本发明属于生物医学工程
技术领域：
，特别是皮肤修复材料制备
技术领域：
，具体涉及一种具有生物活性的皮肤修复材料及其制备方法。
背景技术：
：由机械、化学腐蚀或是微生物感染所引起的皮肤损伤是日常常见的皮肤疾病。虽然多数皮肤伤口可以自然愈合，但大面积的损伤或是由急性和慢性患者的皮肤损伤不加以适当的治疗是难以愈合。传统的治疗方法是通过自体或者异体供皮对损伤创面进行修复，但这种治疗方法存在着供体有限的不足。组织工程皮肤是采用“支架+种子细胞”的模式而制备，即先制备出具有多孔结构的支架材料，再将种子细胞接种到支架上进行培养，最终制得组织工程皮肤。但是这种方法存在着三大不足之处：支架结构的精确度不足，细胞植入的准确性低，整个制备过程所需时间长。首先，通过常规的支架成型方法如静电纺丝、相分离等技术所制备的支架其孔隙率，结构尺寸和微孔结构的连通性均只能控制在一定范围而不能精确在某一特定数值。而在细胞接种到支架材料的过程中，由于支架材料自身性能影响或是接种时人为操作的影响，接种后细胞在支架上的分别有一定随机性，或有可能出现细胞在支架材料上分布不均的情况，从而导致所制备的组织工程材料的生物活性大大降低。在整个制备的的过程中，需要先制成支架材料，再将种子细胞接种在其上面，最后还需要进行细胞的培养整个过程所需时间较长。综上所述这种组织工程皮肤的构建方法虽然简单易操作，但是在组织的结构、生物学上的性能与正常的皮肤组织存在明显的差距。而三维打印技术（3D-printing）在生物组织工程中的应用研究国内外已有大量的研究报道，其中生物三维打印已在个性化医疗模型、人体永久植入物、仿生支架、药物缓释模式等方面等到应用，这位皮肤组织工程的研究带来了新的研究思路。生物三维打印与普通的三维打印技术的不同在于其所打印的材料主要是以细胞、生物材料或是生产因子等。通过计算机辅助软件建模后，控制打印机沉积细胞或者生物材料的速度和位置，来实现仿生活性支架或是仿生材料的制造。在组织工程的应用上，生物三维打印能精确地控制支架材料和支架内部细胞的分布，构建与正常人体组织高度相似的组织材料，而且整个过程一步到位。采用生物三维打印来制备组织工程皮肤，可以解决支架结构的精准性、细胞植入的准确性和支架准备耗时长的问题。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有的组织工程皮肤的缺陷，解决现有的组织工程皮肤存在的支架结构精确度不足，细胞植入准确性低，制备过程需时的缺点。本发明提供一种具有生物活性的皮肤修复材料及其制备方法，该具有生物活性的皮肤修复材料免疫原性低，材料来源丰富，具有良好的生物相容性，对创面的愈合具有明显的促进作用。本发明通过生物三维打印技术所制备而成，可根据患者的实际情况来制备，整个制备过程所耗时间短，能做到现制现用，能真正地达到个性化治疗，也不存在产品因在运输或储存时的操作不当而对产品的性能造成影响。同时，本发明以胶原为基质材料，角质化细胞和成纤维细胞为生物活性成分，通过生物三维打印技术制备出具有促进创面愈合效果的仿生皮肤修复材料。为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种具有生物活性的皮肤修复材料，所述的皮肤修复材料由胶原、DMEM培养基、角质细胞和成纤维细胞组成。进一步的，所述的皮肤修复材料为两层结构，由仿表皮层和仿真皮层构成；所述的仿表皮层由胶原、DMEM培养基和角质细胞组成，仿真皮层由胶原、DMEM培养基和成纤维细胞组成。更进一步的，所述的仿表皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和角质细胞0.01~0.03份组成，所述的仿真皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和成纤维细胞0.01~0.03份组成。优选的，所述的胶原为市售猪源性胶原，DMEM培养基为市售细胞培养用培养基。优选的，所述的角质细胞和成纤维细胞是从人体皮肤获得，并用体积份数为10%的牛血清蛋白的DMEM培养基进行培养。为实现上述目的，本发明的另一技术方案为：一种具有生物活性的皮肤修复材料的制备方法，所述的制备方法通过以下步骤实现：仿表皮层材料的制备，仿真皮层材料的制备，用生物三维打印方法打印仿真皮层，用生物三维打印方法将仿表皮层打印在仿真皮层上，形成两层结构的具有生物活性的皮肤修复材料。