐藻胶寡糖的制备方法是：将含有多聚甘露糖醛酸钠盐(它是褐藻胶的一种成分并在商业上可获得，或者例如参照中国专利ZL200580009396.5进行制备)的溶液(优选水溶液)置于高压釜中，于pH2-6、温度100-120℃的条件下反应2-6小时。然后从高压釜中将反应后的溶液取出，并中和(例如使用NaOH溶液)该反应后的溶液至中性。在搅拌的情况下，将所述中性溶液缓慢加入到乙醇(例如，工业乙醇、95％乙醇或无水乙醇)中，进行醇沉。然后，过滤分离醇沉所得固体物质(例如抽滤)，优选在过滤时用乙醇(优选无水乙醇)洗涤过滤所得固体物质。将分离得到的固体物质(通常为白色)进行干燥，即为式(I)所示褐藻胶寡糖粗品混合物。优选地，可将该褐藻胶寡糖粗品混合物进一步配成溶液(优选水溶液)，然后向该溶液中加入95％乙醇，再次进行醇沉。过滤分离再次醇沉所得沉淀物并任选地用无水乙醇洗涤。分离该沉淀物并干燥，得到固体物质。将该固体物质配成溶液(优选水溶液)，用滤膜(例如3μm孔径的滤膜)过滤该溶液并收集所得滤液。将该滤液在分子排阻色谱(Bio-Gel-P6或Bio-Gel-P10凝胶柱，例如1.6×180cm或其他尺寸)上进行洗脱分离，作为流动相的洗脱液可以是NH₄HCO₃等等。使用多个容器从该色谱依次收集洗脱液，并用硫酸-咔唑法检测各容器洗脱液中的糖含量。硫酸-咔唑法检测法是使用硫酸-咔唑显色，用常规紫外光谱仪检测，结果以光密度值(OD值)表示，不同的光密度值表示糖含量不同。出于方便的目的，可将不同分子量褐藻胶寡糖依次称为组分1、2、3……等等。根据该检测结果分别收集含 有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分(例如组分1、2、3……等等)的洗脱液各自分别浓缩、除盐、并冷冻干燥，从而得到具有不同分子量的式(I)所示褐藻胶寡糖。所述具有不同分子量褐藻胶寡糖对应于式(I)所示褐藻胶寡糖中n具有不同的值。当目标产物是褐藻胶寡糖混合物时，可以通过将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液分别干燥后混合、或将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液合并后干燥，从而得到目标混合物。

结构式(II)所示的褐藻胶寡糖的制备方法是：将上述未经分子排阻色谱分离的式(I)所示褐藻胶寡糖粗品混合物或者分离后的具有不同n值的式(I)所示褐藻胶寡糖与氧化剂在加热条件下反应，从而得到式(II)所示的褐藻胶寡糖。在一个具体实施方式中，所述氧化剂是氢氧化铜(例如通过向氢氧化钠溶液中加入硫酸铜溶液并立即混匀而得到的)。将新鲜氧化剂加入到上述未经分子排阻色谱分离的式(I)所示褐藻胶寡糖粗品混合物或者分离后的具有不同n值的式(I)所示褐藻胶寡糖制成的溶液(例如水溶液)中加热反应，直至不再有砖红色沉淀产生。将该反应体系进行离心处理以去除沉淀从而得到上清液。出于检验氧化反应是否彻底的目的，可取少许上清液再次加入所述氧化剂，检查是否还有砖红色沉淀产生。若还有砖红色沉淀产生，则将上述离心所得全部上清液与另外部分的所述氧化剂继续进行反应，直至检验时不再有砖红色沉淀产生为止。将最后得到的反应体系离心分离获得上清液。向所得上清液中加入乙醇(例如，工业乙醇、95％乙醇或无水乙醇)进行醇沉。过滤分离醇沉所得固体物 质，并用无水乙醇洗涤该固体物质。干燥所得固体物质。根据与上述结构式(I)的褐藻胶寡糖的制备方法中相同的分子排阻色谱分离方法进行分离。从而得到具有不同分子量的式(II)所示褐藻胶寡糖。所述具有不同分子量的褐藻胶寡糖对应于式(II)所示褐藻胶寡糖中n具有不同的值。当目标产物是褐藻胶寡糖混合物时，可以通过将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液分别干燥后混合、或将含有不同褐藻胶寡糖组分的洗脱液合并后干燥，从而得到目标混合物。

