一种包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法与流程

本发明涉及一种白蛋白纳米颗粒载体的制备方法，尤其是涉及一种包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法，属于生物医药材料制备技术领域。

背景技术：

紫杉醇（Paclitaxel）是从红豆杉属植物的枝叶和树皮中分离得到的一种二萜类化合物，分子式为C₄₇H₅₁NO₂₄，分子量为853.94。紫杉醇通过诱导微管蛋白聚合致使癌细胞有丝分裂停止，具有光谱抗肿瘤性，在临床上主要用于卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等肿瘤的治疗。美国食品药品监督管理局（Food and drug administration, FDA）于1992年开始批准紫杉醇用于各种癌症的治疗，至今，已有40多个国家批准紫杉醇用于癌症的治疗。

多烯紫杉醇（Docetaxel）是一种半合成的化合物，是从欧洲红豆杉中提取的无活性前体（10-去乙酰基浆果赤霉素）半合成制得的，分子式为C₄₃H₅₃NO₁₄，分子量为807.88。多烯紫杉醇的抗癌机制与紫杉醇相同，对于治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、胃癌、卵巢癌和前列腺癌等有很好的疗效。与紫杉醇相比，多烯紫杉醇的结构存在两个改变，其一是在紫杉酚B环的C-10位置上用羧基替代乙酰基，其二是C-13侧链发生变化，化学结构的差别导致多烯紫杉醇和紫杉醇活性的不同，其细胞毒作用是紫杉醇的1.3-12倍。

由于其结构的特殊性，紫杉烷类药物水溶性非常差，在室温下溶解度小于1 μg/mL，所以紫杉烷类药物制剂研究的关键技术是解决其在水溶液中的溶解性，目前临床上使用的主要有水针注射剂和冻干粉剂。目前，市售的水针注射剂紫杉醇（Taxol）采用聚氧乙烯蓖麻油（Cremphor EL）和无水乙醇作为溶媒，而多烯紫杉醇则采用聚山梨醇酯80（吐温80）和无水乙醇作为溶媒，尽管在一定程度上增加了药物溶解度，但给药后患者存在严重的过敏反应、肾毒性、神经毒性、心脏毒性、低血压等不良反应。因此，不含毒性大的有机溶剂的冻干粉剂的研究成为当前的研究热点。

目前，也有一些相对较好的制备包裹紫杉烷类药物的冻干粉剂的方法，如公开日为2013年6月26日，公开号为CN103169662的中国专利，公开了一种制备紫杉醇高分子纳米颗粒的方法，该方法采用聚乳酸、聚羟基丁酯酸、聚（乳酸-乙醇酸）中的一种或其组合为原材料，利用有机溶剂形成乳化液，通过旋转蒸发以及多次“高速离心-重悬”过程，然后通过冷冻干燥得到紫杉醇高分子纳米颗粒，颗粒粒径为50～800 nm。在该方法中，紫杉醇和高分子材料只是物理混合，不改变紫杉醇药物的作用特征。但是该工艺过程较复杂，可控性较差，由于紫杉醇和高分子材料仅仅是简单物理作用，稳定性较差。

又如公开日为2015年11月25号，公开号为CN103735514的中国专利中，公开了一种聚乙二醇维生素E琥珀酸酯和钙网蛋白修饰的纳米粒的制备方法，该制备方法采用磷脂、槐糖脂、钙网蛋白、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯为原材料，利用乙醇作为介导，真空旋转蒸发法制备能够包裹紫杉醇、桑色素、芹菜素等疏水药物、平均粒径位100～150 nm的纳米粒。该方法制备工艺简单可控，纳米粒稳定性较高，但是该工艺得到的产品成分复杂，存在较大安全隐患。

又如公开日为2015年4月8号，公开号为CN104490847的中国专利中，公开了一种热变性制备白蛋白纳米颗粒的方法，该方法通过加入香草醛或其类似物，在加热条件下通过白蛋白分子间的二硫键、酰胺键以及白蛋白分子与香草醛分子之间形成希夫碱等化学键形成稳定的纳米颗粒，制备过程中不引入任何有机溶剂，安全无毒，但是该方法需加热至120℃，高温可能会改变紫杉烷类药物的结构以及作用特征。

