本发明涉及兽药领域，具体涉及的是一种口蹄疫疫苗稀释液及其制备方法与应用。
背景技术：
口蹄疫(Aftosa)，俗名“口疮”、“辟癀”，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物，其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。
随着我国畜牧业规模化养殖的快速发展，口蹄疫疫病的防疫成为畜牧业发展的关键。目前，口蹄疫疫病的防控主要措施之一为接种疫苗。因此，高质量疫苗的供应和精准的接种液量是保证口蹄疫疫病能够得到有效防控的关键因素，也是我国畜牧业能够得以健康发展的保障。
目前，口蹄疫疫苗的生产工艺为：悬浮细胞培养病毒→灭活→纯化、浓缩→乳化→分装。其中，国内口蹄疫疫苗生产的乳化工艺中，普遍采用的乳化方法是将佐剂无菌过滤到佐剂专用缸或在佐剂专用缸内经高压灭菌，制备成油相；然后将抗原液按工艺要求制备成水相，最后将含有抗原的水相和油相乳化成乳状液(剂型一般为W/O/W)，即疫苗。
现有常规方法乳化的疫苗中抗原加量固定，采用常规稀释液(如生理盐水、葡萄糖等)会造成疫苗分层而无法对此类W/O/W剂型疫苗进行稀释。公开号为CN1413732A的专利申请中公开了一种由氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖、磷酸盐等组成的稀释剂，该稀释剂是用来稀释抗原，而非疫苗，用此稀释剂稀释疫苗也会造成疫苗分层而无法使用。因此，由于没有合适的稀释剂，在疫苗接种时只能按照既定注射液量注射，对高浓度疫苗来说，接种微小液量时由于误差较大，无法保证其准确性，也无法采用常规稀释的方法进行稀释，对疫苗的精准接种和疫苗的配制不利。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种口蹄疫疫苗稀释液，其原料包括磷酸盐缓冲液和油相；优选的，其是由磷酸盐缓冲液和油相乳化而成的水包油包水(W/O/W)状的乳化液。
所述磷酸盐缓冲液包含以下成分：
所述油相为206佐剂。
其制备包括：将除菌后的磷酸盐缓冲液(30±1℃)缓慢加入除菌后的油相(30±1℃)中，所述磷酸盐缓冲液与油相的体积比为(30-50)：(50-70)(优选46:54)，在乳化搅拌频率为35-40Hz下进行乳化，30min后，将乳化搅拌频率调整为3-5Hz，迅速降温至15℃以下，即得到口蹄疫疫苗稀释液。
本发明的第二个方面在于提供制备上述口蹄疫疫苗稀释液的方法，配制磷酸盐缓冲液，除菌后作为稀释液水相；将油相除菌，作为稀释液油相；将稀释液水相与稀释液油相乳化，得到水包油包水(W/O/W)状的口蹄疫疫苗稀释液。
包括以下步骤：
1)将以下成分溶解于水后，配制得到pH＝8.0的磷酸盐缓冲液,
2)将步骤1)得到的磷酸盐缓冲液经0.2μm滤器除菌，作为稀释液水相，然后保持温度在30±1℃；
3)将油相经0.2μm滤器除菌，作为稀释液油相，然后保持温度在30±1℃；
4)将步骤2)的稀释液水相缓慢加入到步骤3)的稀释液油相中，在35-40Hz的乳化搅拌频率下进行乳化，30min后，将乳化搅拌频率调整为3-5Hz，迅速降温至15℃以下，即得到口蹄疫疫苗稀释液；稀释液水相和稀释液油相的体积比为(30-50)/(50-70)，优选46:54。
本发明的第三个方面在于提供一种稀释的口蹄疫疫苗，包含口蹄疫疫苗原液和上述口蹄疫疫苗稀释液或上述方法制备得到的口蹄疫疫苗稀释液。
所述口蹄疫疫苗原液的制备为：将灭活口蹄疫抗原依次经过物理纯化、超滤(UF)、化学纯化制得，浓缩倍数在500-1000倍之间，得到高纯度、高浓度的抗原，作为疫苗水相；将206佐剂作为疫苗油相；保持疫苗水相和疫苗油相的温度为30±1℃，将疫苗水相缓慢加入疫苗油相中，35-40Hz的乳化搅拌频率下进行乳化，乳化30min后，将乳化搅拌频率调至3-5Hz，迅速降温至15℃以下，即得的口蹄疫疫苗原液。