本发明所述式(I)或式(II)褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐的衍生物包含一个或多个羟基被无机酸或有机酸酯化的酯。能与本发明式(I)或式(II)褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐的一个或多个羟基形成酯的所述有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、草酸、羟基乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、丁二酸、戊酸、丙烯酸、草酸、马来酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、甲磺酸、乳酸、水杨酸、乙酰水杨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、羟基丁酸、己二酸、邻苯二甲酸、扁桃酸、苯甲酸、硼酸等。能与本发明式(I)或式(II)褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐的一个或多个羟基形成酯的所述无机酸包括但不限于：硫酸、亚硫酸、磷酸、偏磷酸、亚磷酸、次磷酸、焦磷酸、多聚磷酸等。

本发明所述式(I)或式(II)寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐包含：无机盐，如锂盐、钠盐、钾盐、铍盐、镁盐、钙盐、铁盐、锌盐、硒盐、钒盐、锡盐、硅盐、锶盐，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成的碱性加成盐，其中优选钠盐。所述药用盐可用 常规方法制得。

本发明所述用于治疗炎症的药物包含所述式(I)或式(II)褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受载体。本发明所述药物可以是片剂、硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液和用于口服或非口服给药的缓释制剂的形式。

本发明所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体，本发明的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、 糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。

制备各种含有各种比例活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述。制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。

以已知的方法制造本发明的药物制剂，包括常规的混合、溶解或冻干方法。

本发明的药物以适于选定的施用方式的各种途径施用，例如口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。

因此，本发明的药物以适当的药学上可以接受的载体(如惰性稀释剂或可食用的载体)可以全身施用，例如，口服。它们可以封闭在硬或软壳的明胶胶囊中，可以压为片剂。对于口服治疗施用，活性化合物可以结合一种或多种赋形剂，并以可吞咽的片剂、颊含片剂、含片、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、圆片等的形式使用。这种制剂应该包含至少0.1％的活性化合物。这种制剂中活性化合物的比例当然可以变化，可以占给定的单位剂型重量的大约0.01％至大约99％。在这种治疗有用的药物制剂中，活性化合物的量使得能够获得有效剂量水平。

片剂、含片、丸剂、胶囊剂等也可以包含：粘合剂，如黄蓍胶、 阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香味。当单位剂型是胶囊时，除了上面类型的材料，它还可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在，作为包衣，或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含活性化合物，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂(如樱桃香料或桔子香料)。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可以接受的且以应用的量为无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和缓释装置中。

活性化合物也可以通过输注或注射到静脉内或腹膜内施用。可以制备活性化合物或其盐的水溶液，任选可混和的无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。

适于注射或输注的药物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散剂的即时制剂的活性成分(任选封装在脂质体中)的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在所有情况下，最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液体分散介质，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合 物。可以维持合适的流动性，例如，通过脂质体的形成，通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小，或通过表面活性剂的使用。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、缓冲剂或氯化钠。通过使用延缓吸收剂的组合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以产生可注射的组合物的延长吸收。

通过将合适的溶剂中的需要量的活性化合物与需要的上面列举的各种其他成分结合，然后进行过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这会产生活性成分加上任何另外需要的无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。

有用的固体载体包括粉碎的固体(如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等)。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本发明的组合药物可以任选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。可以加入佐剂(如香味)和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。

增稠剂(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料)也可和液体载体用于形成可涂覆的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接用于使用者的皮肤上。

化合物或其活性盐或衍生物的治疗需要量，不仅取决于选择的特定的盐，而且取决于施药方式、待治疗的疾病的本质和患者的年龄和状态，最终取决于在场医师或临床医生的决定。

上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元，适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂，或是很多胶囊或片剂。根据所涉及的具体治疗，活性成分的单位剂量的量可以在大约0.01到大约1000毫克或更多之间进行变化或调整。

在一些实施方式中，本发明还涉及用于治疗炎症的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，所述用于治疗炎症的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自β-D-甘露糖醛酸通过1，4糖苷键连接形成的甘露糖醛酸寡糖或还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其药学上可接受的盐。在一些优选的方面，所述用于治疗炎症的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自下列结构式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是选自0-20的一个或多个整数。所述用于治疗炎症的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐还可以选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖 及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自0-10的一个或多个整数。所述用于治疗炎症的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐还可以选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自2-8的一个或多个整数。所述用于治疗炎症的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐还可以选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是4。

