本发明是抗体偶联药物领域。具体来说，本发明涉及脑淀粉样蛋白抗体多肽偶联雌激素的结合物。
背景技术：
阿尔茨海默氏症是全世界范围内最常见的神经退行性疾病之一。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。自从1986年Fillit首先报道雌激素治疗7例AD患者3例有效后，越来越多的研究证明雌激素能够治疗此病。其作用机制可能为：促进神经突触的生长并增加神经生长因子及其受体的表达；抑制β淀粉样蛋白的沉淀；拮抗β淀粉样蛋白的毒性作用。有研究表明雌激素治疗阿尔茨海默病与脑内的烟碱性乙酰胆碱受体(nAchR)表达的增加有关。使用雌激素药物治疗老年痴呆症主要用来缓解女性患者的症状，并可以延缓或防止患者病情的继续发展。雌激素同时，的抗氧化作用可以减少淀粉样蛋白沉积对细胞的损伤，促进神经元的修复，防止神经细胞死亡。尽管如此，对绝经妇女而言，长期服用雌激素会导致子宫癌的发生，或血栓性自身免疫疾病。因此不得不放弃雌激素的治疗。其原因在于，雌激素为全身性用于，而非特异性作用与脑部神经细胞。从而导致副作用的发生。因此，发明人希望能够将雌激素与特异性的抗体偶联，从而产生神经细胞的靶向作用，提高疗效，减少毒副作用。
研究发现，阿尔茨海默氏症的的临床发病特征是导致神经细胞功能障碍和神经细胞死亡的细胞外淀粉样蛋白斑块和细胞内神经原纤维结节。整合在神经细胞膜内的APP蛋白(Amyloid Precursor Protein，淀粉样前体蛋白)在正常状态和发病状态下的不同加工过程是导致疾病发生的关键因素。在正常状态下，APP最初是由α-分泌酶裂解并产生sAPPα和C-末端片段C83。sAPPα与正常的突触通讯相关，对于突触的形成、学习和记忆、感情活动和神经细胞存活等生命活动和过程至关重要。在发病状态下，APP被β-分泌酶和γ-分泌酶裂解并产生一个叫大脑淀粉样蛋白(Aβ)40/42的胞外片段。这个片段具有神经毒性，经常会发生聚集并发生多聚化，造成神经细胞上离子通道的阻塞，引起钙离子动态平衡的破坏、线粒体的氧化应激、能量代谢的破坏和糖类代谢调节的异常，并最终导致神经细胞的死亡。当前，大量的研究已经把焦点放在针对AD发病机制的治疗上，主要是试图抑制Aβ的产生、减少Aβ的沉积，同时增加脑组织对Aβ的清除能力。(1)Aβ免疫治疗：1999年，Schenk等研究小组首次用AI3为免疫原，对具有纤维状Aβ沉积的转基因小鼠进行主动免疫治疗，治疗后减少了实验动物脑内B淀粉样肽沉积的形成。使用抗Aβ抗体进行被动免疫也发现，抗AB单克隆抗体能够阻止Aβ的形成，并且能够降低已经形成的B淀粉样纤维。这一作用可能是通过抗Aβ抗体和老年斑部位的Aβ结合，从而诱导胶质细胞对Aβ进行清除。
如果能将抗Aβ抗体和雌激素偶联，不仅能发挥两者的双重作用，同时，可以促进雌激素的靶向性，降低毒副作用。但是抗Aβ抗体本身的分子量较大，具有抗原性，长期用于人体会产生中和反应，降低药效。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子Aβ抗体多肽与雌激素偶联的结合物，促进雌激素的脑靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
技术实现要素：
发明目的
本发明提供一种特异性强，纯度较高的小分子淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素偶联的结合物，促进雌激素的脑靶向性，提高疗效，降低毒副作用。
技术方案
本发明的技术方案在于提供一种小分子淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素的偶联结合物，其特征在于：(1)雌激素溶于100mmol/L NaIO4溶液中，4℃避光反应30-60分钟；(2)加乙二醇，得A液；(3)将A液加入到pH为9.0-10.0的所述淀粉样蛋白抗体多肽的溶液中，4℃反应2小时；(4)加入50mg/ml NaBO4溶液，4℃反应过夜；(5)用含有MgCl2 10mmol/L，2-巯基乙醇10mmol/L、NaCl 100mmol/L的50mmol/L磷酸缓冲液透析，即得。所述的雌激素包括雌二醇和雌三醇；所述的淀粉样蛋白抗体多肽采用化学合成法制备；所述偶联结合物，在制备用于治疗神经退行性疾病药物中的应用。优选为在制备用于治疗阿尔茨海默氏症药物中的应用。
