一种多肽水凝胶、其制备方法及应用与流程

本发明属于材料制备领域，涉及一种多肽水凝胶、其制备方法及其在干细胞三维培养的仿生支架材料、促进缺损组织的修复的仿生支架材料、控制生长因子释放的载体中的应用。

背景技术：

水凝胶是一类具有亲水基团，能被水溶胀但不溶于水的具有三维网络结构的聚合物。它在水中能够吸收大量的水分显著溶胀，并在显著溶胀之后能够继续保持其原有结构而不被溶解。它能够感知外界刺激的微小变化，如温度、pH值、离子强度、电场、磁场等，并能够对刺激发生敏感性的响应，常通过体积的溶胀或收缩来实现。水凝胶的这一特点使它在生物医学领域、生物酶的固定、3D细胞培养等方面有广泛的应用前景。

制备水凝胶材料主要有两大类，一类是合成高分子，一类是天然生物材料如多糖和蛋白等。后者具有较好的生物相容性，从而在生物医药等领域的应用具有优势。目前引起研究者广泛关注的一类生物高分子凝胶是多肽，这种材料生物相容性好，是一种很有前景的生物材料和环境友好材料。

氨基酸的主要折叠方式有四种α螺旋，β链，β-折叠片层和无规卷曲。对于大多数多肽，其折叠方式主要是以上四次结构的一种或几种。目前，用于水凝胶材料制备的主要多肽的折叠方式为β-折叠片层，但是，研究发现β-折叠片层是β-淀粉样蛋白的主要折叠方式。这种蛋白具有很强的神经毒性作用，而且在阿尔茨海默病的病程进展中发挥着主要作用，因此影响了其应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种多肽水凝胶的制备方法，本发明的多肽水凝胶的制备方法操作简单、方便，水凝胶成分单纯可控，其中使用的多肽的主要折叠方式为α螺旋，而从根本上规避了可能存在的安全问题。

本发明采用的技术方案为：一种多肽水凝胶的制备方法，包括：将多肽溶解在分散介质中，形成多肽溶液，数分钟后即可形成所述多肽水凝胶；

其中，所述多肽由n个重复的xKEALKEy氨基酸序列构成，其中，n为2～10的整数，x为疏水氨基酸，y为亲水氨基酸，K为赖氨酸，E为谷氨酸，A为丙氨酸，L为亮氨酸。

在上述技术方案中，能够将所述多肽溶解形成多肽溶液的溶剂均可作为分散介质，如水、缓冲溶液等。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述多肽水凝胶在温度为20～40℃，PH为4～8的条件下形成。作为对上述技术方案的更进一步改进，所述多肽水凝胶在温度为37℃，PH为7的条件下形成。本发明的多肽水凝胶可在较宽的温度和PH范围内形成，适用范围广。

当多肽溶液的PH不在上述范围内中时，可按照下述步骤进行多肽水凝胶的制备：

i如果多肽溶液的初始pH小于4，可以通过添加碱性溶液(NaOH、KOH等)，将溶液的pH调节到4-8的范围内，形成稳定的胶体。(如果添加药物或一些蛋白因子等需要配合一下步骤：将药物或者因子，添加进碱性溶液或者多肽溶液，通过高速搅拌或者超声处理的方式，将药物或者因子添加进入多肽中。

ii如果多肽溶液的初始pH大于8，可以通过添加酸性溶液(HCl、H₂SO₄或者酸性药物等)，将溶液的pH调节到4-8的范围内，形成稳定的胶体。(如果添加药物或一些蛋白因子等需要配合一下步骤：将药物或者因子，添加进酸性溶液或者多肽溶液，通过高速搅拌或者超声处理的方式，将药物或者因子添加进入多肽中。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述多肽在水中的浓度为0.5mg/mL～20mg/mL。当多肽的浓度过高时，胶体的硬度过大，接近人的肌肉组织，影响其使用；而当多肽的浓度过低时，形成的胶体硬度则过低，影响其使用。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述分散介质为水。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述水中添加有培养基、细胞和生长因子中的至少一种。在水中添加培养基后，制得的多肽水凝胶可用于干细胞的3D培养；在水中添加细胞后，制得的多肽水凝胶可用于损伤组织的修复；在水中添加生长因子后，制得的多肽水凝胶可用于美容烧伤烫伤的修复；

作为对上述技术方案的进一步改进，所述n为3，所述多肽由xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy构成，其中，x为疏水氨基酸，y为亲水氨基酸，K为赖氨酸，E为谷氨酸，A为丙氨酸，L为亮氨酸。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述x为疏水性氨基酸D、E、H、K、Q、R、S或T，其中，D为天冬氨酸，E为谷氨酸，H为组氨酸，K为赖氨酸，Q为谷氨酰胺，R为精氨酸，S为丝氨酸，T为苏氨酸；