进一步的，所述仿表皮层材料的制备具体如下：（1）按配方量将胶原溶于0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成质量浓度为10%的胶原溶液；（2）按配方量将DMEM粉末溶于去离子水中，配成质量浓度为4g/L的DMEM培养液；（3）将步骤（1）配置的胶原溶液与步骤（2）配成的DMEM培养液等体积混合，然后加1mol/L的碳酸氢钠溶液调节混合溶液的pH至中性，备用；（4）将步骤（3）得到的混合液置于无菌操作台，在紫外光灯下照射灭菌2~3h，然后按每毫升混合液1000个细胞的比例加入角质细胞，制备得到仿表皮层材料。更进一步的，所述仿真皮层材料的制备具体如下：（1）按配方量将胶原溶于0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成质量浓度为10%的胶原溶液；（2）按配方量将DMEM粉末溶于去离子水中，配成质量浓度为4g/L的DMEM培养液；（3）将步骤（1）配置的胶原溶液与步骤（2）配成的DMEM培养液等体积混合，然后加1mol/L的碳酸氢钠溶液调节混合溶液的pH至中性，备用；（4）将步骤（3）得到的混合液置于无菌操作台，在紫外光灯下照射灭菌2~3h，然后按每毫升混合液1000个细胞的比例加入成纤维细胞，制备得到仿真皮层材料。优选的，所述的生物三维打印方法采用气体动力喷射打印，温度控制在35~37℃。本发明的有益效果为：（1）本发明公开的具有生物活性的皮肤修材料具有免疫原性低，原材料丰富，价格低廉，制备方法简单的优点。（2）本发明以胶原作为皮肤修复材料的基质，将角质细胞和成纤维细胞与胶原基质复合后，利用生物三维打印技术进行仿生打印，达到现打现用的效果。这不仅克服了传统活性皮肤修复材料因存放时间过长或者存放条件错误而导致的活性失效的问题，而且所制得的皮肤修复材料可以跟着患者创面的实际情况去制定，不受产品的规格型号所限制，能真正达到个性化治疗的效果。（3）本发明所制备的皮肤修复材料是通过生物三维打印技术制备所得，通过将基质材料和种子细胞复合后再进行仿生打印。相比于传统的“支架+种子细胞”的组织工程皮肤材料制备方法，本发明所公开的制备方法具有支架已经支架微结构精确成型，种子细胞在支架中能均为分布，整个组织工程皮肤材料的制作所需时间短的优点。（4）本发明公开的皮肤修复材料为仿生双层结构，由仿表皮层和仿真皮层所构成。仿生表皮层中含有角质细胞，仿生真皮层中含有成纤维细胞，该皮肤修复材料在使用时能同时对患者受损处的真皮层和表皮层进行修复重建，能促进患者创面的愈合速度。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。实施例1一种具有生物活性的皮肤修复材料为两层结构，由仿表皮层和仿真皮层构成；所述的仿表皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和角质细胞0.01份组成，所述的仿真皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和成纤维细胞0.01份组成。所述的胶原为市售猪源性胶原，DMEM培养基为市售细胞培养用培养基。所述的角质细胞和成纤维细胞是从人体皮肤获得，并用体积份数为10%的牛血清蛋白的DMEM培养基进行培养。实施例2一种具有生物活性的皮肤修复材料为两层结构，由仿表皮层和仿真皮层构成；所述的仿表皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和角质细胞0.02份组成，所述的仿真皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和成纤维细胞0.02份组成。所述的胶原为市售猪源性胶原，DMEM培养基为市售细胞培养用培养基。所述的角质细胞和成纤维细胞是从人体皮肤获得，并用体积份数为10%的牛血清蛋白的DMEM培养基进行培养。实施例3一种具有生物活性的皮肤修复材料为两层结构，由仿表皮层和仿真皮层构成；所述的仿表皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和角质细胞0.03份组成，所述的仿真皮层按重量份数计由胶原10份、DMEM培养基10份和成纤维细胞0.03份组成。所述的胶原为市售猪源性胶原，DMEM培养基为市售细胞培养用培养基。所述的角质细胞和成纤维细胞是从人体皮肤获得，并用体积份数为10%的牛血清蛋白的DMEM培养基进行培养。