一种羧甲基壳聚糖pH敏感性水凝胶药物载体的制备方法与流程

本发明属于药剂学领域，涉及到一种羧甲基壳聚糖pH敏感性水凝胶药物载体的制备方法，这种载体具有pH敏感性，良好的生物相容性、药物负载和释放行为和结构稳定性。

背景技术：

近年来，药物控制释放技术得到越来越多的研究，而且药物载体在在制药市场所占的份额越来越大。于是药物释放体系的改进对提高药物利用率，减少病人的给药次数，降低副作用有着重要意义。随着生物技术的发展，越来越多的药品在药物载体的保护下，起到的疗效更好。尤其是具有pH敏感性的药物载体，可以实现在特定部位的释放，从而更好的治疗疾病。例如一些活性高分子药物如蛋白质、多肽药物以及核酸类药物和不溶性药物如一些抗癌药。另一方面，人们的专利意识越来越强，导致很多的药物在失去专利保护的同时，制药公司也在积极的为延长药物专利寻求新途径，药物释放技术就是其中之一。

药物控制释放载体有多种，包括胶束、纳米粒子、水凝胶、脂质体等。水凝胶以其独特的性能广泛用于药物释放制剂和组织工程。水凝胶是一种三维网状结构，可以吸取大量的水或者组织液，仍然保持原有的结构，具有优良的相容性、亲水性和力学性能，类似于软组织。水凝胶作为药物载体，内部的多孔结构可以通过渗透达到药物释放的目的。而具有pH敏感性的水凝胶一方面可以根据环境智能地释放药物，同时提高了肿瘤局部的药物浓度以及作用时间，降低了化疗药物的全身毒性。

Chen等在碱性环境下利用戊二醛交联羧甲基壳聚糖形成智能水凝胶，并且负载牛血清蛋白（BSA），在pH值为1.2和7.4的模拟环境下进行缓释效果研究，表明了pH为7.4时的缓释率较大。Zhu等利用EDC和NHS体系交联羧甲基壳聚糖形成水凝胶，并包埋牛血清蛋白研究释放行为，结果表明，BSA释放存在明显的突释现象。传统的水凝胶交联剂存在较大毒性，抑制细胞的增殖生长，同时由于凝胶结构简单，仅仅依靠羧甲基壳聚糖本身的两亲性控制药物释放往往达不到预期的效果，这些缺点大大限制了智能水凝胶药物载体的应用，寻找生物相容性好，能提高水凝胶pH敏感性的交联剂成为构建智能水凝胶药物载体的关键。含有原酸酯键的化合物是一类合成材料，由于其具有pH敏感性以及良好的生物相容性和生物可降解性，被广泛应用于药物缓释等领域。在本发明中，以新型的含有原酸酯键的交联剂（OEDe），并在水溶液中交联羧甲基壳聚糖（CMCS），制备具有pH敏感性的交联水凝胶。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种方法来制备具有pH敏感性的水凝胶药物载体。其方法思路：将具有pH敏感性的原酸酯键和两端带环氧环的单体和羧甲基壳聚糖中的氨基进行开环交联形成水凝胶。冷冻干燥样品，再通过溶胀吸附制作载药体系。

对上述的制备方法进一步阐述如下。

将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，再将交联剂（OEDe）按一定的投料比加入到羧甲基壳聚糖水溶液中，磁力搅拌混匀后，在60℃-70℃反应0.5h-6h,然后冷冻干燥，将药物溶于水中，加入冻干物混合溶胀或者冻干物和药物混合，然后加水混溶制备水凝胶药物缓释体系。

本发明中，所用的羧甲基壳聚糖分子量分布广泛，取代度≥80%，氨基含量占1.45%。其水溶液浓度10mg/ml-20mg/ml。依次，并不局限于羧甲基壳聚糖，含有一定量的氨基的多糖类，也在其范围类。