在一些实施方式中，本发明还涉及一种治疗炎症的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐。在一些实施方式，所述治疗炎症的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自β-D-甘露糖醛酸通过1，4糖苷键连接形成的甘露糖醛酸寡糖或还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物、或其药学上可接受的盐。在一些实施方式，所述治疗炎症的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自下列结构式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，

其中，式(I)或式(II)中各自的n是选自0-20的一个或多个整数。在一些实施方式，所述治疗炎症的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自0-10的一个或多个整数。在一些实施方式，所述治疗炎症的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐，并且n是选自2-8的一个或多个整数。在一些实施方式，所述治疗炎症的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的根据本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐，其中所述褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐选自式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物、或所述寡糖及其衍生物的药学上可接 受的盐，并且n是4。

本文使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。

在本发明全部实施方式中，本发明所述的褐藻胶寡糖及其衍生物还包括包含所述一种或多种褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受盐的混合物。例如，n还可以是选自各自所述数值范围内的多个整数。

另一方面，在本发明的全部实施方式中，本发明所述数值范围意在涵盖所述范围内的任意整数。例如，在本发明的全部实施方式中，式(I)或式(II)表示的褐藻胶寡糖及其衍生物或所述寡糖及其衍生物的药学上可接受的盐中n可以是0-20范围内的任意整数，比如n可以是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的一个或多个整数。

本发明所述炎症包括各种炎症，包括但不限于急性炎症、慢性炎症、血管炎症、神经炎症、中枢神经炎症、外周神经炎症、关节炎(例如骨关节炎、骶髂关节炎等、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎等)、强直性脊柱炎、炎症性肠病(例如克罗恩病和溃疡性 结肠炎)、炎症性糖尿病性溃疡、炎症性皮肤病(例如银屑病、特应性皮炎、湿疹)等。

除非特别指定，本发明所述的百分含量是指重量百分含量。

下面，本发明将通过实施例展示本发明的有益效果。本领域技术人员会知道，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1：式(I)所示褐藻胶寡糖柱分离图。A：P6柱分离图；B：P10柱分离图。

图2：式(II)所示褐藻胶寡糖柱分离图。A：P6柱分离图；B：P10柱分离图。

具体实施方式

实施例一 褐藻胶寡糖的制备

称取1g多聚甘露糖醛酸钠盐(重均分子量8235Da，上海绿谷制药有限公司提供)，加入适量蒸馏水配成1％(重量百分比)的多聚甘露糖醛酸钠水溶液。用盐酸将所述1％的多聚甘露糖醛酸钠水溶液的pH值调节为4，然后将该水溶液置于高压釜中。在110℃温度下加热反应4小时。从高压釜中取出该反应后的溶液并使其冷却。冷却后，用NaOH溶液调节该反应后溶液的pH值得到中性液体。在搅拌条件 下，将所述中性液体缓慢加入到该液体体积4倍体积量的乙醇中，进行醇沉并静置过夜。过滤分离醇沉所得固体物质，并在过滤分离时用无水乙醇洗涤过滤分离所得固体物质，最终得到白色滤饼。将该滤饼置于60℃烘箱中干燥，得褐藻胶寡糖粗品。

取上述褐藻胶寡糖粗品1g，配成10％的水溶液，用95％乙醇溶液再次进行醇沉。过滤分离再次醇沉所得沉淀物用无水乙醇洗涤该沉淀物。分离该沉淀物并干燥，得到固体物质。将该固体物质配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔径膜过滤该水溶液并收集滤液。将该滤液在分子排阻色谱Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)上进行洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管从该柱色谱收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各试管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自分别减压浓缩并冷冻干燥，弃去组分1，得到分别具有不同分子量的式(I)所示褐藻胶寡糖组分2-12(根据后续检测可知，n分别具有0-10的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图lA)。将Bio-Gel-P6凝胶柱难以分离的组分继续用Bio-Gel-P10凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各试管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自 分别减压浓缩并冷冻干燥，而得到分别具有不同分子量的式(I)所示褐藻胶寡糖组分13-24(根据后续检测可知，n分别具有11-22的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图lB)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是两种具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻胶寡糖可以在P6柱上得到较好的分离，分子量在3000-6000Dalton的褐藻胶寡糖可以在P10柱上得到较好的分离。经与已有对照品比较，紫外光谱分析、红外光谱分析、¹H-NMR光谱分析、¹³C-NMR光谱分析以及质谱分析后可知，在P6柱图(图1A)和P10柱图(图1B)中，分别得到组分2-24，其分别为n是0-22的式(I)所示褐藻胶寡糖化合物。根据谱图结果，合并n＝2-8的式(I)所示褐藻胶寡糖洗脱液并干燥，然后得到n＝2-8的式(I)所示褐藻胶寡糖混合物。