又如公开日为2012年12月5号，公开号为CN102274190的中国专利中，公开了制备紫杉醇白蛋白亚微粒的方法，该方法利用叔丁醇作为乳化剂，将紫杉醇有效包埋于白蛋白，并利用冷冻干燥法去除叔丁醇。由于制备体系中存在糖类物质或者氨基酸类物质作为冻干保护剂，最终得到结构稳定的紫杉醇白蛋白亚微粒。该方法制备工艺简单，安全无毒，可长期存放，但是通过该方法制备的紫杉醇白蛋白亚微粒粒径较大，为300～500 nm。

迄今为止，美国生物制药公司赛尔基因研制的紫杉醇白蛋白结合颗粒（Abraxane）是FDA唯一批准上市的紫杉醇的纳米粒冻干粉剂，该制剂采用ABI专利纳米粒白蛋白结合（nab）技术制备，仅有白蛋白和紫杉醇组成，不含有毒溶媒，其适用于治疗联合化疗失败的转移性乳腺癌或辅助化疗失败后6个月内复发的乳腺癌、晚期或转移性非小细胞癌以及转移性胰腺癌。与Taxol相比，Abraxane中紫杉醇的溶解度得到了显著提高，极大降低过敏反应的发生。一项454例患者参加的Abraxane和Taxol随机对照III期临床研究表明，接受Abraxane治疗的病人疗效几乎是Taxol的2倍，而且因Abraxane不含有毒溶媒，用药剂量比Taxol大，可增强抗肿瘤作用。

白蛋白是血浆中存在的蛋白，在研究中常用的有牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）和人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）。除了具备安全无毒、可生物降解、无免疫原性等特点，白蛋白纳米载体还具有自身的优点：首先，血清白蛋白作为一种天然的运载蛋白，具有多个药物结合位点，包括疏水性和亲水性药物，因此，白蛋白纳米药物载体具有很高的载药能力。其次，白蛋白纳米药物载体具有天然的跨膜转运通路，并可实现包载药物对肿瘤组织的靶向运输。目前，白蛋白纳米载体制备方法常见的有反溶剂法、乳化法、热凝胶法、nab技术、自组装技术、纳米喷雾干燥等。nab技术是目前认可度较高的血清白蛋白纳米药物载体制备方法，除了Abraxane于2005年1月获得美国FDA的批准上市，还有其他多个基于nab技术的药物正在研制中，如ABI-008（nab-多烯紫杉醇）、ABI- 009（nab-雷帕霉素）等。然而，作为一种理想的纳米药物载体，由nab技术制备的白蛋白纳米颗粒尚存在不足：Abraxane颗粒粒径为130 nm，并非严格意义的纳米尺寸；该法制得的纳米粒稳定性差，不能承受缓冲溶液的稀释作用，在24 h内聚集成较大颗粒。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种安全无毒、稳定、符合纳米尺寸的能包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法，包括以下步骤：

1）配制体积质量浓度为20～200 mg/mL的白蛋白水溶液，得到溶液A。

2）以有机化合物作为溶剂配制体积质量浓度为0.5～5mg/mL的紫杉烷类药物的溶液，得到溶液B。

3）将纯水和溶液A按照一定比例混合，200～1000 rpm搅拌3～10min，得到溶液C；将溶液B的溶剂以及溶液B按照一定比例混合，200～1000 rpm搅拌3～10min，得到溶液D；将溶液C和溶液D快速混合，200 ～1000 rpm搅拌3～10min，室温静置3～20 min，得到溶液E；此处采用搅拌技术，是需要将白蛋白、紫杉烷类药物以及溶剂在水溶液体系中充分混合、接触，从而白蛋白和紫杉烷类药物分子之间发生作用，形成纳米颗粒。高压均质以及超声等高剪切技术虽然具有超强的混合和乳化等功能，但同样也会对白蛋白分子产生影响，破坏其结构，实验数据证明蛋白分子的天然构象影响纳米颗粒对紫杉烷类药物的包埋效果。

4）将溶液E预冻12 h以上，进行第一次冷冻干燥处理，冷冻干燥机冷阱温度设置-30～- 50 ℃，真空度要求≤ 50 Pa，冻干时间≥36 h，去除体系中的有机溶剂和水，得到干燥的无定形粉末，无定形粉末中含有包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒和少量未被包埋的紫杉烷类药物。

5）将无定形粉末加适量纯水复溶，得到溶液F，溶液F通过冷冻高速离心机离心，0～4 ℃，10000～15000 rpm离心10～30 min，取上清，得到溶液G。本步骤是为了去除了未被包埋的紫杉烷类药物，离心转速的大小及时间均与未被包埋紫杉烷类药物的清除率有关。

