包含极大螺旋藻提取物作为活性成分的用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物的制作方法

本发明涉及含有极大螺旋藻提取物作为活性成分的用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物。

背景技术：

现代社会的人们生活在视觉文化的洪水中，至少80-90％的生活信息通过眼睛体验获得，由此人们的视力不断降低，表明由环境原因引起的视力下降的速度持续增加。现代人花费大部分时间面对诸如计算机和智能电话等的各种数字屏幕。问题是用于诸如智能手机的数字设备的屏幕的LED发射威胁到眼睛健康的蓝光。蓝光是在可见光之中在400-500nm中检测到的具有蓝色的光，例如从数字装置或智能电话发射的光。当数字设备在夜间打开时，即使屏幕是真实的白色，其总体看上去是蓝色的，这是蓝光的一个很好的例子。如果一个人长时间暴露在蓝光下，光刺激视神经引起疲劳和其他眼部疾病。

蓝光具有强的能量和高的穿透力。因此，一旦光线照原样通过眼睛，它使视网膜失去焦点，这表明受试者看不清楚。因此，长期暴露于蓝光是视网膜老化和变性的原因。蓝光对人的影响表现为干眼，眼疲劳，视力缺失，各种眼病，视细胞(视网膜)衰老，黄斑变性和由褪黑素合成受抑制引起的失眠(Ganka Gakkai Zasshi(学术期刊).2001年10月；105(10)：687-95；Archives of Ophthalmology(眼科期刊)1992年；110：99-104；Review of Ophthalmology(眼科综述)2003年10月；10(10))。

视网膜是位于眼内壁最内侧并与玻璃体接触的透明薄膜。视网膜将受试者的光学信息转换成电信号以通过视神经将图像递送到大脑的视觉区域，这表明视网膜起到主要视觉信息系统的作用。视网膜包括超过一亿个光敏感光细胞，超过一百万个光神经元，即所谓的神经节细胞，以及许许多多的充当线把这些细胞连接起来的神经元。因此，视网膜是人体中最复杂的器官。黄斑，视网膜的中心部分，区分颜色和对象并提供视觉，其由包含视锥细胞的光感受器细胞层和神经节细胞层组成。该区域很薄，其中光中的图像的电信号被转换为化学信号，其通过视神经递送到脑。除黄斑以外的其它部分识别外周并且主要在黑暗中起作用。大约30％的人脑细胞用于处理由视网膜发送的视觉信息。一旦视网膜老化或具有由外部因素引起的问题，视力和视野将缓慢减弱，这导致视觉损伤，并且在最坏的情况下失明。视网膜疾病主要分为三组：视网膜脱离，其中神经视网膜从视网膜色素上皮脱离，从而视网膜分离到眼球的背侧，引起视觉障碍；外周视网膜变性导致视网膜外周组织中的问题；和黄斑变性导致黄斑视网膜中的问题。当视网膜从色素上皮分离时，其不能接收关于所接收的图像的光学信息，并且没有从脉络膜获得营养供应。所以，神经元不能正常工作。如果这个问题被忽略，导致永久性神经衰弱，导致失明。失明的主要原因是由视网膜疾病引起的视力损害。视网膜疾病是随着衰老而发展的，并且是由遗传原因或高度近视或创伤引起的。失明是仅次于白内障的第二常见的眼科疾病。导致失明的三种主要眼科疾病是糖尿病性视网膜病变，黄斑变性和青光眼。视网膜疾病不是致命的。然而，根据增加的老年人口、工业化发展和饮食，视网膜疾病正在迅速增加。因此，除了手术方法之外，基于我们可以服用的草药而非合成治疗药物来开发用于治疗视网膜疾病的组合物是极为重要和迫切的。

极大螺旋藻是一种在盐碱热带地区，例如在非洲乍得湖和墨西哥特克斯科湖等地繁殖的微藻。极大螺旋藻细胞含有大量的叶绿素和藻蓝蛋白，极大螺旋藻细胞通过它们吸收太阳射线以通过活性二氧化碳同化生长。由于这些色素，藻类是蓝绿色的，因此它被分类成蓝绿藻。