有益效果
本发明的小分子淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素的偶联结合物，可用于促进雌激素的脑靶向性，提高疗效，降低毒副作用。有益效果在于(1)提高雌激素在体内脑组织的浓度；同时降低雌激素在全血，以及心、肝、脾、肺、肾等组织的分布；(2)提高老年痴呆模型动物的空间记忆功能；(3)影响老年痴呆模型动物的SOD和MDA含量，延缓脑功能衰老；(4)淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素的偶联结合物能与海马区脑细胞结合。
具体实施方式
多肽由上海生工吉尔合成。
实施例1
制备淀粉样蛋白抗体多肽与雌二醇的偶联结合物：100μg雌二醇溶于100mmol/L NaIO4溶液中，4℃避光反应30分钟；加乙二醇，得A液；将A液加入到pH为9.0的淀粉样蛋白抗体多肽溶液中，4℃反应2小时；加入50mg/ml NaBO4溶液，4℃反应过夜；用含有MgCl2 10mmol/L，2-巯基乙醇10mmol/L、NaCl 100mmol/L的50mmol/L磷酸缓冲液透析，冻干，即得。
实施例2
制备淀粉样蛋白抗体多肽与雌三醇的偶联结合物：500μg雌二醇溶于100mmol/L NaIO4溶液中，4℃避光反应60分钟；加乙二醇，得A液；将A液加入到pH为9.0的淀粉样蛋白抗体多肽溶液中，4℃反应2小时；加入50mg/ml NaBO4溶液，4℃反应过夜；用含有MgCl2 10mmol/L，2-巯基乙醇10mmol/L、NaCl 100mmol/L的50mmol/L磷酸缓冲液透析，冻干，即得。
实施例3
淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素的偶联结合物对老年痴呆模型动物学习记忆功能的影响。
3个月龄ICR雌性小鼠，小鼠随机分成5组，每组10只。(1)空白组；(2)结合物低剂量组；(3)结合物中剂量组；(4)结合物高剂量组；(5)雌激素阳性组。建立人阿尔茨海默氏症模型，除空白组，各组小鼠每日颈背部皮下注射无菌D-半乳糖1000mg/Kg，组相应剂量的D-半乳糖溶液，0.01ml/g体重。空白对照组每日注射等量生理盐水，连续注射8周。在造模开始的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为结合物设3个剂量：0.05、0.1、0.2mmol/Kg，阳性组为0.2mmol/Kg的雌激素，每天给药，连续7周。8周后，最后一次给药后1小时，进行水迷宫试验。将事先训练过的实验组小鼠放入直径100cm，高50cm，水深30cm的小圆形水池的池壁，池中有站台，站台直径8cm，高度在29cm，没于水下1cm，观察小鼠从放入池壁到找到平台的时间为潜伏期，记录潜伏期，并进行计算。
结果显示，结合物在剂量0.05、0.1、0.2mmol/Kg时可以显著性减少小鼠找到平台的潜伏期，其潜伏期分别为28.3±5.3、18.7±2.9、8.4±1.98秒，与空白组相比有显著性差异(P<0.01)。由此可见，结合物可以提高老年痴呆模型小鼠的空间记忆功能。
实施例3
淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素的偶联结合物对老年痴呆模型动物脑中SOD和MDA含量的影响。
