本发明涉及一种曲贝替定纳米乳及其制备方法。
背景技术：
：曲贝替定(海鞘素743，简写ET-743或ET743)是从海生的被囊动物中分离的的四氢异喹啉生物碱，具体结构如下。其抗肿瘤活性主要是通过自身形成亚胺正离子或类似中间体对DNA进行烷基化修饰来实现的(Chem.Rev.2002,102,1669)，ET-743对乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素癌、骨肉瘤和前列腺癌等有抑制活性，是一种新颖的能与DNA结合的抗癌药物。海鞘素-743由西班牙法马马(PharmMar)公司开发，于2007年在欧盟批准上市的作为治疗软组织肉瘤的罕见药，用于治疗传统化疗无效的晚期软组织肉瘤患者。ET-743是一种复杂的化合物，具有有限的水溶性，将调节溶液pH值至4，可以增加ET-743在水中溶解度。但是，ET-743在生物相容的形式和制剂中的稳定性，是难以预测和实现的。因此，制备一种稳定、有效的ET-743制剂对于本领域的技术人员是一种挑战。曲贝替定中主要的杂质为ET-743、ET-745、ET-759B及ET-789A(SynthesisofNaturalEcteinascidins(ET-729,ET-745,ET-759B,ET-736,ET-637,ET-594)fromCyanosafracinB，JournalofOrganicChemistry200368(23)第8859-8866页)，其中杂质ET-701为制剂冻干过程和储藏中主要杂质，为水解产物；杂质ET-745为曲贝替定被还原产物，其结构分别如下：WO0069441公开了一种无菌的冻干制剂，含有ET-743、甘露醇和磷酸盐缓冲剂。该冻干制剂可以重构和稀释用于静脉注射。然而，该制剂在冰箱和室温下长期贮存不稳定，必须避光保存于-15至-25℃。CN102018714A公开了一种冻干的ET-743组合物，主要含有ET-743及二糖，其中二糖选自乳糖、海藻糖、蔗糖、和它们的混合物。该发明通过加入二糖来减少冻干过程中杂质ET-701的产生从而达到提供一种ET-743的稳定的剂型的目的。但是在实际应用过程中有的患者对乳糖耐受，且该发明并没有提供新的方法来解决ET-743在水中溶解性差及性质不稳定的问题。此外，这些制剂在40℃/70％RH的加速条件下储藏3个月时仍然显示出大量的活性成分降解，暗示该制剂如果长期储存，仍然不太稳定。需要提供一种的组合物，来解决现有制剂跟制备方法不能达到或者不能完全解决的问题，包括曲贝替定的稳定性及溶解性，曲贝替定制剂的实施方案应该优选显示有利的冷冻干燥特性。纳米乳又称微乳，是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂等自发形成粒径为1～100nm的透明或半透明均一分散体系。纳米乳具有多种其它制剂不可比拟的优点：1)纳米乳为各向同性的透明液体，属于热力学稳定系统；2)纳米乳具有脂溶性的内核，可以包载疏水性药物，提高药物的溶解度，减少药物在体内的酶解，也可以提高药物在贮存过程中的稳定性；3)可以提高胃肠道对药物的吸收，从而提高药物的生物利用度。因此，纳米乳作为一种新型的药物载体而受到了广泛的研究。技术实现要素：本发明的目的是为提供一种曲贝替定的纳米乳及该纳米乳的制备方法。本发明同时提供了含有曲贝替定纳米乳的组合物，该组合物可以为乳剂形式也可以为冻干制剂形式。采用纳米乳技术提高了曲贝替定的溶解性，同时由于脂溶性的内核包裹药物，减少了曲贝替定与水跟空气的接触，提高了其在制剂过程及成药后贮存的稳定性。为实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供了一种曲贝替定的纳米乳，包含增溶剂和乳化剂。本发明提供的曲贝替定的纳米乳中增溶剂选自天然油脂、合成油脂的一种或几种。