实施例二 褐藻胶寡糖氧解产物的制备

取5g上述未经分子排阻色谱分离的褐藻胶寡糖粗品配成5％(重量百分比)的水溶液。通过向50ml的10％(重量百分比)氢氧化钠溶液中加入25ml的5％(重量百分比)的硫酸铜溶液并立即混匀制备得到新鲜氧化剂氢氧化铜。将该新鲜氧化剂氢氧化铜立即加入到40ml上述5％(重量百分比)的褐藻胶寡糖溶液中，同时通过沸水浴进行加热，直至不再有砖红色沉淀产生。将该反应体系进行离心处理以去除沉淀从而得到上清液。取少许上清液再次加入所述氧化剂，检查是否还有砖红色沉淀产生。若还有砖红色沉淀产生，则将上述离心所得全部上清液与另外部分的所述氧化剂继续进行反应，直至检验不 再有砖红色沉淀产生为止。将最后得到的反应体系离心分离获得上清液。向上清液中加入4倍体积量的95％乙醇进行醇沉，并静置过夜。过滤分离醇沉所得固体物质，并用无水乙醇洗涤该固体物质。将所得固体物质置于60℃烘箱中烘干，得到式(II)所示褐藻胶寡糖粗品。

取上述褐藻胶寡糖粗品1g，配成10％(重量百分比)的水溶液，用95％乙醇溶液再次进行醇沉，过滤分离再次醇沉所得沉淀物并任选地用无水乙醇洗涤。分离该沉淀物并干燥，得到固体物质。将该固体物质配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔径膜过滤该水溶液并收集滤液。将该滤液在分子排阻色谱Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)上进行洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管从该柱色谱收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各集液管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自分别减压浓缩并冷冻干燥，弃去组分1，得到分别具有不同分子量的式(II)所示褐藻胶寡糖组分2-12(根据后续检测可知，n分别具有0-10的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图2A)。将Bio-Gel-P6凝胶柱难以分离的组分继续用Bio-Gel-P10凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L^-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各试管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱 液各自分别减压浓缩并冷冻干燥，而得到分别具有不同分子量的式(II)所示褐藻胶寡糖组分13-23(根据后续检测可知，n分别具有11-21的值)(图中的Volume表示以试管数目表示的洗脱液体积)(图2B)。所述Bio-Gel-P6柱和P10柱是两种具有排阻不同分子大小的聚丙烯酰胺微球，分子量在3000Dalton以下的褐藻胶寡糖可以在P6柱上得到较好的分离，分子量在3000-6000Dalton的褐藻胶寡糖可以在P10柱上得到较好的分离。经与已有对照品比较，紫外光谱分析、红外光谱分析、¹H-NMR光谱分析、¹³C-NMR光谱分析以及质谱分析后可知，在P6柱图(图2A)和P10柱图(图2B)中，分别得到组分2-23，其分别为n是0-21的式(II)所示褐藻胶寡糖化合物。根据谱图结果，收集并合并n＝2-8的式(II)所示褐藻胶寡糖洗脱液并干燥，然后得到n＝2-8的式(II)所示褐藻胶寡糖混合物。

实施例三 褐藻胶寡糖衍生物对二甲苯致小鼠炎症的作用

1实验材料

1.1药品与试剂

按照实施例二的方法制备得到式(II)褐藻胶寡糖(n＝2-8，即图中的组分4-10)混合物。该混合物为类白色粉末，易溶于水；阿司匹林，石家庄欧意药业有限公司生产；二甲苯为国产分析纯试剂。

1.2实验动物

昆明小鼠，雄性，体重21±1.5g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

1.3实验仪器

电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

2实验方法

2.1动物分组与给药

二甲苯是非特异性致炎因子，可在局部引起以血管通透性增加、白细胞游走为主要变化的急性炎症。二甲苯在建立动物炎症模型中作为致炎剂被广泛使用。使用二甲苯建立的炎症模型是本领域常用的动物炎症模型。