实施例4实施例1～实施例3任一例具有生物活性的皮肤修复材料，其制备方法的具体步骤如下：（1）仿表皮层材料的制备：按配方量将胶原溶于摩尔浓度为0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成质量浓度为10%（w/v）的胶原溶液；按配方量将DMEM粉末溶于去离子水中，配成质量浓度为4g/L的DMEM培养液；将配置的胶原溶液与配成的DMEM培养液等体积混合，加1mol/L的碳酸氢钠溶液调节混合溶液的pH至中性，然后置于无菌操作台中，在紫外光灯下照射灭菌2~3h，按每毫升混合液1000个细胞的比例加入角质细胞，即得仿表皮层材料；（2）仿真皮层材料的制备：按配方量将胶原溶于摩尔浓度为0.05mol/L的甲酸溶液中，配置成质量浓度为10%（w/v）的胶原溶液；按配方量将DMEM粉末溶于去离子水中，配成质量浓度为4g/L的DMEM培养液；将配置的胶原溶液与配成的DMEM培养液等体积混合，加1mol/L的碳酸氢钠溶液调节混合溶液的pH至中性，然后置于无菌操作台中，在紫外光灯下照射灭菌2~3h，按每毫升混合液1000个细胞的比例加入成纤维细胞，即得仿真皮层材料；（3）仿真皮层的打印：通过计算机辅助软件进行建模，采用气体动力喷射打印，设置打印的起始位置和打印速度，将步骤（2）中制得的仿真皮层材料加入生物三维打印机中，设置打印机接收平台的温度为35~37℃，开始打印，打印完成后，将所得仿真皮层放置于接收平台上不作任何处理；（4）仿表皮层的打印：以步骤（3）中已建好的模型进行打印，采用气体动力喷射打印，打印机的起始位置和打印速度的设置与步骤（3）中的设置相同，将步骤（1）中制得的仿表皮层材料加入生物三维打印机中，设置打印机接收平台的温度为35~37℃，开始打印，将仿表皮层直接打印在仿真皮层上，得到具有生物活性的皮肤修复材料。实施例5对比例：为单独的胶原敷料（参考申请号为CN201510121162.5所公开的无菌胶原贴敷料的制备方法所制得）。实验组：为实施例1～3所得的具有生物活性的皮肤修复材料，采用实施例4的方法制备而成。将上述实施例1～3所制备的具有生物活性的皮肤修复材料与对比例进行伤口修复实验，对比实验组和对比例对创面的修复效果。实验结果如表1所示：表1伤口修复实验结果实施例1实施例2实施例3对比例伤口愈合时间97712愈合情况伤口愈合完整伤口愈合完整伤口愈合完整伤口愈合完整由上表可知，实施例1~3所制备的具有生物活性的皮肤修复材料和对比例均能对伤口创面完整修复，但是与对比例相比，实施例1~3所需的时间明显较短，说明本发明通过生物三维打印技术所制得的具有生物活性的皮肤修复材料具有明显的促进伤口愈合的作用。实施例6实验组：为实施例1～3所得的具有生物活性的皮肤修复材料，采用实施例4的方法制备而成。将上述实施例1～3所制备的具有生物活性的皮肤修复材料进行急性毒性评价、体外溶血评价和皮肤刺激评价等生物安全性进行评价。测试方法：急性毒性评价方法：按GB/T16886.11-2011《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》中的急性毒性检测方法进行检测。体外溶血评价方法：将2mL血液于1000×g离心5min，去除上层清液，加入适量PBS溶液（pH=7.4），缓慢摇匀，将红细胞清洗三次后再以1000×g离心5min，取下层红细胞悬液用PBS溶液配制成16%的红细胞悬浮液。取50μL上述红细胞悬浮液，分别加入1mL蒸馏水、PBS溶液和1mg/mL的样品浸提液溶液中，分别设为阳性对照组、阴性对照组和试验组，轻轻混匀后在37℃下孵育1h，将各组样品于1000×g离心5min，取上清液200μL加入96孔板中，每组3个平行样，在540nm波长下测试其吸光度，重复试验3次。根据测得的吸光度，由公式（1）计算各试验的溶血率（Y）。Y(%)=（A-A0）/(A100-A0)×100皮肤刺激评价方法：按GB/T16886.10-2005《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》中皮内刺激检测方法进行检测。评价结果如表2所示：表2急性毒性评价、体外溶血评价和皮肤刺激评价结果实施例1实施例2实施例3急性毒性评价正常，无症状正常，无症状正常，无症状体外溶血评价2.33%1.25%3.11%皮肤刺激性评价（PⅡ）000从上表结果可知，实施例1~3所制得的具有生物活性的皮肤修复材料均无急性毒性，体外溶血均符合溶血率合格标准，且皮肤刺激性评价中PⅡ均为0，证明本发明通过生物三维打印技术所制备的具有生物活性的皮肤修复材料具有良好的生物安全性。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页1 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