由于开发了电子显微镜，微生物的细胞结构已经被精确地鉴定。结果，公开了绿藻或褐藻的结构不同于高等植物的结构。也就是说，绿藻的结构是真核生物结构，相当于高等植物的结构。同时，蓝绿藻的结构被鉴定为类似于细菌的原核生物结构。自20世纪60年代初以来，一些微生物学家已经支持蓝绿藻比藻类更接近细菌，因此它需要包括在杆菌门中。今天，这一主张被接受，因此上面的蓝绿色藻类现在被分为蓝绿色细菌群。然而，在工业领域，它仍然像通常一样被称为“微藻”。

极大螺旋藻的名称源于其螺旋形状。考虑到它具有双链DNA，它是属于蓝细菌的螺旋细菌，其特征在于在动物和植物的中间。极大螺旋藻是一种可食用的微生物，由55-70％的蛋白质，6-9％的脂质，15-20％的碳水化合物和其他微量成分如矿物质，维生素，纤维和其它成分组成。极大螺旋藻不仅包含高浓度的蛋白质，而且包含所有8种必需氨基酸。该微生物中包含的脂肪主要是游离脂肪酸(70-80％)，例如亚油酸和γ-亚麻酸。极大螺旋藻具有低浓度的碳水化合物。然而，其含有鼠李糖和糖原，使得其可以在没有胰岛素的帮助下被吸收，表明其可以用作糖尿病患者的能量来源。原住民一直收集这种微藻作为食物。从营养学研究看，证实了该藻类由有益的成分组成，例如高浓度的蛋白质，包括对人体有帮助的氨基酸和其他营养物质。上述有益成分的实例是别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白(Nanni B.等，Microbiol Res.(微生物学期刊)2001年；156(3)：259-66；Hangeul Donguibogam(韩文东医宝鉴)http://donguibogam.co.kr)。

本发明人试图开发用于预防和治疗视网膜疾病的组合物。结果，本发明人确认了极大螺旋藻提取物具有抑制细胞死亡的作用和抑制被蓝光氧化的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)作用。此后，本发明人证实所述极大螺旋藻提取物及其主要成分如别藻蓝蛋白，R-藻红素和C-藻蓝蛋白可用于制备预防和治疗视网膜疾病的药物组合物，从而完成了本发明。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含极大螺旋藻提取物和别藻蓝蛋白、R-藻红蛋白或C-藻蓝蛋白作为活性成分，本发明还提供包含以上成分的用于改善视网膜疾病的保健食品。

为了达到上述目的，本发明提供一种用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含极大螺旋藻提取物作为活性成分。

本发明还提供用于预防和改善视网膜疾病的保健功能食品，其包含极大螺旋藻提取物作为活性成分。

本发明还提供用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白或C-藻蓝蛋白。

另外，本发明提供一种用于预防和改善视网膜疾病的保健功能食品，其包含作为活性成分的别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白或C-藻蓝蛋白。

有益效果

本发明的极大螺旋藻提取物和作为极大螺旋藻提取物的组成成分，别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)显示出抑制细胞死亡和抑制被蓝光氧化的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)的作用，使得本发明可有效地用作用于预防和治疗视网膜疾病的组合物的活性成分。

附图说明

参考附图可以最好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中：

图1是说明别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)对氧化的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)的抑制作用的图。

图2是说明，别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白细胞保护含有累积的A2E的ARPE-19细胞(用样品后处理)免于蓝光氧化引起的细胞死亡的效果图。

A2E：在A2E积累后未用蓝光处理的细胞，

A2E BL：A2E积累后用蓝光处理过的细胞(阴性对照)，

APC：25μg/ml，

R-PE：25μg/ml

C-PC：6.25,12.5,25,50和100μg/ml。

图3a是说明别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白的保护ARPE-19细胞免于蓝光引起的细胞死亡的效果图(图3b的初步实验)。