本发明提供的曲贝替定的纳米乳中乳化剂可以选自15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯、吐温80，泊洛沙姆188，卵磷脂，油酸钠，司盘20，吐温20，聚氧乙烯单硬脂酸酯，聚氧乙烯硬脂酸酯，聚氧乙烯40硬脂酸酯，聚氧乙烯400单月桂酸酯，聚氧乙烯400单硬脂酸酯，聚氧乙烯400单油酸酯，聚氧乙烯月桂醇醚，聚氧乙烯十六醇醚，聚氧乙烯氢化蓖麻油，聚氧乙烯烷基酚，聚氧乙烯脂肪醇醚，聚氧乙烯壬烷基酚醚，聚氧乙烯辛基苯基醚，聚氧乙烯月桂醇醚，优选15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯、卵磷脂、泊洛沙姆188、吐温20和吐温80，更优选15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯和卵磷脂。本发明提供的曲贝替定的纳米乳中，曲贝替定与增溶剂的质量比1:10000～1:1，优选1:1000～1:10，更优选1:500～1:100。本发明提供的曲贝替定的纳米乳中，增溶剂与乳化剂的质量比选自1:0.02～1:100，优选1:0.1～1:20，更优选1:1～1:10。本发明的曲贝替定的纳米乳中使用天然油脂时，所述天然油脂可选自用大豆油、霍霍巴油、橄榄油、甜杏仁油、椰子油、蓖麻油、葵花籽油、鱼油，优选选自大豆油、椰子油、橄榄油和鱼油。当使用合成油脂时，所述合成油脂可选自中链甘油酸酯、棕榈酸异辛酯、棕榈酸异辛酯、棕榈酸异丙酯，优选中链甘油酸酯。本发明提供的曲贝替定的纳米乳中的增溶剂优选天然油脂和合成油脂组合，例如注射用大豆油/中链甘油酸酯、橄榄油/中链甘油酸酯，椰子油/中链甘油酸酯，鱼油/中链甘油酸酯等。在优选的实施方案中，所述天然油脂与合成油脂的比例为1:100～1:0.02，优选1:20～1:0.2，更优选1:10～1:1。本发明的曲贝替定的纳米乳中增溶剂与乳化剂可以选自如下组合：大豆油/中链甘油酸酯/15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯,橄榄油/中链甘油酸酯/卵磷脂E80，椰子油/中链甘油酸酯/泊洛沙姆188，鱼油/中链甘油酸酯/吐温80。本发明的曲贝替定的纳米乳的粒径为10～100nm，优选10～50nm，更优选20～50nm，最优选20～40nm。本发明的纳米乳可由以下方法制备得到：1)取乳化剂和增溶剂，成油相；2)将水和油相混合，形成胶束；3)向胶束中加入曲贝替定，得到初乳；4)向初乳中加入适量水。本发明公开的曲贝替定的纳米乳可以形成组合物，该组合物还包含缓冲剂、渗透压调节剂及另外一种赋形剂。本发明公开的组合物中的另外一种赋形剂可以选自甘露醇、蔗糖、山梨醇、葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、右旋糖酐、羟乙基淀粉、羟丙基-β环糊精等，优选甘露醇和蔗糖。赋形剂的含量选自0.01％～50％(w/v)，优选0.1％～20％(w/v)，更优选1％～10％(w/v)。本发明公开的组合物中的缓冲剂可以选自磷酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、甘氨酸/盐酸缓冲剂、邻苯二甲酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂，优选磷酸盐缓冲剂。缓冲盐的含量选自0.01％～2％(w/v)，优选0.05％～1％(w/v)，更优选0.1％～0.5％(w/v)。本发明公开的组合物中曲贝替定的浓度选自0.001mg/mL～10mg/mL，优选0.01mg/mL～0.61mg/mL，更优选0.1mg/mL～0.4mg/mL。本发明公开的曲贝替定的组合物中增溶剂的含量选自0.1％～50％(w/v)，优选0.2％～20％(w/v)，更优选0.5％～5％(w/v)。本发明公开的曲贝替定的组合物中乳化剂的含量选自0.01％～50％(w/v)，优选0.1％～20％(w/v)，更优选1％～10％(w/v)。本发明公开的组合物中的渗透压调节剂可以选自氯化钠、葡萄糖、山梨醇、甘油、PEG、丙二醇，优选氯化钠。渗透压调节剂的含量选自0.2％～2％(w/v)，优选0.4％～1％(w/v)，更优选0.5％～0.8％(w/v)。本发明公开的组合物中的pH范围选自6～9，优选6～8，更优选7～8。本发明公开的曲贝替定的组合物可以制成冻干制剂，该冻干制剂具有较好的复溶性，复溶后的纳米乳的粒径范围为10～100nm，优选10～50nm，更优选20～50nm，最优选20～40nm。