鼠麹草提取物，及其制备方法与应用与流程

本发明涉及鼠麹草提取物，及其制备方法与应用。

背景技术：

尿酸是人类嘌呤化合物的最终代谢产物，嘌呤代谢紊乱会导致高尿酸血症。高尿酸血症(hua)是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/l，女性高于360μmol/l。高尿酸血症是由于体内尿酸生成增加或排出减少引起。高尿酸血症是痛风的发病基础，当尿酸浓度过饱和形成结晶，沉积在关节滑膜，软组织，软骨和肾脏等处就会引发″痛风″，从而触发机体固有免疫反应，导致关节及其周围组织炎症反应和肾功能损害。高尿酸血症患者，体内糖和脂肪的代谢功能会明显降低，容易引发各种严重的疾病，主要有糖尿病，高血压、高血脂、冠心病、心肌梗塞，动脉粥样硬化等，严重威胁人体健康。

随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，在我国高尿酸血症人群已呈现逐年上升趋势。临床降尿酸药物需求量将逐年增大。

黄嘌呤氧化酶是参与高尿酸血症、痛风等代谢综合症发生与发展的关键酶，主要通过催化嘌呤代谢的最后两步，即次黄嘌呤氧化为黄嘌呤再经氧化为尿酸，使体内尿酸水平升高。因此，黄嘌呤氧化酶成为开发抗高尿酸血症及痛风等疾病药物的重要靶标之一，现有的黄嘌呤氧化酶(xod)抑制剂有别嘌呤醇，非布索坦等。

鼠麴草，(gnaphaliumaffine，又称鼠曲草、佛耳草、白艾)，为菊科鼠麹草属植物，味微甘、性平，有祛风化痰泻浊之效。《名医别录》明确记载“主痹寒，寒热”；《药典》1977版记载“祛风湿，用于风湿痹痛”。清明节前后，我国多地各民族民间有采其嫩茎叶食用的习惯。根据文献linw，xiej，wux，yangl，wangh.inhibitionofxanthineoxidaseactivitybygnaphaliumaffineextract.chinesemedicalsciencesjournal，2014.29(4)：225-230.中公开了一种鼠麹草95％乙醇提取物，其抑制黄嘌呤氧化酶的ic50值为11.38μg/ml；该鼠麹草乙醇提取物中分离得到的木犀草素(luteolin2.63μmol/ml)、芹菜素(apigenin0.5μmol/ml)、槲皮素、山柰酚、异泽兰黄素(eupatilin0.37μmol/ml)、5-羟基6，7，3’，4’-四甲氧基黄酮(3.15μmol/ml)等黄酮类成分具有一定的黄嘌呤氧化酶抑制活性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中鼠麹草提取物的黄嘌呤氧化酶抑制活性不高，而提供了一种鼠麹草提取物，及其制备方法与应用。本发明制得的鼠麹草提取物具有较强的黄嘌呤氧化酶抑制活性；且鼠麹草野生资源丰富，药材成本低廉，开发潜力巨大。

本发明提供了一种鼠麹草提取物的制备方法，其包括以下步骤：将鼠麹草与乙醇水溶液混合，提取，浓缩得浓缩液；石油醚萃取所述的浓缩液得到水相；乙酸乙酯萃取所述的水相，收集乙酸乙酯相，即可；其中，所述的乙醇水溶液为体积百分含量为50％～80％的乙醇水溶液。

其中，所述的乙醇水溶液优选为体积百分含量为60％的乙醇水溶液。所述的提取的温度可以为50～100℃，更优选70～80℃。所述的乙醇水溶液的用量可以参照本领域常规进行选择，本发明中所述的鼠麹草与所述的乙醇水溶液的重量体积比优选1∶10～1∶20kg/l，更优选1∶10～1∶15kg/l。所述的提取的次数可以参照本领域的常规选择，本发明优选2～4次，更优选3次。所述的提取中单次提取的时间可参照本领域常规进行选择，本发明优选1～2h。