APC：12.5,25和40μg/ml，

R-PE：12.5,25和40μg/ml，和

C-PC：12.5,25,50,100和200μg/ml。

图3b是说明别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白细胞保护ARPE-19细胞(用样品预处理)免于蓝光引起的细胞死亡的效果图。

APC：12.5μg/ml，

R-PE：12.5μg/ml，和

C-PC：25,50和100μg/ml。

图4是说明极大螺旋藻提取物(来自缅甸，夏威夷和韩国海洋科学技术研究院简称KIOST的产品)保护累积A2E的ARPE-19细胞(用样品后处理)免于细胞死亡的保护效果图。

图5a是说明极大螺旋藻提取物(来自缅甸，夏威夷和KIOST的产品)保护ARPE-19细胞(图5b的初步实验)免于细胞死亡的保护效果图。

缅甸的产品：125，250，500，750和1000μg/ml，

夏威夷的产品：250，500和1000μg/ml，和

KIOST的产品：250，500和1000μg/ml。

图5b是说明极大螺旋藻提取物(KIOST的产品)在保护ARPE-19细胞(用样品预处理)免于由蓝光引起的细胞死亡的保护效果图。

KIOST的产品：62.5,125,250和500μg/ml。

具体实施方式

在下文中，详细描述本发明。

本发明提供一种用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物，其包含极大螺旋藻提取物作为活性成分。

所述极大螺旋藻提取物优选性地包含以下一种或多种活性成分：别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)。

该极大螺旋藻提取物优选但不限于由以下方法制备，包括以下步骤：

1)向极大螺旋藻中加入提取溶剂后，提取极大螺旋藻；

2)过滤步骤1)中制备的提取物；和

3)在减压下浓缩步骤2)中过滤的提取物，然后干燥。

在上述方法中，步骤1)的极大螺旋藻可以是培养的或购买的。

本发明中的提取溶剂优选为水，醇或其混合物。所述醇优选为C₁-C₂低级醇。本发明中的低级醇优选乙醇或甲醇。提取方法优选为在减压下的高温萃取，沸腾萃取，回流萃取，热水萃取，油脂萃取，室温萃取，超声萃取，离心萃取或蒸气萃取，但不总限于此。特别是，将提取溶剂以极大螺旋藻体积的1-10倍的比例加入到极大螺旋藻中。提取的优选温度为30℃-100℃，但不限于此。萃取时间为2-48小时，但不限于此。提取优选重复2-5次，但不总限于此。

在该方法中，步骤3)中减压下的浓缩优选通过使用真空浓缩器或真空旋转蒸发器进行，但不总限于此。本文的干燥优选通过减压干燥，真空干燥，沸腾干燥，喷雾干燥或冷冻干燥进行，但不总限于此。

螺旋藻提取物具有抑制被蓝色光氧化的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)的作用，并且可以抑制视网膜细胞死亡。

本发明中的视网膜疾病是选自以下的一种或多种疾病：黄斑变性，青光眼，乌谢尔综合症，发身期前视网膜黄斑变性病，巴德-毕德氏综合症(Bardet-Biedl)，卵黄状黄斑变性疾病(Best disease)，无脉络膜症(choroideremia)，旋转性萎缩(gyrate-atrophy)，色素性视网膜炎，黄斑变性，利伯氏先天性黑蒙(Leber氏遗传性视神经病)，蓝色锥形单色(BCM)，视网膜劈裂，遗传性黄斑变性疾病(Malattia Leventinese)，小口氏病(Oguchi)和植烷酸累积症(Refsum)。

在本发明的优选实施方案中，测量极大螺旋藻提取物(缅甸，夏威夷和KIOST的产品)对累积有A2E的ARPE-19细胞的保护及预防死亡的效果。结果，来自夏威夷和KIOST的极大螺旋藻制备的极大螺旋藻提取物显示出剂量依赖性的细胞保护效果。然而，源自缅甸的极大螺旋藻的提取物数据上没有显示出显著的细胞保护作用(参见图4)。

