一种防治阿尔茨海默病的药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种防治阿尔茨海默病的药物组合物及其制备方法，属于医药领域。
背景技术：
：阿尔茨海默病是一种在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的中枢神经系统退行性疾病。在1907年由德国医生AloisAlzheimer首次描述。其主要临床表现为进行性认知功能障碍和记忆力衰退，性格和行为改变，意识错乱，思考及判断力丧失，生活自理能力丧失，最终死亡。这种破坏性的大脑退行性疾病剥夺了受害者最具人类特征的品质——记忆、推理、抽象化和语言的能力。国际阿尔茨海默病学会于2005年12月在《柳叶刀》上发表了著名的“德尔非研究共识”，指出：全球有2430万人患痴呆，每年新增痴呆病例460万(每7秒新增1例患者)。患病人数每20年增加1倍，到2040年，全球痴呆病例将达到8110万。阿尔茨海默病的具体发病机制目前尚未完全研究透彻，存在多种假说，包括胆碱能神经元假说、Aβ毒性假说、Tau蛋白假说、胰岛素假说、自由基损伤假说等。然而，阿尔茨海默病是由遗传因素和环境因素共同引发的一种复杂性疾病，单一的假说并不能解释全部发病特征。由于其发病机制的复杂性，目前临床上尚无特效药，仅有为数不多的几种用于缓解症状的药物。因此，亟需开发出对于阿尔茨海默病具有确切疗效的治疗药物。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种防治阿尔茨海默病的药物组合物及其制备方法。本发明提供了一种防治阿尔茨海默病的药物组合物，它是由下述重量配比的原料药制备而成：淫羊藿8～12份、西洋参4.8～7.2份、三七4.8～7.2份、牛樟芝2.4～3.6份、甘草2.4～3.6份。进一步地，它是由下述重量配比的原料药制备而成：淫羊藿10份、西洋参6份、三七6份、牛樟芝3份、甘草3份。进一步地，所述的三七为川三七；所述的甘草为炙甘草。进一步地，它是由各重量配比原料药的原生药粉、水或有机溶剂的提取物，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。进一步地，所述的制剂为口服制剂。进一步地，所述的制剂为散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、汤剂或合剂。本发明提供了一种所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：取各重量配比的原料药，直接打粉，或者加入水或有机溶剂提取，再加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，即得。进一步地，所述的制备方法包括如下步骤：a、制备淫羊藿包合物；b、称取各重量配比的牛樟芝、西洋参和川三七的粉末、炙甘草或其浸膏的粉末以及淫羊藿包合物，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，即得。进一步地，所述淫羊藿包合物的制备方法为：用乙醇溶解淫羊藿浸膏，滴入β-环糊精饱和水溶液中，于60℃搅拌3个小时，15～20℃搅拌1个小时，置于0℃冷却18个小时，抽滤，干燥，即得。本发明提供了所述药物组合物在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病的药物中的用途。本发明提供了所述药物组合物与吡拉西坦在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病的联合用药物中的用途。本发明提供了所述药物组合物在制备增强免疫的药物中的用途。本发明提供了一种防治阿尔茨海默病的颗粒剂，它是由下述重量配比的原辅料制备而成：所述药物组合物的原料药、微晶纤维素16.86份、海藻酸钠1.686份、硬脂酸镁0.1686份。本发明提供了一种防治阿尔茨海默病的颗粒剂，它是由下述重量配比的原辅料制备而成：所述药物组合物的原料药、微晶纤维素21.86份、海藻酸钠2.186份、硬脂酸镁0.2186份、β-环糊精8份。本发明提供了一种防治阿尔茨海默病的联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的所述药物组合物和吡拉西坦，以及药学上可接受的载体；其中，所述药物组合物的原料药与吡拉西坦的重量配比为：(1.5～2)：3。本发明提供了一种防治阿尔茨海默病的药物组合物，其药理依据如下：淫羊藿为小檗科淫羊属植物，现代研究发现其中枢神经系统方面具有广泛的药理作用，包括抗抑郁、改善缺血性脑损伤、抗痴呆、抗衰老等作用。在其主要活性成分为淫羊藿苷(ICA)，ICA可通过抑制tau蛋白磷酸化，提高乙酰胆碱酯酶(AChE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)的活性，降低氧化应激反应；通过小胶质细胞-皮质神经元共培养技术发现，ICA能明显抑制脂多糖(LPS)诱导的神经元退化，从而实现对阿尔茨海默症病理的改善。