其中，所述的鼠麹草优选为阴干后的鼠麹草。本领域中，所述的阴干一般指即将药材放置于室内、室外或大棚的阴凉处、利用流动的空气，吹去水分而达到干燥的目的，本发明中所述的“阴干后的鼠麹草”一般指水分的质量含量约为4％的鼠麹草。所述的鼠麹草与所述的浓缩液的质量体积比可参照本领域的常规进行选择，本发明优选1∶0.5～1∶2kg/l，更优选1∶0.5～1∶1kg/l。所述的石油醚的用量可参照本领域的常规进行选择，本发明中所述的浓缩液与所述的石油醚的体积比优选1∶1～1∶2；所述的石油醚萃取的次数可以参照本领域常规进行选择，本发明优选2～4次，更优选3次。所述的乙酸乙酯的用量可参照本领域的常规进行选择，本发明中所述的水相与所述的乙酸乙酯的体积比优选1∶1～1∶2；所述的乙酸乙酯萃取的次数可以参照本领域常规进行选择，本发明优选2～4次，更优选3次。

本发明所述的鼠麹草提取物的制备方法，还可进一步包括浓缩，干燥所述的乙酸乙酯相的步骤；其中，所述的浓缩优选减压浓缩。

本发明还提供了一种由上述的制备方法制备得到的鼠麹草提取物。

本发明还提供了一种如式i所示化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将上述的鼠麹草提取物采用硅胶层析柱进行分离纯化，依次以二氯甲烷∶甲醇的体积比为100∶0、50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、2∶1、0∶100的洗脱液进行梯度洗脱，收集二氯甲烷∶甲醇为4∶1的洗脱液并浓缩；(2)将步骤(1)得到的产物采用c18键合硅胶柱进行分离纯化，依次以体积浓度为20％、40％、60％、80％以及100％甲醇水溶液洗脱，收集40％甲醇水溶液洗脱液并浓缩；(3)将步骤(2)所得产物经羟丙基葡聚糖凝胶柱进行分离纯化，洗脱液为甲醇，收集含式i化合物的洗脱液并浓缩；(4)将步骤(3)所得产物经制备型薄层层析板进行分离，以氯仿∶甲醇体积比为4∶1为展开剂，收集rf值为0.79的产物，得到化合物1；或将步骤(3)所得产物经制备型薄层层析板进行分离，以氯仿∶甲醇体积比为5∶1为展开剂，收集rf值为0.6的产物，得到化合物3；或将步骤(3)所得产物用制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为体积含量为30％～50％的甲醇水溶液，收集含化合物2的洗脱液，即可；

其中，当r¹为h、r²为r³为h、r⁴为r⁵为ch3时，为化合物1；

当r¹为r²为h、r³为r⁴为r⁵为h时，为化合物2；

当r¹为h、r²为h、r³为r⁴为r⁵为ch3时，为化合物3。

其中，步骤(1)中，所述的鼠麹草提取物优选为经过“所述的浓缩，干燥所述的乙酸乙酯相”后得到的鼠麹草提取物。所述的鼠麹草提取物与每个梯度洗脱液的用量的质量体积比可参照本领域常规进行选择，本发明优选5～15g/l，更优选9.6g/l。所述的硅胶层析柱中，硅胶的规格可以参照本领域的常规进行选择，本发明优选200～300目的硅胶。

其中，步骤(2)中，所述的c18键合硅胶柱的规格可参照本领域的常规进行选择，本发明中所述的c18键合硅胶柱的柱内径×柱长优选为4×36cm。步骤(2)中每个梯度洗脱液的用量可参照本领域常规进行选择，本发明中，步骤(1)中所述的鼠麹草提取物与步骤(2)中每个梯度洗脱液的用量的质量体积比优选50～150g/l，更优选96g/l。