从图5a中可获得，来自KIOST的极大螺旋藻提取物具有剂量依赖性地预防视网膜ARPE-19细胞死亡的作用，由此测量提取物抑制A2E积累和抑制光氧化的细胞保护作用。结果，用浓度为62.5,125,250和500μg/ml的来源于KIOST的螺旋藻提取物处理视网膜细胞，发现细胞的存活率(％)分别增加了0％，10.8％，7.0％和11.9％(参见图5b)。

因此，极大螺旋藻提取物(夏威夷和KIOST产品)具有保护细胞免于蓝光引起的细胞死亡的效果，并且当光氧化被抑制时具有优异的细胞保护效果，表明极大螺旋藻提取物可以用作药物组合物，预防和治疗视网膜疾病。

含有本发明提取物的药物组合物除了所述提取物之外，还可以包括一种或多种与提取物具有相同或相似功能的有效成分。

本发明的药物组合物可另外包括药学上可接受的添加剂，例如，淀粉，胶化淀粉，微晶纤维素，乳糖，聚维酮，胶体二氧化硅，磷酸氢钙，乳糖，甘露醇，太妃糖，阿拉伯胶，预胶凝淀粉，玉米淀粉，纤维素粉末，羟丙基纤维素，欧巴代(Opadry)，羧甲基淀粉钠，卡拉库巴蜡，合成硅酸铝，硬脂酸，硬脂酸镁，硬脂酸铝，硬脂酸钙，白糖，葡萄糖，山梨醇，滑石等。添加剂优选以0.1-90重量份的量加入到药物组合物中。

本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给药，并以药物制剂的一般形式使用。本发明的组合物可以通过与通常使用的稀释剂或赋形剂如填充剂，增量剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂和表面活性剂混合来制备用于口服或肠胃外给药。用于口服给药的固体制剂是片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂和胶囊剂。这些固体制剂通过将本发明的提取物与一种或多种合适的赋形剂如淀粉，碳酸钙，蔗糖或乳糖，明胶等混合来制备。

用于口服给药的液体制剂是悬浮液，溶液，乳液和糖浆，并且除了通常使用的简单稀释剂例如水和液体石蜡之外，上述制剂可以含有各种赋形剂，例如润湿剂，甜味剂，芳香剂和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂是灭菌水溶液，水不溶性赋形剂，悬浮液，乳液，冻干制剂，栓剂和注射剂。水不溶性赋形剂和混悬液除了含有一种或多种活性化合物之外，还可以含有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射的酯如油酸乙酯等。除活性化合物外，栓剂还可以含有合成脂肪酸脂(witepsol)，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂油，甘油明胶等。

本发明的药物组合物可以口服或胃肠外给药，胃肠外给药包括皮肤外用，腹膜内注射，皮下注射，静脉内注射，肌内注射和胸内注射。有效剂量可以根据体重，年龄，性别，健康状况，饮食，给药频率，给药方法，排泄和疾病的严重程度来确定。

本发明组合物的有效剂量可以根据体重，年龄，性别，健康状况，饮食，给药频率，给药方法，排泄和疾病严重程度来确定。优选的剂量为每天0.0001-100mg/kg，更优选每天0.001-10mg/kg，给药频率优选为每天1-6次。

本发明的药物组合物可以单独施用或与外科手术，激素治疗，化学治疗和生物调节剂一起施用，以预防和治疗视网膜疾病。

本发明提供一种用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物，其活性成分包含别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白中的一种。

所述别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白或C-藻蓝蛋白具有抑制被蓝光氧化的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)的作用，并且可抑制视网膜细胞死亡。