本发明公开了上述曲贝替定纳米冻干物的制备方法，其步骤如下：1)取乳化剂和增溶剂，加热至50℃～60℃，搅拌混合均匀,取注射用水冷却至40～45℃备用；2)取约总体积15％的40～45℃注射用水，加入到油相中，搅拌至胶束形成；3)取一定量的曲贝替定，用少量水润湿后加入到胶束溶液中，40～45℃条件下搅拌20min～60min形成初乳；4)向上述溶液中加入注射用水至总重的90％，同时加入渗透压调节剂和缓冲剂，搅拌使之溶解，并混合均匀。调节溶液pH值为7～8。5)采用0.22μmPVDF微孔滤膜过滤除菌。6)灌装半加塞，冷冻干燥。本发明公开了曲贝替定纳米乳冻干制剂的冻干工艺，包括预冻、一次干燥、二次升华三个阶段。预冻温度为-25～-50℃，一次干燥温度-10～-40℃，二次干燥温度15～30℃，一次干燥和二次干燥过程中，真空度为0.1-0.5mbar。整个冷冻干燥过程中充入氮气，优选在冷冻干燥结束前5-10分钟充入氮气。本发明公开的曲贝替定纳米乳冻干制剂为白色饼状，具有良好的稳定性，且复溶性较好，解决了曲贝替定水溶性和稳定性差的缺陷，有利于其在临床治疗中的应用。本发明中的曲贝替定及其杂质可以是半合成的或合成的来源，包括这些来源的组合，参考文献如WO0069862和WO0187895；另一方面，曲贝替定的杂质也可以外购获得对照品或根据高效液相方法定位曲贝替定杂质的种类。具体实施方式实施例1以注射用大豆油和中链甘油酸酯为增溶剂，以15-羟基硬脂酸-聚乙二醇酯为乳化剂，磷酸氢二钠为pH缓冲剂，氯化钠为渗透压调节剂制备曲贝替定纳米乳，并以甘露醇为另外的赋形剂，制备其冻干制剂，处方组成及用量如下：制备方法：1、将15-羟基硬脂酸-聚乙二醇酯，中链甘油脂和大豆油加入7mL西林瓶中，加热至60±5℃，以一定的搅拌速度搅拌直至混合均匀。2、取10mL注射用水置于烧杯2，冷却至45℃备用。3、取约2.4mL(15％)的冷却的注射用水倾入到西林瓶1中，在400rpm的速度下搅拌10min直至胶束形成，维持45℃。4、取2mg曲贝替定粉末，置于7mL西林瓶中，加入160μL45℃注射用水润湿API，并加入到烧杯1中，再加160μL注射用水至上述西林瓶1中，荡洗烧杯2次，搅拌15min。5、取12mL室温的注射用水，加入到烧杯1中，混合均匀，加入氯化钠和无水磷酸氢二钠至完全溶解。采用1N氢氧化钠调节pH值至7.5±0.5。6、取0.8g甘露醇加入到上述纳米乳中。7、采用0.22μmPVDF膜过滤上述纳米乳溶液，灌装半加塞后冷冻干燥。考察曲贝替定纳米乳的粒径及其冻干制剂的外观、水分、复溶后粒径、pH值(如表1所示)，并检测冻干后杂质含量变化及在25℃加速条件下的放置稳定性(如表2所示)。表1纳米乳及其冻干制剂的性质外观水分pH值冻干前粒径复溶后粒径白色饼状0.624％7.4129.07nm29.06nm表2杂质含量检测及放置稳定性结论：曲贝替定纳米乳冻干制剂，外观、水分合格，pH值和复溶性后粒径变化不大，冻干制剂杂质检测结果符合限度要求；曲贝替定纳米乳冻干制剂放置稳定性良好，说明纳米乳可以提高曲贝替定在冻干过程及长期放置过程中的稳定性。实施例2以注射用橄榄油和中链甘油酸酯为增溶剂，以卵磷脂为乳化剂，磷酸氢二钠为缓冲剂，氯化钠为渗透压调节剂制备曲贝替定纳米乳，并以蔗糖为冻干保护剂，制备其冻干制剂，处方组成及用量如下：制备方法：1、将卵磷脂E80，中链甘油脂和橄榄油加入7mL西林瓶中，加热至60±5℃，以一定的搅拌速度搅拌直至混合均匀。2、取10mL注射用水置于烧杯2，冷却至45℃备用。3、取约2.4mL(15％)的冷却的注射用水倾入到西林瓶1中，在400rpm的速度下搅拌10min直至胶束形成，维持45℃。4、取2mg曲贝替定粉末，置于7mL西林瓶中，加入160μL45℃注射用水润湿API，并加入到烧杯1中，再加160μL注射用水至上述西林瓶1中，荡洗烧杯2次，搅拌15min。5、取12mL室温的注射用水，加入到烧杯1中，混合均匀，加入氯化钠和无水磷酸氢二钠至完全溶解。采用1N氢氧化钠调节pH值至7.5±0.5。6、取0.8g蔗糖加入到上述纳米乳中。7、采用0.22μmPVDF膜过滤上述纳米乳，灌装半加塞后冷冻干燥。