其中，步骤(3)中，所述的羟丙基葡聚糖凝胶柱的规格可参照本领域的常规进行选择，本发明中所述的羟丙基葡聚糖凝胶柱的柱内径×柱长优选3×90cm。

其中，步骤(4)中，所述的制备型高效液相色谱的色谱柱优选为c18键合硅胶柱；所述的c18键合硅胶柱优选为kromasil生产的100-5-c18柱，柱内径×柱长为10×250mm。所述的制备型薄层层析板优选hsgf254薄层层析板。

本发明还提供了一种上述的鼠麹草提取物在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。

本发明还提供了一种上述的鼠麹草提取物在制备用于治疗和/或预防由尿酸水平高引起的相关病症药物中的应用，或在制备用于调节尿酸水平功能食品中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物，其含有上述的鼠麹草提取物和药学可接受的赋形剂。

本发明所述的“由尿酸水平高引起的相关病症”可为高尿酸血症和/或痛风。所述的调节尿酸水平功能食品一般指降低尿酸水平的功能食品。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述的鼠麹草提取物中活性提取物的活性成分较为集中，具有较强的黄嘌呤氧化酶抑制；且鼠麹草野生资源丰富，药材成本低廉，开发潜力巨大。

附图说明

图1为实施例1制得的鼠麹草提取物的hplc-uv指纹图谱(280nm)以及活性成分的指认。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

阴干后鼠麹草切段，称取5kg，与60％(v/v)乙醇水溶液75l(1∶15，kg/l)比例混合，加热回流提取4次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(60℃)至5l(鼠麹草∶浓缩液体积1∶1，kg/l)，得提取浓缩液。

提取浓缩液加入60～90℃石油醚萃取3次，每次浓缩液与石油醚体积比1∶1(v/v)，弃掉石油醚相，得水相。水相加入乙酸乙酯，萃取3次，每次水相与乙酸乙酯体积比1∶1(v/v)，萃取之后合并乙酸乙酯相，减压至干，得鼠麹草提取物102.3g。

将制得的鼠麹草提取物(96g)经200-300目硅胶柱层析(规格：7×60cm)分离，依次用二氯甲烷∶甲醇(体积比100∶0、50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、2∶1以及0∶100)洗脱，每个梯度使用溶剂10l，蒸干溶剂，分别收集每个梯度的洗脱溶剂，蒸干。后将梯度二氯甲烷∶甲醇为4∶1的洗脱部分经c18键合硅胶柱层析(规格：4×36cm)分离，分别经20％、40％、60％、80％以及100％甲醇水溶液洗脱，洗脱体积各为1l，分别收集每个梯度的洗脱溶剂，蒸干。将收集到的40％甲醇水溶液洗脱部分经羟丙基葡聚糖凝胶柱(sephadexlh20柱)(规格：3×90cm)分离，洗脱溶剂为甲醇，收集洗脱液后再经①制备型薄层层析板(烟台江友，20×20cm，hsgf254；展开剂氯仿∶甲醇4∶1，rf值0.79)精制得化合物1(8mg)；②制备型高效液相色谱(岛津lc20adxr双泵，检测器20a；色谱柱：kromasil，100-5-c18，10×250mm；色谱条件：50％甲醇水溶液(v/v)等度洗脱)纯化得到化合物2(20mg)；③制备型薄层层析板(烟台江友，20×20cm，hsgf254；展开剂氯仿∶甲醇5∶1，rf值0.6)精制得化合物3(21mg)。