视网膜疾病是选自以下的一种或多种疾病：黄斑变性，青光眼，乌谢尔综合症，发身期前视网膜黄斑变性病，巴德-毕德氏综合症(Bardet-Biedl)，卵黄状黄斑变性疾病(Best disease)，无脉络膜症(choroideremia)，旋转性萎缩(gyrate-atrophy)，色素性视网膜炎，黄斑变性，利伯氏先天性黑蒙(Leber氏遗传性视神经病)，蓝色锥形单色(BCM)，视网膜劈裂，遗传性黄斑变性疾病(Malattia Leventinese)，小口氏病(Oguchi)和植烷酸累积症(Refsum)。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明人测量了别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)对蓝光氧化的吡啶鎓双-类视黄醇(A2E)的氧化抑制效果。结果，C-PC对A2E的氧化抑制作用具有统计学意义。特别是，C-PC对A2E的氧化抑制作用最大，其次是R-PE和APC(C-PC>R-PE>APC)(参见图1)。在累积了A2E的ARPE-19细胞中研究了APC，R-PE和C-PC对视网膜细胞死亡的细胞保护作用。结果，在用C-PC处理的组中，细胞存活率剂量依赖性地增加了6.7％，8.1％，17.8％，23.9％和27.6％，而在用APC和R-PE处理的组中没有观察到细胞毒性(参见图2)。

根据图3a所选的C-PC细胞浓度，用APC(25μg/ml)，R-PE(25μg/ml)和C-PC(6.25,12.5,25和50μg/ml)对ARPE-19细胞进行预处理。在确认A2E的积累后，用蓝光照射细胞，然后研究细胞存活率。在用C-PC处理的组中，细胞存活率剂量依赖性地增加。然而，在用APC和R-PE处理的那些组中，细胞保护效果在统计学上不显著(参见图3b)。

因此，APC，R-PE或C-PC被证实具有抑制由蓝光引起的细胞死亡的细胞保护效果，并且通过抑制光氧化而具有优异的细胞保护作用，使得APC，R-PE或C-PC可以有益地用作预防和治疗视网膜疾病的药物组合物。

本发明还提供用于预防和改善视网膜疾病的保健功能食品，其包含极大螺旋藻提取物作为活性成分。

所述螺旋藻提取物具有抑制被蓝光氧化的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)的作用，并且可抑制视网膜细胞死亡。

视网膜疾病选自以下的一种或多种疾病：黄斑变性，青光眼，乌谢尔综合症，发身期前视网膜黄斑变性病，巴德-毕德氏综合症(Bardet-Biedl)，卵黄状黄斑变性疾病(Best disease)，无脉络膜症(choroideremia)，旋转性萎缩(gyrate-atrophy)，色素性视网膜炎，黄斑变性，利伯氏先天性黑蒙(Leber氏遗传性视神经病)，蓝色锥形单色(BCM)，视网膜劈裂，遗传性黄斑变性疾病(Malattia Leventinese)，小口氏病(Oguchi)和植烷酸累积症(Refsum)。

因此，确认了极大螺旋藻提取物具有针对蓝色光引起的细胞死亡的细胞保护效果，并且通过抑制光氧化而具有优异的细胞保护作用，使得极大螺旋藻提取物可有益地用作保健功能食品，用于预防和改善视网膜疾病。

此外，本发明提供了治疗或预防视网膜疾病的方法，其包括向患有视网膜疾病的受试者或正常受试者施用有效剂量的极大螺旋藻提取物的步骤。

本发明还提供了极大螺旋藻提取物，用作预防和治疗视网膜疾病的药物或用作预防和改善视网膜疾病的保健食品。

本发明还提供用于预防和改善视网膜疾病的保健功能食品，其包含以下一种或至少两种活性成分：别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白。

所述别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白或C-藻蓝蛋白具有抑制由蓝光氧化的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)的作用，并且可抑制视网膜细胞死亡。

因此，APC，R-PE或C-PC被证实具有针对由蓝光引起的细胞死亡的细胞保护效果，并且通过抑制光氧化而具有优异的细胞保护作用，使得APC，R-PE或C-PC可以有益地用作预防和改善视网膜疾病的保健功能食品。

此外，本发明提供了用于治疗或预防视网膜疾病的方法，包括给予患有视网膜疾病或正常受试者有效剂量的一种或至少两种活性成分，活性成分选自别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白。

本发明还提供别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白中的一种或至少两种活性成分，用作预防和治疗视网膜疾病的药物或用作预防和改善视网膜疾病的保健食品。