所述y为亲水氨基酸A、F、I、L、M、P、V、W或Y，其中，A为丙氨酸，F为苯丙氨酸，I为异亮氨酸，L为亮氨酸，M为蛋氨酸，P为脯氨酸，V为缬氨酸，W为色氨酸，Y为酪氨酸。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述x为疏水性氨基酸E、H或Q；所述y为亲水氨基酸L、V或Y，此时对应的多肽使用安全性更高。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述多肽的分子量低于4000。分子量低于4000的多肽分子不具有免疫原性。凡是具有免疫原性的物质其分子量一般在10,000以上，小于10,000者呈弱免疫原性，低于4,000者一般不具有免疫原性。

本发明还提供了所述的多肽水凝胶的制备方法制得的多肽水凝胶。

本发明还提供了所述的多肽水凝胶在干细胞三维培养的仿生支架材料、促进缺损组织的修复的仿生支架材料、控制生长因子释放的载体中的应用。

本发明的多肽可以水为分散介质，通过自组装形成多肽水凝胶。多肽水凝胶成分单纯可控，安全性高，在完全自组装前具有可注射性，生物相容性好、可降解、降解产物为人体可吸收的氨基酸，机械强度易于调控，且骨架十分接近细胞外基质中支持细胞生长的蛋白质三维网络，可广泛用于药物缓释载体、细胞培养支架等诸多生物和医学领域。

液态多肽材料水凝胶通过注射引入受损组织空腔，在注射部位经充分自组装后形成多孔支架水凝胶，并可在其上装上生长因子和其它信号分子，通过传统的控释系统和表面工程与自组装的结合可以形成仿生支架。支架材料可以借助细胞表面的特异性受体向细胞发出信号，通过细胞骨架或各种信号转导途径将信号传导至细胞质乃至细胞核，对细胞存活、形态、功能、代谢、增殖、分化、迁移等基本生命活动具有较大影响。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的多肽水凝胶的制备方法操作简单、方便，水凝胶成分单纯可控，其中使用的多肽的主要折叠方式为α螺旋，且α-螺旋百分比高达85％以上，而从根本上规避了可能存在的安全问题。

本发明的多肽水凝胶在pH 5.8-7.6的范围可以保持凝胶状态，在此pH范围外为液体。

本发明的多肽水凝胶中不需要添加任何有毒性的化学试剂，胶体仅含有水，多肽(有时会含有极低含量的钠离子)。本发明的多肽水凝胶具有很好的组织相容性，能快速诱导周围组织的生长。没有免疫原性，有生物降解性，产物为氨基酸，可被重新吸收利用，安全性高。

本发明在生物材料、生物化学、细胞分子生物学、纳米材料学等领域的最新研究成果指引下，合成具有生物活性的多肽，在一定条件下与水分子原位自组装成具有生物活性的水凝胶支架，并且由于该体系可注射，能填满任何形状的组织间隙，形成促缺损组织再生的仿生活性支架，并可作为载体控制细胞生长因子的释放，促进组织形成，修复缺损组织。

通过分子自组装形成的多肽水凝胶更能模拟精细的生物和天然大分子体系，由于可注射纳米多肽自组装水凝胶既可以从分子水平来调控各种反应及结果，又避免了其他如化学或物理交联的水凝胶对机体存在的潜在危害，是真正意义的仿生材料。其自组装条件简单，有生物活性，可以修复各种不规则形状的组织缺损。此外，与其他类型的多肽水凝胶相比(主要折叠方式为β折叠片)，研究表明，β折叠片具有较强的神经细胞毒性，因此这类材料存在很大的安全风险。本发明的材料的多肽分子的主要折叠方式为α螺旋，因此不存在此类风险。

附图说明

图1为实施例1中将干细胞种在水凝胶里面，在放大4和10倍率下获得的显微镜照片；

图2显示了实施例1中共聚焦显微镜下干细胞的生长情况，其中A为俯视图，B、C为侧视图；

图3显示了实施例3中1mg/mLEGF和10mg/mLEGF在多肽水凝胶中的释放情况；

图4显示了实施例3中第21天时，多肽水凝胶及生理盐水中的EGF含量；

图5证实了本发明的多肽为α-螺旋结构；

图6显示了本发明的多肽纤维大小在2-3纳米。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

首先合成具有生物活性的高纯度的多肽(粉末状，其氨基酸序列为xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy，K为赖氨酸，E为谷氨酸，A为丙氨酸，L为亮氨酸,x为谷氨酸，y为亮氨酸)。