本发明中，所用的交联剂是五元环的新型原酸酯单体，两端具有环氧环，按环氧环和羧甲基壳聚糖中的氨基不同摩尔比分别进行投料，且水凝胶强度取决于交联剂的投料比例。

本发明中，是用具有pH敏感性的交联剂，于是水凝胶在酸性条件下降解速度快，而且释药速度也相对较快，可以作为特定部位的释药载体。

本发明的水凝胶成胶速度快，而且结构疏松，耐高温高压，而且生物相容性好。

本发明中，所述的水凝胶，可以作为贴附型和植入药物释放载体。

本发明中，所述的水凝胶应用，可以作为创口辅料，也可以作为组织工程细胞载体。

本发明中，所述的水凝胶应用，残留的氨基可以促进血液凝固而且结构疏松，羧甲基壳聚糖具有一定的抗菌作用，从而可以用于伤口包扎，也可以配合药物使用。

附图说明

图1是实施例1中交联剂（OEDe）的¹HNMR和¹³CNMR。

图2 是实施例2中的水凝胶的倒置图。

图3 是实施例3中3种投料比的水凝胶冻干样品的DSC，在其分解温度前只有一个吸热峰，是其结晶峰，在220℃前未分解。

图4 是实施例4中3种投料比的水凝胶冻干样品的TG。

图5 是实施例5中3种投料比的水凝胶冻干样品、OEDe和CMCS的FT-IR。

图6 是实施例6中3种投料比的水凝胶冻干样品的SEM。

图7 是实施例7中水凝胶冻干样品的溶胀曲线，分别在pH5.0和pH7.4的磷酸盐缓冲液中测定hydrogel-2的溶胀率。

图8 是实施例8中3种水凝胶的流变性能曲线图。

图9 是实施例9中3种水凝胶冻干样品的不同pH降解曲线，分别在pH7.4和pH5.0的磷酸盐缓冲液中测定的hydrogel-2的降解速度；

图10 是实施例10中水凝胶冻干样品的药物释放曲线，分别在pH7.4和pH5.0的磷酸盐缓冲溶液中做hydrogel-2的DOX·HCl的释放；

图11 是实施例11中水凝胶降解液的细胞毒性试验结果。

图12 是实施例12中水凝胶与细胞共培养的定性试验结果，其中A为CMCS对照组，B为hydrogel-1组，C为hydrogel-2组，D为hydrogel-3组细胞共培养。

具体实施方案

实施例1

交联剂（OEDe）的制备：

通过3步反应制得：第一步，向500mL的三口烧瓶中依次加入二甘油10.94g（0.066mol），55.89g(0.53mol)的原甲酸三甲酯和一定量的乙腈，常温下通氮气搅拌反应过夜，通过萃取、浓缩、无水硫酸镁干燥、油泵负压干燥得到14.1g的4,4’-二亚甲氧基-二-（2-甲氧基-1，3-二氧戊烷）产物，产率为85.6%；第二步，向250mL的反应瓶中依次加入第一步的产物14.1g(0.056mol),二乙二醇醚59.79g(0.56mol),在130℃的负压下搅拌反应，经过萃取8h、浓缩、无水硫酸镁干燥、油泵负压干燥得到14.24g的OEDg，产率为63.42%；第三步，向250mL的三口烧瓶中依次投入10.09g（0.025mol）的两端羟基原酸酯单体,14.06g（0.15mol）的环氧氯丙烷和6.08g（0.15mol）的氢氧化钠,在40℃下通氮气搅拌反应4h后，抽虑、无水硫酸镁干燥、浓缩、油泵负压干燥得到两端环氧的原酸酯单体（OEDe）8.4g,产率为64.94%。¹H NMR (400MHz,CDCl₃,δ,ppm):2.54-2.60 (m,2H,CH-O), 2.72-2.80 (m, 2H,CH₂-O), 3.07-3.16(m,2H,CH₂-O), 3.38-3.79（m, 24H, CH₂-O-CH₂)，4.05-4.20（m, 4H, CH₂-O), 4.25-4.55 (m, 2H，CH-O), 5.78-5.90 (d,2H, C H-(O)₃)；¹³C NMR (100MHz, CDCl_3,δ):44.227,50.884,63.844,65.919,70.308,70.351,70.694,72.097,77.362,115.603(图1)。