本发明的第四个方面在于提供制备上述稀释的口蹄疫疫苗的方法，将口蹄疫疫苗原液和上述口蹄疫疫苗稀释液或上述方法制备得到的口蹄疫疫苗稀释液混合均匀即可。
本发明的第五个方面在于提供上述口蹄疫疫苗稀释液在稀释口蹄疫疫苗原液中的应用。
本发明提供的口蹄疫疫苗稀释液，用来稀释口蹄疫疫苗，不仅可以实现精确接种；还可以克服现有检验过程中无法准确得到实际效力数据的不足。这是因为2010版《中华人民共和国兽药典》规定口蹄疫抗原检测的方法为将备检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份三个剂量组，每一剂量组分别接种于试验动物进行效力检验(PD50)，实际能够检测出的效力上限为15.59个PD50，然而有的疫苗的效力可能远远大于15.59，却因超出量程上限而不能被检测出来。用本发明的稀释液可以将疫苗稀释成不同倍数后再进行效力检验，得到的效力再乘稀释倍数就能够准确得到疫苗的实际效力数据。
随着疫苗浓缩技术的发展，配合本发明的口蹄疫疫苗稀释液，可使高浓缩疫苗的应用更广泛，这样每一包装量的免疫头份数量增加，疫苗的存储量就减少，可降低储存成本。例如：现有每瓶100ml的疫苗只含有100头份的抗原量，只能接种100头动物；而100ml浓缩疫苗可含有500头份的抗原量，使用时与本发明的口蹄疫疫苗稀释液使用，可接种500头动物，即同样包装量的疫苗，接种头份数量将增大，有利于农场、免疫站等的大规模接种。此外，有了本发明的口蹄疫疫苗稀释液，疫苗可被浓缩，在后续的乳化工艺中可减小乳化罐的体积，这样乳化时的搅拌和温度更加均一，从而可以提高乳化效果，同时节约了乳化成本。
具体实施方式
目前口蹄疫疫苗中的抗原浓度可以提高1000倍以上，虽然抗原纯化浓缩水平在不断提高，但是由于没有适合于口蹄疫疫苗的稀释液，口蹄疫疫苗的浓度只能是可直接用于接种的浓度。如果直接使用高浓度抗原制备的疫苗，操作过程中容器内的残留或取液器械上的沾染都会使实际注射量与理论值偏差较大，无法保证接种量的准确性。如果研发出一种适用于口蹄疫疫苗的稀释液，在使用前用稀释液将高浓度抗原的疫苗稀释，再进行接种，一方面能够保证接种量的精确，提高检验的精度；另一方面高浓度抗原的疫苗储存量将大大减少，缓解疫苗的储存、运输压力。因此，一种口蹄疫疫苗稀释液的研发是非常有必要及非常具有前瞻性的。
本发明提出了一种用来稀释口蹄疫疫苗的稀释液，及稀释液的制备方法；进一步地，用稀释液稀释口蹄疫疫苗，得到稀释的口蹄疫疫苗。
首先，口蹄疫疫苗稀释液为乳化的磷酸盐缓冲液(PBS)(剂型为W/O/W)，其制备包括以下步骤：
1)按照如下配方将各物质溶解于水后，配制得到磷酸盐缓冲液,配方如下：
所用试剂均为分析纯，可商购得到。
2)用0.2μm滤器将磷酸盐缓冲液除菌后加入到水相罐中，作为稀释液水相，并将稀释液水相的温度保持在30±1℃；
3)将206佐剂(206佐剂购自于赛彼科(上海)特殊化学用品有限公司)用0.2μm滤器除菌后加入到乳化罐中，作为稀释液油相，同样将稀释液油相的温度保持在30±1℃；
4)将水相罐中的稀释液水相缓慢加入到乳化罐中的稀释液油相中，稀释液水相：稀释液油相(体积比)为(30-50)/(50-70)，优选46:54，乳化搅拌频率设置为35-40Hz进行乳化，乳化30min后，将搅拌频率调整为3-5Hz，用乙二醇迅速降温(降温的速度越快越好)至15℃以下，即得到口蹄疫疫苗稀释液，进行分装。
口蹄疫疫苗购自金宇保灵生物药品有限公司，具体的制备方法包括以下步骤：通过将灭活抗原依次经过物理纯化、超滤(UF)、化学纯化的纯化浓缩工艺制得，浓缩倍数在500-1000倍之间，得到浓缩后的抗原，作为疫苗水相，206佐剂作为疫苗油相；将疫苗水相和疫苗油相的温度分别调节至30±1℃，将疫苗水相缓慢加入疫苗油相中，搅拌频率设置为35-40Hz进行乳化，乳化30min后，将搅拌频率调整为3-5Hz，缓慢降温至15℃以下，最后分装，即得高纯度、高浓度的口蹄疫疫苗。