6）将溶液G预冻12 h以上，进行第二次冷冻干燥处理，冷冻干燥机冷阱温度设置-30～- 50 ℃，真空度要求≤ 50 Pa，冻干时间≥18 h，去除体系中的水，得到包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒。

本发明所述的白蛋白包括人血清白蛋白以及重组人血清白蛋白。如果将蛋白换成其他蛋白，如肌红蛋白和溶菌酶，则形成的颗粒粒径会增大，而且二次冻干后，颗粒不稳定，发生聚合，同时载药率也大大减少。

本发明所述的紫杉烷类药物包括紫杉醇和多烯紫杉醇以及其他结构修饰衍生物。

本发明所述的紫杉烷类药物的溶剂只能为正丁醇、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜、乙酐、氯苯以及乙二醇苯醚中的一种或几种，如果换成乙醇、甲醇以及乙酸乙酯等其他常见有机溶剂，将会出现白蛋白颗粒粒径过大甚至沉淀等现象。

本发明所述的溶液E中，纯水、溶液A、溶剂和溶液B的体积比为(64～89):1:(0～25):(10～15)。

本发明涉及的制备方法中需要两次冷冻干燥过程，第一次冷冻干燥体系中存在水和溶剂，而第二次冷冻干燥体系中仅为水。正丁醇、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜、乙酐、氯苯以及乙二醇苯醚等溶剂的沸点均大于水的100 ℃，其升华所需要的时间比水要长，因此，所述的第一次冷冻干燥时间≥36 h，第二次冷冻干燥时间≥18 h。

本发明所述的白蛋白纳米颗粒大小均一，粒径为15～100 nm，Zeta电位在-25～-40 mV。

本发明所述的白蛋白纳米颗粒载体对紫杉烷类药物的载药率为6～10%，包封率为50～80%。

本发明中包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒的形成机制：通过溶剂的作用，引起人血清白蛋白分子局部变性，破坏其高级构象，紫杉烷类药物分子作为疏水小分子，将会与白蛋白分子中的疏水基团靠近，最终形成一个以紫杉烷类药物为核心的白蛋白纳米颗粒，白蛋白分子的亲水基团暴露在水溶液体系中；与此同时，由于紫杉烷类药物分子中存在多个羰基，而白蛋白分子中有多个酪氨酸，酪氨酸拥有酚羟基，酚羟基在疏水环境中极不稳定，因此，紫杉烷类药物分子附近的酚羟基很容易与羰基形成氢键，因此，在疏水作用力和氢键的共同作用下，形成了结构稳定的包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒粒径小于100 nm，真正实现严格意义上的纳米尺寸，延长了药物在体内的循环时间，增强了药效；包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒有着稳定的zeta电位（-25～-40 mV），也就是颗粒表面带负电，静电斥力阻止了颗粒之间的聚集，因此本发明制得的包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒在临床使用和机体循环系统中稳定；本发明的制备过程中只涉及紫杉烷类药物、白蛋白、溶剂和水四种成分，其中溶剂和水通过两次冷冻干燥过程可以完全去除，因此，最终产品冻干粉剂仅包括紫杉烷类药物和白蛋白，避免了有机溶剂带来的毒副作用，提高了安全性；本发明的纳米颗粒的形成是通过疏水作用力和氢键等化学作用力，而非物理作用，因此，冷冻干燥过程不会破坏纳米颗粒的结构，所以，在两次冷冻干燥过程中不需要添加任何冻干保护剂，保证了本发明最终产品成分只含有紫杉烷类药物和白蛋白；本发明操作过程温度较低，适合高温下不稳定的药物，操作简单方便，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1的包裹紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒冻干粉末的稳定性研究的曲线示意图。

图2为本发明实施例2的包裹多烯紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒冻干粉末的原子力显微镜照片。

图3为本发明实施例2的包裹多烯紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒冻干粉末在37℃条件下的体外释放曲线示意图。

具体实施方式

下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1。

本实施例中制备包裹紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒以人血清白蛋白和紫杉醇为原料，制备包裹紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒。