考察曲贝替定纳米乳的粒径及其冻干制剂的外观、水分、复溶后粒径、pH值(如表3所示)，并检测冻干后杂质含量变化及在25℃加速条件下的放置稳定性(如表4所示)。表3纳米乳及其冻干制剂的性质外观水分pH值冻干前粒径复溶后粒径白色饼状1.146％7.4028.82nm28.86nm表4杂质含量检测及放置稳定性结论：以卵磷脂为乳化剂制备得到的曲贝替定纳米乳冻干制剂，外观、水分合格，pH值和复溶性后粒径变化不大，冻干制制剂杂质检测结果符合限度要求；曲贝替定纳米乳冻干制剂放置稳定性良好，说明纳米乳可以提高曲贝替定在冻干过程及长期放置过程中的稳定性。实施例3以椰子油和中链甘油酸酯为增溶剂，以泊洛沙姆188为乳化剂，磷酸氢二钠为缓冲剂，氯化钠为渗透压调节剂制备曲贝替定纳米乳，并以蔗糖为另外的赋形剂，制备其冻干制剂，处方组成及用量如下：制备方法：1、将泊洛沙姆188，中链甘油脂和椰子油加入7mL西林瓶中，加热至60±5℃，以一定的搅拌速度搅拌直至混合均匀。2、取10mL注射用水置于烧杯2，冷却至45℃备用。3、取约2.4mL(15％)的冷却的注射用水倾入到西林瓶1中，在400rpm的速度下搅拌10min直至胶束形成，维持45℃。4、取2mg曲贝替定粉末，置于7mL西林瓶中，加入160μL45℃注射用水润湿API，并加入到烧杯1中，再加160μL注射用水至上述西林瓶1中，荡洗烧杯2次，搅拌15min。5、取12mL室温的注射用水，加入到烧杯1中，混合均匀，加入氯化钠和无水磷酸氢二钠至完全溶解。采用1N氢氧化钠调节pH值至7.5±0.5。6、取0.8g蔗糖加入到上述纳米乳注射液中。7、采用0.22μmPVDF膜过滤上述纳米乳溶液，灌装半加塞后冷冻干燥。考察曲贝替定纳米乳的粒径及其冻干制剂的外观、水分、复溶后粒径、pH值(如表5所示)，并检测冻干后杂质含量变化及在25℃加速条件下的放置稳定性(如表6所示)。表5纳米乳及其冻干制剂的性质外观水分pH值冻干前粒径复溶后粒径白色饼状1.062％7.3928.94nm28.95nm表6杂质含量检测及放置稳定性结论：以泊洛沙姆188为乳化剂制备得到的曲贝替定纳米乳冻干制剂，外观、水分合格，pH值和复溶性后粒径变化不大，冻干制剂杂质检测结果符合限度要求；曲贝替定纳米乳冻干制剂放置稳定性良好，说明纳米乳可以提高曲贝替定在冻干过程及长期放置过程中的稳定性。实施例4以注射用鱼油和中链甘油酸酯为增溶剂，以吐温80为乳化剂，磷酸氢二钠为pH缓冲剂，氯化钠为渗透压调节剂制备曲贝替定纳米乳，并以海藻糖为冻干保护剂，制备其冻干制剂，处方组成及用量如下：制备方法：1、将吐温80，中链甘油脂和鱼油加入7mL西林瓶中，加热至60±5℃，以一定的搅拌速度搅拌直至混合均匀。2、取10mL注射用水置于烧杯2，冷却至45℃备用。3、取约2.4mL(15％)的冷却的注射用水倾入到西林瓶1中，在400rpm的速度下搅拌10min直至胶束形成，维持45℃。4、取4mg曲贝替定粉末，置于7mL西林瓶中，加入160μL45℃注射用水润湿API，并加入到烧杯1中，再加160μL注射用水至上述西林瓶1中，荡洗烧杯2次，搅拌15min。5、取12mL室温的注射用水，加入到烧杯1中，混合均匀，加入氯化钠和无水磷酸氢二钠至完全溶解。采用1N氢氧化钠调节pH值至7.5±0.5。6、取0.8g海藻糖加入到上述纳米乳中。7、采用0.22μmPVDF膜过滤上述纳米乳溶液，灌装半加塞后冷冻干燥。考察曲贝替定纳米乳的粒径及其冻干制剂的外观、水分、复溶后粒径、pH值(如表7所示)，并检测冻干后杂质含量变化及在25℃加速条件下的放置稳定性(如表8所示)。表7纳米乳及其冻干制剂的性质外观水分pH值冻干前粒径复溶后粒径白色饼状0.0742％7.4128.34nm28.37nm表8杂质含量检测及放置稳定性结论：以吐温80为乳化剂制备得到的曲贝替定纳米乳冻干制剂，外观、水分合格，pH值和复溶性后粒径变化不大，冻干制剂杂质检测结果符合限度要求；曲贝替定纳米乳冻干制剂放置稳定性良好，说明纳米乳可以提高曲贝替定在冻干过程及长期放置过程中的稳定性。当前第1页1 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