取小鼠，随机分为空白对照组、褐藻胶寡糖衍生物25、50、100mg/kg组、阳性药阿司匹林200mg/kg组，每组10只。于分组当天起，空白对照组灌胃生理盐水，其他各组灌胃相应药物，各组动物每天分别给药1次，连续7天。末次给药30分钟后,将20微升二甲苯均匀涂抹于各组小鼠右耳廓两面致炎，以左耳作对照。涂抹致炎剂后0.5小时将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下两耳并以直径9毫米打孔器分别在左右耳对称部位打下圆形耳片，电子天平称重，计算肿胀度和肿胀抑制率，小鼠耳廓肿胀度以每鼠左右耳片重量之差平均值来表示。

肿胀抑制率(％)＝(空白对照组肿胀度-给药组肿胀度)/空白对照组肿胀度×100％

3统计学处理

对结果进行统计分析，结果以“均值±标准差”(mean±SD)表示，采用方差分析(ANOVA)进行比较。以p<0.05为差异有显著意义，p<0.0l为差异有极显著意义。

4实验结果

褐藻胶寡糖衍生物对二甲苯致小鼠炎症的作用

褐藻胶寡糖衍生物对二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀的抑制作用以耳廓肿胀度、肿胀抑制率进行评价,结果见表1。由表1可见，褐藻胶寡糖衍生物连续给药7天后，可明显抑制二甲苯导致的小鼠耳廓肿胀(p<0.05和0.01)，表明褐藻胶寡糖衍生物具有明显的抗炎作用。

表1.褐藻胶寡糖衍生物对二甲苯致炎症小鼠耳廓肿胀度、肿胀抑制率的作用(n＝10，mean±SD)

*p<0.05 **p<0.01 vs 空白对照组

分别以式(I)或式(II)中各自n为选自0-20的单个整数的褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐进行上述试验，也得到了类似的结果。

实施例四 褐藻胶寡糖衍生物对LPS致大鼠中枢神经炎症的作用

1实验材料

1.1药品与试剂

按照实施例二的方法制备得到式(II)褐藻胶寡糖(n＝2-8，即图 中的组分4-10)混合物。该混合物为类白色粉末，易溶于水；细菌脂多糖(LPS)，购自SIGMA公司；双氯芬酸钠，吉林万通药业集团生产；IL-1β及TNF-α检测试剂盒，由上海森雄科技实业有限公司提供；戊巴比妥钠由上海化学试剂采购供应站分装厂提供。

1.2实验动物

Wistar大鼠，5月龄，雄性，体重200-240g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

1.3实验仪器

DDT-2跳台仪，中国医学科学院药物研究所；FSH-2型组织捣碎匀浆机，金坛市金城国盛实验仪器厂；NH-2恒温水浴锅，金坛荣华仪器制造有限公司；FA2004型电子天平，上海天平仪器厂生产；Multiskan MK2酶标仪及Well wash 4MK2洗板机，芬兰雷勃公司；XYJ80-2电动离心机，金坛市恒丰仪器厂；GL-88B漩涡混合器，其林贝尔仪器制造公司；HH.B11.600电热恒温箱，上海跃进医疗器械厂。

2实验方法

2.1动物分组与给药

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的保守成分，是其主要致病物质。LPS外周或脑内注射导致的炎症模型是一种经典的中枢神经炎症动物模型。该模型除导致脑组织IL-1β、TNF-α等炎症因子明显升高外，还可以导致动物学习记忆功能障碍。

取大鼠，随机分为空白对照组、假手术组、LPS模型组、褐藻胶 寡糖衍生物12.5、25、50、100、200mg/kg组、阳性对照双氯芬酸钠10mg/kg组，每组10只。分组当天进行动物模型制备，空白对照组不作处理，假手术组侧脑室注射生理盐水，其余各组侧脑室注射LPS溶液诱导中枢神经炎症模型。动物分组后第二天开始灌胃蒸馏水或相应药物：空白对照组、假手术组和LPS模型组动物灌胃蒸馏水；褐藻胶寡糖衍生物12.5、25、50、100、200mg/kg组、阳性对照双氯芬酸钠10mg/kg组给别给予相应剂量的药物。每天给药1次，连续给药14天后，采用跳台法观察大鼠行为学变化。行为学检测过程中继续给予相应药物。行为学测试结束后，处死大鼠，冰盘上快速剖取脑组织，弃去嗅球小脑和低位脑干，吸取血迹，准确称量每侧皮层脑组织100mg，按组织重量体积比为1:9加预冷的生理盐水制成10％的组织匀浆，4℃3000rpm，离心10分钟，取上清液，检测脑组织IL-1β、TNF-α含量。