本实施例中包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法如下：配制体积质量浓度为100 mg/mL的人血清白蛋白水溶液，得到溶液A；以甲苯作为溶剂配制体积质量浓度为2.56 mg/mL的紫杉醇溶液，得到溶液B；将87 mL纯水和1 mL溶液A混合，800 rpm搅拌8 min，得到溶液C；将2 mL二甲基亚砜和10 mL溶液B混合，700 rpm搅拌6 min，得到溶液D；将溶液C和溶液D快速混合，800 rpm搅拌10 min，室温静置25 min，即得到100 mL包含包裹紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒的溶液E；将溶液E放置-80 ℃冰箱冷冻12 h以上，进行第一次冷冻干燥处理，时间为36 h，得到干燥的粉末，将粉末加50 mL纯水复溶，得到溶液F，溶液F通过冷冻高速离心机离心，4 ℃，10500 rpm离心25 min，取上清，得到溶液G；将溶液G放置-80 ℃冰箱冷冻12 h以上，进行第二次冷冻干燥处理，时间为20 h，得到包裹紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒粉末。

颗粒性状：采用Nano ZS激光粒度仪检测颗粒粒径和Zeta电位，结果见表1；采用高效液相色谱法测定载药颗粒中紫杉醇的吸光度，根据公式计算人血清白蛋白纳米颗粒载体对紫杉醇的载药率和包封率，具体结果见表1。

实施例2。

本实施例中制备包裹多烯紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒以人血清白蛋白和多烯紫杉醇为原料，制备包裹多烯紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒。

本实施例中包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法如下：配制体积质量浓度为100 mg/mL的人血清白蛋白水溶液，得到溶液A；以正丁醇作为溶剂配制体积质量浓度为1.21 mg/mL的多烯紫杉醇溶液，得到溶液B；将79 mL纯水和1 mL溶液A混合，750 rpm搅拌8 min，得到溶液C；将10 mL正丁醇和10 mL溶液B混合，700 rpm搅拌6 min，得到溶液D；将溶液C和溶液D快速混合，750 rpm搅拌10 min，室温静置20 min，即得到100 mL包含包裹多烯紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒的溶液E；将溶液E放置-80 ℃冰箱冷冻12 h以上，进行第一次冷冻干燥处理，时间为36 h，得到干燥的粉末，将粉末加50 mL纯水复溶，得到溶液F，溶液F通过冷冻高速离心机离心，4 ℃，15000 rpm离心15 min，取上清，得到溶液G；将溶液G放置-80 ℃冰箱冷冻12 h以上，进行第二次冷冻干燥处理，时间为20 h，得到包裹多烯紫杉醇的人血清白蛋白纳米颗粒粉末。

颗粒性状：采用Nano ZS激光粒度仪检测颗粒粒径和Zeta电位，结果见表1；采用高效液相色谱法测定载药颗粒中紫杉醇的吸光度，根据公式计算人血清白蛋白纳米颗粒载体对紫杉醇的载药率和包封率，具体结果见表1。

实施例3。

本实施例中制备包裹紫杉醇的重组人血清白蛋白纳米颗粒以重组人血清白蛋白和紫杉醇为原料，制备包裹紫杉醇的重组人血清白蛋白纳米颗粒。

本实施例中包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法如下：配制体积质量浓度为100 mg/mL的重组人血清白蛋白水溶液，得到溶液A；以乙二醇苯醚作为溶剂配制体积质量浓度为1.28 mg/mL的紫杉醇溶液，得到溶液B；将34.5 mL纯水和1 mL溶液A混合，850 rpm搅拌7 min，得到溶液C；将25 mL二甲基亚砜和10 mL溶液B混合，700 rpm搅拌6 min，得到溶液D；将溶液C和溶液D快速混合，850 rpm搅拌10 min，室温静置30 min，即得到100 mL包含包裹紫杉醇的重组人血清白蛋白纳米颗粒的溶液E；将溶液E放置-80 ℃冰箱冷冻12 h以上，进行第一次冷冻干燥处理，时间为48 h，得到干燥的粉末，将粉末加60 mL纯水复溶，得到溶液F，溶液F通过冷冻高速离心机离心，4 ℃，12500 rpm离心25 min，取上清，得到溶液G；将溶液G放置-80 ℃冰箱冷冻12 h以上，进行第二次冷冻干燥处理，时间为20 h，得到包裹紫杉醇的重组人血清白蛋白纳米颗粒粉末。