图1为实施例1制备得到的鼠麹草提取物的hplc-uv指纹图谱(280nm)以及活性成分的指认图。从图1中可以看出，该实施例1制得的鼠麹草提取物中富含：木犀草素(峰3)、芹菜素(峰6)、槲皮素(峰1)、山柰酚(峰7)、3，5-二咖啡酰奎宁酸甲酯(化合物1，methyl3，5-di-o-caffeoylquinate，峰2)、1，4，5-三咖啡酰奎宁酸(化合物2，1，4，5-tri-o-caffeoylquinicacid，峰5)、4，5-二咖啡酰奎宁酸甲酯(化合物3，methyl4，5-di-o-caffeoylquinate，峰4)等活性成分。

hplc的测试条件如下：uflc-dad检测，泵：岛津lc-20adxr；自动进样器：sil-20axr；检测器：spd-m20a；柱温箱：cto-20a；色谱柱：安捷伦zorbaxrrhdeclipsexdb-c18，2.1×150mm，1.8μm；a相：h2o+0.2％(v/v)的甲酸；b相：乙腈；初始流动相浓度12％(v/v)b相；流速：0.3ml/min；柱温：40℃；初始压力：38.2mpa；pda：200-400nm；波长280nm检测；进样体积：2μl；洗脱程序：0-5min12％b，5-10min12-15％b，10-15min15％b，15-20min15-20％b，20-30min20-30％b，30-45min30-100％b，45-50min100％b，50-53min12％b。

山柰酚和槲皮素通过与其相应的对照品比较确认其结构。对照品：山柰酚(≥97％，hplc)，槲皮素(≥95％，hplc)均购于sigma-aldrich(美国)。

木犀草素、芹菜素、3，5-二咖啡酰奎宁酸甲酯、1，4，5-三咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸甲酯，从鼠麹草提取物中分离得到，并通过光谱数据与文献对比鉴定其结构。光谱数据总结如下：

芹菜素：黄色粉末：esi-ms，m/z：269.05[m-h]^-；539.06[2m-h]^-；575.03[2m+cl]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od+cdcl31∶1)，δh7.80(2h，d，j＝8.4，h-2′and6′)，6.93(2h，d，j＝8.4，h-3′and5′)，6.53(1h，s，h-3)，6.45(1h，brs，h-8)，6.25(1h，brs，h-6).

木犀草素：黄色粉末：esi-ms，m/z：309.05[m+na]⁺；285.06[m-h]^-；571.08[2m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，δh7.40(1h，dd，j＝2.0，8.9，h-6′)，7.39(1h，d，j＝2.0，h-2′)，6.92(1h，d，j＝8.9，h-5′)，6.55(1h，s，h-3)，6.45(1h，d，j＝1.8，h-8)，6.22(1h，d，j＝1.8，h-6).

3，5-二咖啡酰奎宁酸甲酯(化合物1，methyl3，5-di-o-caffeoylquinate)：黄色粉末：esi-ms，m/z：553.09[m+na]⁺；1083.17[2m+na]⁺；529.03[m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δh7.61，7.54(1heach，d，j＝16.0，h-7′，7″)，7.06，7.05(1heach，d，j＝1.8，h-2′，2″)，6.96，6.95(1heach，dd，j＝8.2，1.8，h-6′，6″)，6.79，6.77(1heach，d，j＝8.2，h-5′，5″)，6.34，6.21(1heach，d，j＝16.0，h-8′，8″)；quinicacidsegment：δh5.39(1h，m，h-3)，5.30(1h，m，h-5)，3.97(1h，dd，j＝3.2，6.6，h-4)，2.33(1h，dd，j＝13.2，3.8，h-2eq)，2.19-2.28(2h，m，h-6)，2.11-2.17(1h，m，h-2ax)，3.68(3h，s，-och3).¹³c-nmr(100mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δc168.8，167.9(c-9′，9″)，149.8，149.8(c-4′，4″)，147.5，147.2(c-7′，7″)，146.9，146.8(c-3′，3″)，127.9，127.6(c-1′，1″)，123.1，123.0(c-6′，6″)，116.6，116.5(c-5′，5″)，115.4，115.2(c-2′，2″)，114.8(c-8′，8″)；quinicacidsegment：δc175.6(c-7)，74.6(c-1)，72.2(c-5)，72.0(c-3)，69.7(c-4)，36.7(c-6)，35.6(c-2)，53.0(-och3).