3统计学处理

对结果进行统计分析，结果以“均值±标准误”(mean±SE)表示，采用方差分析(ANOVA)进行比较。以p<0.05为差异有显著意义，p<0.0l为差异有极显著意义。

4实验结果

(1)褐藻胶寡糖衍生物对LPS致中枢神经炎症大鼠行为学的作用

跳台实验是测定动物学习记忆能力的实验，属一次性刺激回避反应实验。其实验装置为一长方形反射箱，底部铺以间距为5mm的铜 栅，可通适当的电流，铜栅上有一个高和直径均为4.5cm的平台。实验时，先将动物放在铜栅上，当铜栅通电时，放在铜栅上的动物受到电击，其正常反应是躲避电击跳上平台，大多动物有可能再次或多次跳下平台受到电击，受到电击时又会迅速跳回平台。如此训练5分钟，并记录每只动物跳下平台受到电击的次数(即为错误次数)，以此衡量学习能力。24小时后重新测验，此次测验时，首先将动物放在平台上，记录第一次跳下平台的时间(即为潜伏期)和3分钟内跳下平台受到电击的次数(即为错误次数)，以此衡量记忆保持能力。

连续给药14天结束后，于次日给药后30分钟，测试学习能力。学习能力的结果显示，与空白对照组比较，假手术组大鼠错误次数组间无显著性差异，表明手术对本实验结果无影响；与空白对照组比较，LPS模型组大鼠错误次数明显增加(p<0.01)，显示LPS模型组大鼠学习能力显著下降；与LPS模型组相比，褐藻胶寡糖衍生物组大鼠错误次数明显明显减少(p<0.05或0.01)，结果表明褐藻胶寡糖衍生物明显改善中枢神经炎症大鼠的学习能力。学习能力测试后动物休息1天，再进行记忆保持能力测试，结果显示LPS模型组潜伏期明显缩短，错误次数增加，说明LPS模型组记忆能力显著下降。与LPS模型组相比，褐藻胶寡糖衍生物组潜伏期明显增加，错误次数明显减少(p<0.05或0.01)，结果表明褐藻胶寡糖衍生物明显改善中枢神经炎症大鼠的记忆保持能力。上述结果见表2-3。

(2)褐藻胶寡糖衍生物对LPS致中枢神经炎症大鼠脑组织IL-1β、TNF-α含量的作用

脑组织IL-1β、TNF-α含量的测定结果显示，假手术组大鼠脑组织IL-1β、TNF-α含量与空白对照组无显著性差异(p>0.05)，表明手术对本实验结果无影响；LPS模型组大鼠脑组织IL-1β、TNF-α含量明显升高，与空白对照组比较具有统计学差异(p<0.01)；与LPS模型组相比，褐藻胶寡糖衍生物组大鼠脑组织IL-1β、TNF-α含量均有不同程度减少，其中25、50、100、200mg/kg组与模型组比较具有统计学差异(p<0.05和0.01)。结果(见表4)表明褐藻胶寡糖衍生物可以抑制炎症反应，治疗中枢神经炎症。

表2.褐藻胶寡糖衍生物对LPS致中枢神经炎症大鼠学习成绩的作用(跳台法)(n＝10，mean±SE)

##p<0.01 vs 空白对照组；*p<0.05 **p<0.01 vs LPS模型组

表3.褐藻胶寡糖衍生物对LPS致中枢神经炎症大鼠记忆成绩的作用(跳 台法)(n＝10，mean±SE)

##p<0.01 vs 空白对照组；*p<0.05 **p<0.01 vs LPS模型组

表4.褐藻胶寡糖衍生物对LPS致中枢神经炎症大鼠脑组织IL-1β、TNF-α含量的作用(n＝10，mean±SE)

##p<0.01 vs 空白对照组；*p<0.05 **p<0.01 vs LPS模型组

分别以式(I)或式(II)中各自n为选自0-20的单个整数的褐藻胶寡糖或其药学上可接受盐进行上述试验，也得到了类似的结果。