颗粒性状：采用Nano ZS激光粒度仪检测颗粒粒径和Zeta电位，结果见表1；采用高效液相色谱法测定载药颗粒中紫杉醇的吸光度，根据公式计算重组人血清白蛋白纳米颗粒载体对紫杉醇的载药率和包封率，具体结果见表1。

表1 包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒的粒径、Zeta电位、载药率和包封率（n=3）

实施例4。

本实施例中包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒载体的制备方法包括以下步骤。

1）配制体积质量浓度为20～200 mg/mL的白蛋白水溶液，得到溶液A。

2）以有机化合物作为溶剂配制体积质量浓度为0.5～5 mg/mL的紫杉烷类药物的溶液，得到溶液B。

3）将纯水和溶液A混合，200～1000 rpm搅拌3～10min，得到溶液C；将溶液B的溶剂以及溶液B混合，200～1000 rpm搅拌3～10min，得到溶液D；将溶液C和溶液D快速混合，200～1000 rpm搅拌3～10min，室温静置3～20 min，得到溶液E。

4）将溶液E放置于-20～-80 ℃冰箱预冻12 h以上，然后进行第一次冷冻干燥处理，冷冻干燥机冷阱温度设置-30～- 50 ℃，真空度要求50 Pa以下，冷冻干燥时间36 h以上，得到干燥的无定形粉末。

5）将步骤4）中得到的无定形粉末加适量纯水复溶，得到溶液F，溶液F通过冷冻高速离心机离心，0～4 ℃，10000～15000 rpm离心10～30 min，取上清液，得到溶液G。

6）将溶液G放置于-20～-80 ℃冰箱预冻12 h以上，然后进行第二次冷冻干燥处理，冷冻干燥机冷阱温度设置-30～- 50 ℃，真空度要求50 Pa以下，冷冻干燥时间18 h以上，得到包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒。

本实施例的白蛋白可以为人血清白蛋白和/或重组人血清白蛋白。紫杉烷类药物包括紫杉醇和多烯紫杉醇以及衍生物中的一种或者两种以上。紫杉烷类药物的溶剂为正丁醇、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜、乙酐、氯苯以及乙二醇苯醚中的一种或两种以上。溶液E中，纯水、溶液A、溶剂和溶液B的体积比为(64～89):1:(0～25):(10～15)。白蛋白纳米颗粒大小均一，粒径为15～100 nm，Zeta电位在-25～-40 mV。白蛋白纳米颗粒载体对紫杉烷类药物的载药率为6～10%，包封率为50～80%。

本发明通过加入溶剂介导，在室温条件下快速形成包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒溶液，然后通过二次冷冻干燥得到稳定的包裹紫杉烷类药物的白蛋白纳米颗粒粉末。最终的冻干粉末仅包括两种组分：白蛋白和紫杉烷类药物，颗粒呈规则的球形形貌，且粒径小于100 nm，具有较高的载药率和包封率，体外释放实验表明具有良好的缓释效果。本发明提供的紫杉烷类药物纳米颗粒，提高了此类制剂的安全性和顺应性。本发明的制备工艺简单易行，易重复，可控性好，适合工艺化生产，具有很好的应用前景。

本发明将无定形粉末加适量纯水复溶，得到溶液F，溶液F通过冷冻高速离心机离心，0～4 ℃，10000～15000 rpm离心10～30 min，取上清，得到溶液G。本步骤是为了去除了未被包埋的紫杉烷类药物，离心转速的大小及时间均与未被包埋紫杉烷类药物的清除率有关，具体数据见表2。

本发明的白蛋白包括人血清白蛋白以及重组人血清白蛋白。如果将蛋白换成其他蛋白，如肌红蛋白和溶菌酶，则形成的颗粒粒径会增大，而且二次冻干后，颗粒不稳定，发生聚合，同时载药率也大大减少，具体数据见表3。

本发明的紫杉烷类药物的溶剂只能为正丁醇、甲苯、二甲苯、二甲基亚砜、乙酐、氯苯以及乙二醇苯醚中的一种或几种，如果换成乙醇、甲醇以及乙酸乙酯等其他常见有机溶剂，将会出现白蛋白颗粒粒径过大甚至沉淀等现象，具体数据见表4。

表2 本发明实施例1中未被包埋紫杉醇的清除率与离心条件的关系

表3 包裹紫杉醇的三种不同蛋白纳米颗粒的特征

表4 添加不同有机溶剂白蛋白纳米颗粒的粒径

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明的保护范围。