本发明实用的和目前优选的实施方案在如下实例中说明。

然而，应当理解，本领域技术人员在考虑了本发明所公开内容的基础上，可以在本发明的精神和范围内做出变化和改进。

实施例1：极大螺旋藻提取物的制备

极大螺旋藻(韩国海洋微藻培养中心登录号：KMMCC-1057)来自韩国海洋生物材料和水产养殖部韩国海洋微藻培养中心，韩国釜庆大学。

具体地，将培养的极大螺旋藻在多管载体冷冻离心机(远见科技有限公司，Vision Scientific CO.Ltd)中以3000rpm的速率离心25分钟。分离的细胞用1.0％NaCl溶液简单洗涤，然后再次离心。将获得的细胞冷冻干燥，将其用作藻蓝蛋白提取的样品。如下进行提取：向40mg冷冻干燥的样品中加入10mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，然后涡旋15分钟。通过离心(3500rpm，5分钟)获得上清液，将其用作极大螺旋藻提取物。

实施例2：别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白的制备

别藻蓝蛋白(A7472)，R-藻红蛋白(P6161)和C-藻蓝蛋白，购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，它们分别以4mg/ml，10mg/ml和1mg/ml的浓度制备。

实施例3：细胞培养

用于本发明的实验和分析的人成体ARPE细胞(ARPE-19：目录号CRL-2302)来自韩国天主教大学医学院视觉科学研究中心。将上述ARPE细胞放在补充有10％FBS，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM中，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。将细胞以5细胞以中⁴个细胞/孔的密度接种在6孔板中用于进一步实验。

实施例4：A2E合成

用于本发明实验和分析的A2E(吡啶鎓双-类视黄醇)的合成如下：将溶解在乙醇中的全反式视黄醛与乙醇胺(摩尔比为2:1)混合。在暗室中将乙酸加入到混合物中，然后让其发生反应2天。将混合物在40℃下真空浓缩，然后使用硅胶柱色谱纯化。将合成的A2E以20mM的储备浓度溶解于DMSO(二甲基亚砜)中，储存在-20℃。

实验例1：别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白对由蓝光氧化的吡啶鎓双-类视黄醇(A2E)的氧化抑制作用

以下实验测量别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)对视网膜A2E氧化的氧化抑制作用。

具体地，将20地意的A2E(最终浓度：100uM)溶解在160在M含有0.01％DMSO的PBS中，并将混合溶液分配在96孔(180将混合孔)中。将每个样品(对照品or获自极大螺旋藻提取物的APC，R-PE和C-PC)(最终浓度分别为250和500终浓度孔)加入板(20加入板孔)。使用ELISA酶标仪测量OD430(430nm：A2E吸收波长)。用能量强度为2.01J/cm²的蓝光照射该板，然后通过与上述相同的方式再次测量OD。通过使用A2E标准曲线将测量的OD值转换为浓度，并通过蓝光照射前后的浓度差计算氧化的A2E的浓度。

结果，如图1所示，当用C-PC对细胞(250和500μg/ml)处理时，对照品(CTL，100％)，氧化的A2E减少9.1％和21.2％，从中证实C-PC剂量依赖性地具有统计学上显著的A2E氧化抑制作用。同时，当用APC进行细胞处理(250和500μg/ml)时，氧化的A2E通过对照降低2.7％和8.4％。当用R-PE对细胞(250和500μg/ml)处理时，氧化的A2E通过对照减少5.3％和11.1％。因此，确认APC和R-PE均具有A2E氧化抑制作用，虽然没有C-PC的那么大。因此，A2E氧化抑制作用以下列顺序降低：C-PC>R-PE>APC(图1)。

实验例2：APC，R-PE和C-PC对累积有A2E的ARPE-19细胞中的视网膜细胞死亡的细胞保护作用(样品后处理系统)

进行以下实验以研究别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)对视网膜A2E氧化的细胞的保护作用。