制备稀释的口蹄疫疫苗时，按照疫苗的有效保护液量以及拟接种动物数量来计算所需的高纯度、高浓度疫苗的数量，然后依据接种液量计算疫苗的稀释倍数，按照比例将口蹄疫疫苗稀释液和口蹄疫疫苗混合均匀，即得到稀释的口蹄疫疫苗，可直接进行接种。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。实施例中用到的口蹄疫疫苗(O/MYA98/BY/2010株+asial/JSL/ZK/06株+Re-A/WH/10株)，批号：S163501，购自金宇保灵生物药品有限公司。乳化罐和水相罐购自长春富士特流体设备有限公司。
一、口蹄疫疫苗稀释液的制备
按照上述方法制备得到一系列本发明的口蹄疫疫苗稀释液，其制备过程中的各参数见表1。
表1制备1L实施例1-9口蹄疫疫苗稀释液的参数
二、高纯度、高浓度口蹄疫疫苗
由金宇保灵生物药品有限公司，批号为S163501、S163502、S163503，抗原为O/MYA98/BY/2010株+asial/JSL/ZK/06株+Re-A/WH/10株。
三、高浓度口蹄疫疫苗的稀释
无菌条件下取稀释液与口蹄疫疫苗混合均匀，对高纯度、高浓度口蹄疫疫苗进行相应倍数的稀释。
实验例、口蹄疫疫苗稀释液中磷酸盐缓冲液的筛选
用实施例1-9得到的口蹄疫疫苗稀释液将口蹄疫疫苗稀释5倍后，检测稀释后的口蹄疫疫苗的物理性状(如剂型、外观、黏度、颗粒度)，并采用传统破乳工艺破乳，检测水相样146S。比较例1-3为按本发明制备口蹄疫稀释液的方法得到的稀释液，仅是稀释液水相或稀释液油相的成分与本发明所列实施例不同；比较例1稀释液水相为磷酸盐缓冲液，其配方为：10g/L磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.3g/L磷酸二氢钾(KH2PO4)、8.1g/L氯化钠(NaCl)，稀释液水相和稀释液油相的体积比为46:54；比较例2稀释液水相也为磷酸盐缓冲液，其配方与CN1413732A中公开的相同，为：8.0g/L氯化钠(NaCl)、0.125g/L磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.4g/L氯化钾(KCl)、0.06g/L磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.2g/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)、1.0g/L葡萄糖、0.14g/L氯化钙(CaCl2)，稀释液水相和稀释液油相的体积比为46:54；比较例3稀释液油相的配方为：0.9L/L白油、0.04L/L吐温(TWEEN)和0.06L/L司班(SPAN)组成的混合物(即按体积百分含量，含有90％的白油、4％的吐温和6％的司班)，稀释液水相的配方与实施例5相同，稀释液水相和稀释液油相的体积比为46:54。以实施例5为例，检测结果见表2。
表2稀释5倍后的口蹄疫疫苗的物理性状及146S含量
通过表2的实验结果可以看出，用比较例1和比较例2的稀释液稀释得到的疫苗146S回收率低，146S是口蹄疫疫苗中的有效抗原成分，146S回收率低表示稀释液对疫苗中有效成分的保护性不好，降解或失活多，可见比较例1和2的稀释液不适合用于疫苗的稀释。用比较例3的稀释液稀释得到的疫苗一方面黏度较高不利于动物接种，另一方面疫苗颗粒度不呈正态分布，剂型稳定性差，因此比较例3也不适用于疫苗稀释。而用本发明的稀释液稀释得到的疫苗不仅粘度合适、颗粒度呈正态分布、剂型稳定性好，而且对疫苗中的有效抗原成分146S回收率高，说明本发明的稀释液对疫苗中的有效成分保护性好，降解或失活的抗原少，适用于疫苗的稀释。
通过比较三种疫苗稀释液稀释后的疫苗的质量，结合成本费用综合分析，本发明的口蹄疫疫苗稀释液用来稀释口蹄疫疫苗更适合。
其它实施例也有相似实验结果，不再一一赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。