实施例2

在20ml的样品瓶中加入60mg的羧甲基壳聚糖（CMCS），再加入3ml的去离子水，pH在11左右，磁力搅拌10-20min,直到CMCS完全溶解。然后向其中分别加入13.125g、26.25g和52.5mg的交联剂，磁力搅拌5-10min，使溶液混匀呈均相并在60-70℃反应0.5h-6h。待成胶后，将其冷冻干燥24h，得到冻干样品。

实施例3

水凝胶的差示扫描热量法（DSC）

称取一定量的冻干样品，在Q2000的仪器上进行DSC测试。放置于铝制无盖深坩埚中，N2流量50ml/min，扫描温度范围30-220℃，升温速率10℃/min。

实施例4

热重分析（TG）

分别称取3种不同比例的冻干样品，在STA449F3的仪器上进行TG测试。N2流量50ml/min，扫描温度范围40-800℃，升温速率10℃/min。

实施例5

傅立叶变换红外光谱（FT-IR）

分别称取一定量的3种不同比例投料的冻干样品进行红外检测，红外（IR）测试采用Bruker公司傅立叶红外光谱仪，扫描范围4000-400cm-1,KBr压片。

实施例6

扫描电镜测试（SEM）

取3种不同的水凝胶冻干样品，在冷场发射式扫描电镜S-4800的样品板上,在真空环境下进行表面喷铂处理，然后将样品板固定于电镜样品台上，观察并拍摄水凝胶的立体表面结构。

实施例7

水凝胶的溶胀率测试

称取一定量的冻干物，分别浸泡于pH5.0和pH7.4的缓冲溶液中，每隔一段时间取出，将其表面液体擦干，称量其质量，取三次的平均值。共记录120h,并且取出最后的水凝胶进行冻干，进行扫描电镜测试和红外测试，其溶胀率计算公式如下：

Ds=(Mt-M0)/M0 Ⅱ

公式中Ds（Degree of swelling）为溶胀率，Mt为冻干水凝胶浸泡一段时间后取出擦干表面液体的平均质量，M0为冻干水凝胶的原始质量。

实施例8

水凝胶的流变性能测试

按3种不同投料比制得的水凝胶的流变性能测试是在Gemini HR nano的动态流变仪上进行的，所用的样品测试锥板（直径2cm,顶角2度，间隙70微米）先在固定应变下确定其粘弹区域，再分别测定样品的性能。测试出样品的储存模量（G’）和损耗模量（G”）。

实施例9

水凝胶的降解实验

称取一定量3种不同投料比的冻干样品置于EP管中，加入 10ml 的pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液(PBS)和pH5.0的磷酸盐缓冲液（PBS），将EP管置于 37℃恒温摇床上，在设定时间取出样品，用2-3层纱布过滤，，冷冻干燥，称量。 降解速率的计算公式如下：

M_r=M_t/M₀×100% Ⅲ

其中 M_r(mass remaining)为质量残留率，M₀为降解前水凝胶冻干物的质量，M_t为降解后水凝胶冻干物的质量。

实施例10

药物释放测试

取10mg/ml的阿霉素水溶液1ml稀释成2ml通过溶胀吸附载入到同等质量的水凝胶里，将其分别浸泡于pH5.0和pH7.4的10ml磷酸盐缓冲液中,在37℃，100rpm条件下振荡，每隔一段时间取出缓冲液，并加入新的缓冲液，然后在酶标仪上检测缓冲液中的阿霉素浓度，然后计算阿霉素的释放量。

实施例11

水凝胶的细胞相容性检测

将人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）加入到96孔板中，保证每孔浓度在4,000个左右，贴壁24h后，去除培养基，加入180μl的新鲜培养基，20μl的水凝胶降解液，共培养24h后，去除培养基，加入180μl的新鲜培养基和20μl MTT（5mg/mL）共培养4h后，去除培养基，加入150μl的DMSO，震荡10min后，在570nm波长下检测，

实施例12

水凝胶和细胞共培养定性检测

将人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）加入到6孔板中，保证每孔细胞数占板的80%-90%以上，贴壁24h后，换新鲜培养基2ml并且加入3种投料比的水凝胶共培养24h,然后在倒置显微镜下观察细胞生长活性与存活数量。