1，4，5-三咖啡酰奎宁酸(即化合物2，1，4，5-tri-o-caffeoylquinicacid)：黄色粉末：esi-ms，m/z：701.02[m+na]⁺；676.95[m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，threecaffeoylgroups：δh7.62，7.62，7.53(1heach，d，j＝15.8，h-7′，7″，7″′)，7.10，7.03，7.02(1heach，d，j＝2.0，h-2′，2″，2″′)，6.98，6.91，6.91(1heach，dd，j＝8.3，2.0，h-6′，6″，6″′)，6.81，6.76，6.76(1heach，d，j＝8.3，h-5′，5″，5″′)，6.36，6.30，6.21(1heach，d，j＝15.8，h-8′，8″，8″′)；咖啡酸片段：δh5.71(1h，m，h-5)，5.16(1h，dd，j＝9.5，3.3，h-4)，4.44(1h，m，h-3)，2.63-2.71(2h，m，h-2eq，6eq)，2.44(1h，m，h-2ax)，2.18(1h，m，h-6ax).¹³c-nmr(125mhz，cd3od)，threecaffeoylgroups：δc168.6，168.4，168.3(c-9′，9″，9″′)，149.5，149.5，149.4(c-4′，4″，4″′)，147.7，147.7，147.6(c-7′，7″，7″′)，146.7(c-3′，3″，3″′)，128.0，127.7，127.6(c-1′，1″，1″′)，123.1，123.1，123.0(c-6′，6″，6″′)，116.5(c-5′，5″，5″′)，115.2(c-2′，2″，2″′)，115.2，114.8，114.7(c-8′，8″，8″′)；quinicacidsegment：δc173.2(c-7)，82.4(c-1)，75.9(c-4)，68.8(c-5)，68.3(c-3)，36.3(c-2)，38.3(c-6).

4，5-二咖啡酰奎宁酸甲酯(即化合物3，methyl4，5-di-o-caffeoylquinate)：黄色粉末：esi-ms，m/z：553.09[m+na]⁺；1083.17[2m+na]⁺；529.03[m-h]^-；¹h-nmr(400mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δh7.50，7.60(1heach，d，j＝16.0，h-7′，7″)，7.03，7.01(1heach，d，j＝1.8，h-2′，2″)，6.92，6.90(1heach，dd，j＝8.2，1.8，h-6′，6″)，6.76(2h，d，j＝8.2，h-5′，5″)，6.29，6.16(1heach，d，j＝16.0，h-8′，8″)；quinicacidsegment：δh5.55(1h，ddd，j＝5.4，6.9，8.0，h-5)，4.36(1h，ddd，j＝3.1，3.1，6.1，h-3)，5.11(1h，dd，j＝3.1，8.4，h-4)，2.31(1h，dd，j＝13.9，3.2，h-2a)，2.10(1h，dd，j＝13.9，5.9，h-2b)，2.24(2h，d，j＝6.9，h-6)，3.73(3h，s，-och3).¹³c-nmr(100mhz，cd3od)，twocaffeoylgroups：δc168.5，168.0(c-9′，9″)，149.6，149.5(c-4′，4″)，147.7，147.6(c-7′，7″)，146.6(c-3′，3″)，127.7，127.5(c-1′，1″)，123.1(c-6′，6″)，116.5(c-5′，5″)，115.2(c-2′，2″)，114.7，114.5(c-8′，8″)；quinicacidsegment：δc175.3(c-7)，75.9(c-1)，75.0(c-4)，68.9(c-3)，68.7(c-5)，38.7(c-6)，38.3(c-2)，53.2(-och3).

