本发明是抗体偶联药物领域。具体来说，本发明涉及CD19抗体多肽偶联抗肿瘤药物环磷酰胺的结合物。
背景技术：
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是具有很强异质性的一组独立疾病的总称。在我国也是比较常见的一种肿瘤，在常见恶性肿瘤排位中在前10位以内。NHL病变是主要发生在淋巴结、脾脏、胸腺等淋巴器官，也可发生在淋巴结外的淋巴组织和器官的淋巴造血系统的恶性肿瘤。依据细胞来源将其分为三种基本类型：B细胞、T细胞和NK/T细胞NHL。临床大多数NHL为B细胞型，占总数70％～85％。NHL在病理学分型、临床表现与治疗个体化分层上都比较复杂，但是一种有可能高度治愈的肿瘤。目前发病率在不同年龄阶段呈明显上升的趋势。
近年多个国际多中心随机对照临床试验研究资料证明，其标准的一线治疗方案应当是CHOP方案(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，强的松)为目前治疗非霍奇金淋巴瘤较为理想的一线治疗方案。50％以上非霍奇金被治愈。尽管如此，这一治疗方案会导致较严重的毒副作用。常见副作用：1.骨髓抑制；2.静脉炎；3.消化道反应；4.脱发等。其中，环磷酰胺双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰DNA及RNA功能，尤以对前者的影响更大，它与DNA发生交叉联结，抑制DNA合成，对S期作用最明显。临床用于恶性淋巴瘤有一定疗效，但环磷酰胺也具有较大的毒副作用。产生毒副作用的主要原因在于，环磷酰胺为广谱抗肿瘤要求，特异性较差，对正常细胞也具有一定的杀伤作用。因此，发明人希望能够将环磷酰胺与特异性的抗体偶联，从而产生肿瘤细胞的靶向作用，提高疗效，减少毒副作用。
CD19是一种B细胞特异性转膜糖蛋白，表达于B系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上，CD19是一种重要的信号传导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体或其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原。B细胞淋巴瘤细胞表面受体CD19起着关键作用。
CD19抗体可以靶向作用于B细胞淋巴瘤细胞表面，且本身具有抗淋巴瘤的作用。但是CD19抗体的分子量较大，具有抗原性，长期用于人体会产生中和反应，降低药效。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子CD19抗体多肽与环磷酰胺偶联的结合物，促进环磷酰胺的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
技术实现要素：
发明目的
本发明提供一种特异性强，纯度较高的小分子CD19抗体多肽与环磷酰胺偶联的结合物，促进环磷酰胺的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
技术方案
本发明的技术方案在于提供一种小分子CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物，其特征在于：环磷酰胺和CD19抗体多肽的偶联结合物；所述CD19抗体多肽为全新序列。所述偶联结合物的制备，步骤包括：(1)用0.1mol/L HCl溶液配制2-8mmol/L浓度的环磷酰胺；(2)4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应20-30分钟；(3)用pH8-10的缓冲液溶解所述的CD19抗体多肽；(4)所述CD19抗体多肽溶液中加入重氮化的环磷酰胺，调节pH到9-10；(5)4-8℃，反应2小时；(6)PBS透析2天，即得。所述的CD19抗体多肽采用化学合成法制备。所述偶联结合物，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。优选为在制备用于治疗恶性淋巴瘤药物中的应用，尤其是用于治疗非霍奇金淋巴瘤药物中的应用。
有益效果
本发明的小分子CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物，可用于促进环磷酰胺的肿瘤靶向性，提高疗效，降低毒副作用。有益效果在于(1)提高环磷酰胺在体内肿瘤组织的浓度；同时降低环磷酰胺在全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑等组织的分布；(2)显著性抑制肿瘤细胞的增殖；(3)降低环磷酰胺的毒性；(4)小分子CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物能与肿瘤细胞的特异性结合；(5)提高荷瘤小鼠生存率。
具体实施方式
多肽由上海生工吉尔合成。
实施例1
制备CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物：用0.1mol/L HCl溶液配制2mmol/L浓度的环磷酰胺；4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应20分钟；用pH8的缓冲液溶解所述的CD19抗体多肽；CD19抗体多肽溶液中加入重氮化的环磷酰胺，调节pH到9；在4-8℃，反应2小时；再用PBS透析2天，冻干，即得。
实施例2
制备CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物：用0.1mol/L HCl溶液配制
8mmol/L浓度的环磷酰胺；4℃，滴加1％NaNO2，持续搅拌，反应30分钟；用pH10的缓冲液溶解所述的CD19抗体多肽；CD19抗体多肽溶液中加入重氮化的环磷酰胺，调节pH到10；在4-8℃，反应2小时；再用PBS透析2天，冻干，即得。
实施例3
用人B细胞淋巴瘤移植瘤模型检测CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物的体内活力。