具体地，将ARPE-19细胞以2胞以E⁴个细胞/孔的密度分布在24孔板中，然后用A2E(20E，)积累7天(最终浓度：10最终，3次处理)。根据图1的结果，APC(25μg/ml)，R-PE(25μg/ml)和C-PC(6.25，12.5，25，50和100μg/ml处理细胞两次，共3天。用蓝光(4.02J/cm²)照射细胞，然后培养24小时。通过MTT测定测量细胞存活率。MTT测定基于以下原理建立：黄色四唑盐(MTT)与活细胞中的线粒体中的还原酶反应以形成紫色甲瓒晶体。也就是说，随着活细胞群增加，甲瓒晶体的产生增加，导致OD增加。

在MTT测定中，向细胞中加入含有0.5μg/ml MTT的DMEM，阻断光，然后在37℃培养箱中培养4小时。反应完成后，将细胞完全溶解于1ml的DMSO中。用ELISA酶标仪测定OD540。细胞存活率用％表示细胞组(正常对照；A2E)的细胞存活率，其具有A2E累积但未用蓝光照射。

结果，如图2所示，在具有累积但未被蓝光照射的A2E的组(A2E)和具有累积并被蓝光照射的A2E的组(阴性对照：A2E BL)之间存在显着差异。与阴性对照A2E(100％)的细胞存活率相比，分别用这三种物质处理的各组细胞存活率(APC：25μg/ml，R-PE：25μg/ml,C-PC:6.25,12.5,25,50和100μg/ml)增加高达6.7％，8.1％，17.8％，23.9％和27.6％。另一方面，在用APC和R-PE以25μg/ml的浓度处理的那些组中，这浓度是没有细胞毒性的最高浓度，细胞保护效果在数据统计上不显著(图2)。

实验例3：通过抑制A2E积累和抑制光氧化(样品预处理系统)，别藻蓝蛋白，R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白对视网膜细胞死亡的细胞保护作用

进行以下实验以研究别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)对A2E积累和视网膜A2E氧化的细胞保护效果。

在初步实验(图3a)中，研究了由0-40μg/ml的APC或R-PE和0-200μg/ml的C-PC引起的细胞毒性，不同浓度显示出对细胞毒性产生的不同影响。

具体地，将ARPE-19细胞以2胞以E⁴个细胞/孔的密度分布在24孔板中，用三种物质(最终浓度，APC：25μg/ml，R-PE：25μg/ml，C-PC：6.25,12.5,25和50μg/ml)，在第1天，第4天和第7天进行处理，共三次。为了在细胞中积累A2E，在第2天，第5天和第8天7天内用A2E以最终浓度为10终浓处理细胞3次，然后用蓝光(4.02J/cm²)照射，之后培养24小时。然后，通过MTT测定仪测量细胞存活率。根据MTT测定方法，向细胞中加入含有0.5μg/ml MTT的DMEM，闭光，在37℃培养箱中反应4小时。反应完成后，将细胞完全溶解于1ml的DMSO中。然后，用ELISA酶标仪测量OD540。通过对比具有A2E累积但未被蓝光照射的细胞组的细胞存活率，计算出细胞存活率并以％表示。

结果，如图3b所示，具有累积和未照射蓝光的A2E的组(A2E)和累积并照射蓝光的组(阴性对照：A2E BL)之间存在数据上的显著差异。通过阴性对照A2E BL的细胞存活率，用浓度为12.5,25和50μg/ml的C-PC处理的组的细胞存活率分别增加了26.9％，43.4％和44.8％。同时，在用APC和R-PE处理的组中，在25μg/ml的浓度下细胞保护效果不是那么显著，这个浓度是不引起细胞毒性的最高浓度(图3b)。