3个月龄ICR雌性小鼠，小鼠随机分成6组，每组10只。(1)空白组；(2)结合物低剂量组；(3)结合物中剂量组；(4)结合物高剂量组；(5)雌激素阳性组；(6)模型对照组。建立人阿尔茨海默氏症模型，除空白组，各组小鼠每日颈背部皮下注射无菌D-半乳糖1000mg/Kg；空白对照组每日注射等量生理盐水，连续注射8周。在造模开始的第7天，分别尾静脉给药给药。给药方案为：空白组和模型对照组加入相同体积的溶剂，实验组为结合物设3个剂量：0.05、0.1、0.2mmol/Kg，阳性组为0.2mmol/Kg的雌激素，每天给药，连续7周。8周后，最后一次给药后1小时，取小鼠全脑，匀浆、离心、取上清，采用SOD和MDA试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定脑中SOD和MDA含量。
结果显示，结合物在剂量0.05、0.1、0.2mmol/Kg时可以显著性提高老年痴呆模型小鼠脑中SOD含量，同时降低MDA含量。由此可见，结合物可以通过影响老年痴呆模型小鼠血清中脑抗氧化因子SOD和氧化物MDA的含量，延缓脑功能减退。
表1 实施例1结合物对老年痴呆模型动物脑中SOD和MDA的含量的作用
*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。
实施例4
淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素的偶联结合物在小鼠体内的分布。
6-8w龄ICR雌性小鼠，小鼠随机分成3组，每组6只。(1)空白组；(2)结合物组；(3)雌激素阳性组。给药。给药方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组为0.2mmol/Kg剂量的结合物，阳性组为0.2mmol/Kg的雌激素，尾静脉给药，每天给药，连续7天。14天后，将小鼠处死后，分别取全血，以及心、肝、脾、肺、肾、脑等组织。全血肝素抗凝，将肝素抗凝血离心沉淀血细胞，取上清血浆0.5ml，采用放射免疫试剂盒(购自北京北方生物技术研究所有限公司)检测小鼠血浆及各组织中雌激素的浓度。
表2 结合物在老年痴呆模型动物中血浆及组织分布浓度
*P<0.05，**P<0.01与阳性组相比。
实验结果见表2，与雌激素阳性组比较，淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素的偶联结合物组体内脑组织中的浓度明显升高(p＜0.05)，而心、肝、脾、肺、肾等组织，以及血浆中的雌激素浓度明显降低，尤其是血浆中的药物浓度将为101.43±35.65pg/ml(p＜0.01)，有显著性差异。
实施例5
采用免疫组化法评价结合物与神经细胞的结合率：
方法：6-8w龄ICR雌性小鼠，将小鼠处死后，取出脑组织，立即放入4％甲醛中固定24-48小时，脱水、包埋、切片后，将脑组织片贴于载玻片上；将组织片分组，按照空白、浓度梯度0、5、10、20mmol/ml；除空白组，每个组织片上加入定量的所述实施例1结合物，37℃，孵育2小时时间后；PBS三次洗板后，再加入偶联辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗人IgG抗体，37℃，孵育1小时；再PBS三次洗板后，加入ABC显色液，孵育10-20分钟，最后用蒸馏水终止反应；显微镜下观察脑海马区，所述实施例1结合物与脑组织结合的细胞呈棕黑色，为阳性细胞，采用计算机软件计算脑海马区呈阳性细胞的数量。
结果：实施例1结合物与脑海马区脑细胞结合数量在结合物剂量为5、10、20mmol/ml时，阳性细胞分别为128.0±35.3、148.7±28.9、238.4±41.0，与空白组相比有显著性差异(p＜0.05)。由此可见，实施例1结合物与脑海马区脑细胞结合率随剂量递增。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种淀粉样蛋白抗体多肽与雌激素偶联的结合物
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Ser Ile Gly Gly Ser Leu Asn Trp Tyr
1 5 10 15
His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ser Leu Leu Ile
20 25