6-8w龄SCID小鼠，小鼠随机分成5组，雌雄各半，每组10只。(1)空白组；(2)结合物低剂量组；(3)结合物中剂量组；(4)结合物高剂量组；(5)环磷酰胺阳性组。建立人B细胞淋巴瘤移植瘤模型，在接种淋巴瘤细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为结合物设3个剂量：0.05、0.1、0.2mmol/Kg，阳性组为0.2mmol/Kg的环磷酰胺，每天给药，连续14天。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，结合物可有效地保护荷瘤小鼠，在剂量0.05、0.1、0.2mmol/Kg时可以提高荷瘤小鼠的生存率，生存率分别为67.43，78.67，79.03％。
实施例4
B细胞淋巴瘤的体外增殖率实验：采用MTT比色法。将对数生长的人B细胞淋巴瘤细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h；实验分为5组，分别为空白组、阳性组和低中高剂量的实施例1得到的CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物；分别加入相同体积的DMEM培养基(HyClone，含胎牛血清20％)，环磷酰胺(1mmol/ml)和CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物(10、20、40μmol/ml)。每孔设五个复孔，培养48h，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式成B细胞淋巴瘤抑制率＝(1—实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。环磷酰胺阳性组和实施例1的偶联结合物实验组的B细胞淋巴瘤细胞的抑制率分别为78.9、47.02、69.1和87.2％(p＜0.05)。结果显示，实施例1的偶联结合物能有效抑制肿瘤细胞生长，高剂量结合物的肿瘤抑制率高于环磷酰胺。
实施例5
用人B细胞淋巴瘤移植瘤模型检测CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物的体内分布。
6-8w龄SCID小鼠，小鼠随机分成3组，雌雄各半，每组6只。(1)空白组；(2)结合物组；(3)环磷酰胺阳性组。建立人B细胞淋巴瘤移植瘤模型，在接种淋巴瘤细胞后的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为0.2mmol/Kg剂量的结合物，阳性组为0.2mmol/Kg的环磷酰胺，每天给药，连续7天。14天后，将小鼠处死后，分别取全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤等组织。全血肝素抗凝，将肝素抗凝血离心沉淀血细胞,取上清血浆0.5ml，加入2.67％HCLO4，离心沉淀血浆蛋白，上清水浴加热100℃20分钟，待测；各组织经过匀浆、除蛋白、离心后，取上清。将血浆及组织的上清分别加NBP在碱性条件下进行显色反应，然后在575nm波长下进行比色测定。计算小鼠血浆及各组织中环磷酰胺的浓度。
表1 结合物在肿瘤模型动物中血浆及组织分布浓度
*P<0.05，**P<0.01与阳性组相比。
实验结果见表1，与环磷酰胺阳性组比较，CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物组体内肿瘤组织中的浓度明显升高，(p＜0.05)，而心、肝、脾、肺、肾、脑等组织，以及血浆中的环磷酰胺浓度明显降低，尤其是血浆中的药物浓度为23.98±32.62μg/ml(p＜0.05)，有显著性差异。
实施例6
CD19抗体多肽与环磷酰胺的偶联结合物的的毒性作用。采用实施例1结合物，测定半数致死量：取60只小鼠随机分为6组，每组l0只。各组小鼠先禁食12h，分别腹腔注射不同剂量的实施例2结合物，剂量分别为125、250、500、1000、2000、5000mg/Kg，给受试药物后再禁食3-4小时。此后连续观察2周，有无死亡现象，计算半数致死量LD50。并观察皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现。
结果：实施例1结合物对小鼠的半数致死量LD50为1743.98mg/Kg。
实施例7
结合物与B细胞淋巴瘤细胞的结合率：采用ELISA方法，将对数生长的人B细胞淋巴瘤细胞，以1.0×105加入96孔酶标板上，4℃，包被过夜；PBS三次洗板后，将实施例1的结合物，按空白组，浓度梯度0、10、20、40μmol/ml分别加入96孔板中，同时每孔加入定量的抗CD19抗体竞争结合，37℃，孵育2小时时间后；PBS三次洗板后，再加入偶联辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的抗人IgG抗体，37℃，孵育1小时；再PBS三次洗板后，加入ABC溶液，孵育10-20分钟，最后用流水终止反应；显微镜观察，所述实施例1结合物与肿瘤细胞结合的细胞呈棕黑色，为阳性细胞，采用计算机软件计算呈阳性细胞的数量。
结果：实施例1结合物与B细胞淋巴瘤细胞结合的数量与空白组相比有显著性差异，剂量为40μmol/ml时，阳性细胞数量达到475.9±34.6(p＜0.05)。由此可见，实施例1结合物与B细胞淋巴瘤细胞结合率随剂量递增。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种CD19抗体多肽与环磷酰胺偶联的结合物
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 14
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro
20 25 30
Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg
35 40