所述多肽可通过以下两种方法中任意一种合成：

i通过化学方法合成，即使用多肽合成仪，合成特定序列的多肽，经过纯化后即可以使用；

ii通过生物生产，即将相关基因导入大肠杆菌或者CHO细胞，来生产具有特定序列的多肽，分离高产细胞株，进行扩大培养，纯化后获得多肽。

将合成的多肽用去离子水配成3mg/mL浓度的溶液，然后再滴加少量alpha-MEM培养基溶液，在37℃、PH为7的条件下，静置数分钟后，多肽水凝胶逐渐形成。这样就获得了仿生的有生物活性的自组装多肽水凝胶材料，也是干细胞三维培养的优良仿生支架材料。将干细胞种在制得的多肽水凝胶里面，在放大4和10倍率下获得的显微镜照片如图1所示，其中第一张为放大4倍的照片，其余三张为放大10倍的照片；图1显示出利用本发明的多肽制得的多肽水凝胶可作为干细胞三维培养的优良仿生支架材料。

图2显示了共聚焦显微镜下干细胞的生长情况，其中A为俯视图，B、C为侧视图，图2中大面积的稍亮区域显示的是活细胞，也即箭头1指示的地方，箭头2指示的是死细胞，其中活细胞占干细胞总数的95％；图2显示干细胞大小大于其正常大小10微米，说明干细胞在分裂和生长，干细胞可以在多肽水凝胶中生长，因而可作为支架材料促进组织缺损的修复。

实施例2

首先合成具有生物活性的高纯度的多肽(粉末状，其氨基酸序列分别为xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy，K为赖氨酸，E为谷氨酸，A为丙氨酸，L为亮氨酸,x为组氨酸，y为缬氨酸)。其中，多肽的合成方法同实施例1。

将多肽用去离子水配成0.5mg/mL浓度的溶液，用无菌的注射器将混合溶液注入不规则形状的组织缺损区，在组织液(如血液)的诱导下原位自组装形成水凝胶，作为支架材料促进组织缺损的修复。

实施例3

首先合成具有生物活性的高纯度的多肽(粉末状，其氨基酸序列分别为xKEALKEyxKEALKEyxKEALKEy，K为赖氨酸，E为谷氨酸，A为丙氨酸，L为亮氨酸,x为谷氨酰胺，y为酪氨酸)。其中，多肽的合成方法同实施例1。

将多肽材料用去离子水配成10mg/mL浓度的溶液，然后再滴加一定量的FITC荧光标记的EGF，使其最终浓度为1～10mg/mL，在37℃、PH为7的条件下，静置数分钟后，多肽水凝胶逐渐形成。图3显示了1mg/mLEGF和10mg/mLEGF在多肽水凝胶中的释放情况(其中，位于上方的曲线显示的是10mg/mLEGF在多肽水凝胶中的释放情况，位于下方的曲线显示的是1mg/mLEGF在多肽水凝胶中的释放情况)；图4显示了第21天时，多肽水凝胶及生理盐水中的EGF含量，其中图A显示了多肽水凝胶中的EGF含量，其为74％，图B显示了生理盐水中的EGF含量，其为23％；表1显示了分别从第0、7、14、21天的多肽水凝胶中取出的EGF在不同浓度时的荧光强度，从表中可以看出从第21天的多肽水凝胶中取出的EGF与之前三次取出的EGF的荧光强度基本相同，无显著差异，说明EGF因子结构上没有变化。图3、图4和表1说明多肽水凝胶具有EGF缓释功能其不会引起EGF结构上的变化。

表1

实施例4

对实施例1～3中的多肽的α-螺旋结构进行测试，试验步骤具体如下：

1)配置0.1mg/ml的多肽溶液；

2)将15μl样品加入0.1cm石英比色皿；

3)将石英比色皿置于圆二色光谱(简称CD)仪中，设置谱带宽度为1nm，扫

描范围190-260nm，扫描次数为5，温度25℃；

4)扫描后，将数据转出并作图。

其中，实施例1中的多肽检测结果如图5所示，实线代表一个α-螺旋蛋白，虚线代表本发明的多肽，在波长为200-240nm范围内，二者基本重合，说明二者结构接近，也即本发明的多肽为α-螺旋结构。经测试，实施例1～3中的多肽α-螺旋百分比均在85％以上。图6显示本发明的多肽纤维大小在2-3纳米。

如图5所示，实线代表一个α-螺旋蛋白，虚线代表本发明的多肽，在波长为200-240nm范围内，二者基本重合，说明二者结构接近，也即本发明的多肽为α-螺旋结构，经测试，α-螺旋百分比大于85％。图6显示本发明的多肽纤维大小在2-3纳米。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。