实施例2

阴干后鼠麹草切段，称取0.6kg，与50％(v/v)乙醇水溶液6l(1∶10，kg/l)比例混合，加热回流提取3次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(60℃)至1.2l(鼠麹草∶浓缩液体积1∶2，kg/l)，得提取浓缩液。

提取浓缩液加入60～90℃石油醚萃取2次，每次浓缩液与石油醚体积比1∶2(v/v)，弃掉石油醚相，得水相。水相加入乙酸乙酯，萃取2次，每次水相与乙酸乙酯体积比1∶2(v/v)，萃取之后合并乙酸乙酯相，减压至干，得鼠麹草提取物11.7g。

实施例3

阴干后鼠麹草切段，称取2kg，与80％(v/v)乙醇水溶液40l(1∶20，kg/l)比例混合，加热回流提取2次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(60℃)至1l(鼠麹草∶浓缩液体积1∶0.5，kg/l)，得提取浓缩液。

提取浓缩液加入60～90℃石油醚萃取4次，每次浓缩液与石油醚体积比1∶1(v/v)，弃掉石油醚相，得水相。水相加入乙酸乙酯，萃取4次，每次水相与乙酸乙酯体积比1∶1(v/v)，萃取之后合并乙酸乙酯相，减压至干，得鼠麹草提取物42.3g。

对比实施例1：按照现有文献linw，xiej，wux，yangl，wangh.inhibitionofxanthineoxidaseactivitybygnaphaliumaffineextract.chinesemedicalsciencesjournal，2014.29(4)，225-230中的第226页“plantmaterial部分第8行”的制备方法制备得到鼠麹草提取物(体积百分比为95％的乙醇水溶液进行提取)。

对比实施例2：阴干后鼠麹草切段，称取0.5kg，与95％(v/v)乙醇4l(1∶8，kg/l)混合，加热回流提取3次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(60℃)至干，得鼠麹草提取物64.8g。

对比实施例3：阴干后鼠麹草切段，称取0.5kg，与60％(v/v)乙醇7.5l(1∶15，kg/l)混合，加热回流提取4次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(60℃)至干，得鼠麹草提取物78.7g。

效果实施例1黄嘌呤氧化酶体外抑制活性实验

药品与试剂：别嘌醇购自百灵威j&k；黄嘌呤购自百灵威j&k；黄嘌呤氧化酶购自sigmaaldrich，美国。

仪器：酶标仪-thermoscientificvarioskanflash，美国。

待测化合物用二甲亚砜(dmso)溶解，4℃保存，实验前取出解冻，并用70mm磷酸盐缓冲液稀释，使最终反应体系终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.5μg/ml或μm。

96孔板孔内加入30μl酶溶液(0.01u/ml，溶剂：70mm磷酸盐缓冲液)，加入35μl70mm磷酸盐缓冲液(ph＝7.5)，加入50μl受试样品溶液(溶剂：70mm磷酸盐缓冲液，其中dmso占反应体系总体积不高于0.25％，v/v)，25℃孵育15min，使受试样品与酶充分接触。反应开始：孔内加入60μl黄嘌呤溶液(浓度：300μm，溶剂：70mm磷酸盐缓冲液)，25℃孵育30min，使反应充分。反应终止：加入25μl1n盐酸溶液。295nm下检测od值。每个反应重复3次，取均值。

酶抑制率％＝(1-b/a)×100，其中b为既含有受试样品又含酶和底物反应体系的od值，a为不含受试样品只含酶和底物反应体系的od值。

实验结果表明，实施例1-3制得的鼠麹草提取物均有很强的黄嘌呤氧化酶抑制活性，与对比实施例1～3相比，实施例1～3制得的鼠麹草提取物的黄嘌呤氧化酶抑制活性更强。结果如表1所示：

表1.受试样品黄嘌呤氧化酶抑制活性

与对比实施例1比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01；与对比实施例2比较^#p＜0.05，^##p＜0.01，^###p＜0.001；与对比实施例3比较^&&p＜0.01。