实验例4：极大螺旋藻提取物对累积有A2E的ARPE-19细胞(样品后处理系统)中视网膜细胞死亡的细胞保护效果

进行以下实验以研究来源于(缅甸，夏威夷和KIOST)的极大螺旋藻提取物对视网膜A2E氧化的细胞保护效果。

具体地，将ARPE-19细胞以2胞以E⁴个细胞/孔的密度分布在24孔板中，通过与实验例3中所述相同的方式将A2E在其中累积7天(最终浓度，10最终，三次)。然后，用具有不同来源的三种物质处理细胞，如下：用最终浓度为15.625，31.25，62.5，125和250μg/ml的缅甸原产极大螺旋藻提取物处理，用最终浓度分别为31.25，62.5，125和250μg/ml的夏威夷原产的极大螺旋藻提取物处理，用最终浓度为62.5,125，250和10μg/ml的KIOST原产的极大螺旋藻提取物处理，然后用蓝光(4.02J/cm²)照射。将细胞培养24小时。根据MTT测定方法，向细胞中加入含有0.5mg/ml MTT的DMEM，封闭光，然后在37℃培养箱中反应4小时。反应完成后，将细胞完全溶解于1ml的DMSO中，并用ELISA酶标仪测量OD540。对照具有A2E累积但未被蓝光照射的细胞存活率,计算出细胞成活率并用％表示。

结果，如图4所示，在具有累积但未被蓝光照射的A2E的组(A2E)与具有累积并用蓝光照射的A2E的组之间的细胞存活率(阴性对照：A2E BL)具有显著的数据上的差异。分别用不同产地的三种不同提取物处理每组细胞，浓度为15.625,31.25,62.5,125和250μg/ml的缅甸原产的极大螺旋藻提取物，浓度为31.25,62.5,125和250μg/ml的夏威夷原产极大螺旋藻提取物，浓度为62.5,125,250和500μg/ml的KIOST原产的极大螺旋藻提取物，把三种不同提取物精确处理细胞后的细胞成活率(100％)进行比较。结果，用夏威夷原产的极大螺旋藻提取物处理的组的细胞存活率分别增加了1.0％，2.0％，7.9％和10.6％。同时，用KIOST原产的极大螺旋藻提取物处理的组的细胞存活率分别增加了3.8％，8.9％，8.4％和12.4％。因此，证实夏威夷原产的极大螺旋藻提取物的细胞保护效果等于KIOST原产的极大螺旋藻提取物的细胞保护效应。另一方面，在用缅甸原产的极大螺旋藻提取物处理的组中，细胞保护效果在任何浓度下都不具有数据上的显著性(图4)。

实验例5：根据对A2E积累和光氧化(样品预处理系统)的抑制作用，KIOST原产的极大螺旋藻提取物对ARPE-19细胞中的视网膜细胞死亡的细胞具有保护作用

进行以下实验是研究KIOST原产的极大螺旋藻提取物对A2E积累和视网膜A2E氧化的细胞保护效果。

在初步实验(图5a)中，用1-1000的μg/ml的KI OST原产的极大螺旋藻提取物处理细胞后，选择对细胞毒性显示影响的浓度。具体地，ARPE-19细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度分布在24孔板中。在第1天，第4天和第7天，总计三次，用图5a中确定的最终浓度(62.5,125,250和500μg/ml)的提取物处理细胞。为了在其中沉积A2E，在第2天，第5天和第8天分别用10uM的A2E处理细胞7天，共三次。为了在细胞中积累A2E，在最后一次用A2E处理细胞，浓度为10μM，在第2天，第5天和第8天，7天三次，然后用蓝光(4.02J/cm²)照射，接着培养24小时。根据MTT测定方法，向细胞中加入含有0.5mg/ml MTT的DMEM，闭光，然后在37℃培养箱中反应4小时。反应完成后，将细胞完全溶解于1ml的DMSO中。然后，用ELISA酶标仪测量OD540。通过对比具有累积A2E但未被蓝光照射的细胞组的细胞存活率，计算出细胞存活率并以％表示。

结果，如图5b所示，具有累积但未被蓝光照射的A2E的组(A2E)和具有累积并用蓝光照射的A2E的组之间的细胞存活率存在数据上的显著差异(阴性对照：A2E BL)。用浓度为62.5,125,250和500μg/ml的KIOST原产的极大螺旋藻提取物处理后的细胞存活率分别比A2E BL(100％)的细胞存活率提高了0％，10.8％，7.0％和11.9％(图5b)。