此外，除抗氧化、抗炎、抗凋亡以外，ICA在神经营养、促进神经再生方面仍然具有良好的作用，因此可以认为，ICA对中枢神经系统疾病如老年痴呆、缺血性中风、抑郁症等方面均具有良好的防治作用。西洋参茎叶总皂苷(PQS)对人体的TB淋巴功能具有增强作用，可提高人体的特异性免疫功能。还可通过诱导血管内皮细胞生长因子和(VEGF)的表达，减少内皮素-1(ET-1)的表达，从而加强脑梗死患者新生血管的形成和侧支循环的建立，改善脑血液供应及脑缺血缺氧，从而达到静心凝神、消除疲劳、增强记忆力等作用，可适用于失眠、烦躁、记忆力衰退及老年痴呆等症状。牛樟芝含有丰富的多糖和萜类化合物，可通过细胞表面糖蛋白与巨噬细胞结合后，激活巨噬细胞，通过其吞噬作用吸收、破坏和清除体内损伤、衰老和死亡的自身细胞及侵入体内的病原微生物，并诱导机体产生一系列的细胞免疫和体液免疫。其丝菌体提取物对由自由基诱导的血管内皮细胞损伤具有很好的修复作用，子实体提取物对诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的表达有抑制作用，表明其在体内具有一定的抗炎活性，此外，多项研究表明，牛樟芝对大鼠肝脏系统的氧化损伤均有良好的保护作用，能提高肝脏抗氧化和清除自由基能力，促进肝细胞再生，从而达到保护肝脏的作用。三七除具有止血的功效外，其中的有效成分三七总皂苷可促进造血细胞增殖，调控与造血细胞增殖和分化相关的基因表达上调，具有良好的补血作用；其还能对抗由垂体后叶素因其的心肌缺血，提高心肌细胞耐缺氧能力及对抗再供氧造成的危害，扩张冠脉，增加冠脉血流量，改善心肌微循环，增加心肌耗氧量，对心血管系统起到保护作用。本发明组合物具有补脾益肾，活血化瘀，醒神益智之功效。主治痴呆之脾肾两虚、瘀阻脑络证。其临床表现：起病突然，以认知功能障碍为主,呈阶段性发展，具有神经功能缺损症状和体征，记忆力减退，判断力降低，失认失算，语言含糊，词不达意，日常生活能力下降，伴头晕目眩，四肢麻木，步履艰难，面白无华、形寒肢冷、口中流涎，耳鸣耳聋，双耳重听，两目无神，齿枯发焦，腰膝酸软，肌肉萎缩，食少纳呆，气短懒言，腹痛喜按，肌肤甲错，舌质淡胖大，苔白，舌下络脉瘀阻或有瘀点瘀斑脉沉细弱，双尺尤甚。本方方解：本证病位主要在脑，与心、肝、脾、肾功能失调密切相关。属本虚标实之候，本虚为脾肾亏虚，标实为瘀血阻于脑络。治以活血化瘀治其标，补虚扶正，充髓养脑治其本。本发明药物组合物中，淫羊藿其性味辛甘温，补肾助阳，温又助血运行，为君药。臣以西洋参味苦甘性凉，补益肺气，养阴生津，安神益智，又可制约淫羊藿和川三七的温燥之性。川三七，味甘苦性温，主入阳明及厥阴经，活血化瘀，兼能止血，有止血不留瘀，化瘀不伤正的特点。瘀久容易化热，故又配伍具辛苦微寒的牛樟芝，清热泄火，并兼以醒神，共为佐药。炙甘草，益气和中并调和诸药，为使药。动物实验及临床研究结果均表明，本发明药物组合物具有显著的防治阿尔茨海默病的作用，能有效改善患者的认知能力，提高患者日常生活自理能力，具有广阔的临床应用前景。进一步地，本发明对所述药物组合物剂型的制备工艺进行了考察，提供了一种口感良好、成型率高、稳定性佳的颗粒剂处方，具有极大的临床应用价值。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为海马组织CA1区HE染色图；图2为各辅料成型率对比图；图3为各辅料休止角对比图；图4为各辅料吸湿性对比图；图5为不同时间沉降面记录图。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。仪器：超纯水机(密理博中国有限公司，型号：Milli-QAdvantage)；电热鼓风干燥器(上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9030)；十万分之一电子天平(mettlertoledo，型号：XS105Du)。以及其他玻璃仪器，筛网等。试药：牛樟芝(台湾)；西洋参(福建同春药业股份有限公司，批号；20150402)；三七粉(安徽德昌药业饮片有限公司，批号：20150205)；淫羊藿提取物(西安天瑞生物技术有限公司，批号：TR20150406)；炙甘草浸膏(宝鸡金森制药有限公司，批号：20150303)；微晶纤维素、可溶性淀粉、乳糖、甘露醇、蔗糖、月桂醇硫酸钠、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、硬脂酸镁；无水乙醇(A.R)，实验用水为超纯水。实施例1本发明药物组合物颗粒剂的制备处方：牛樟芝3g、西洋参6g、川三七6g、淫羊藿浸膏1g(按原生药10g计，淫羊藿浸膏浸膏率为10％)、炙甘草浸膏0.86g(按原生药3g计，炙甘草浸膏浸膏率为28.57％)、微晶纤维素16.86g、海藻酸钠1.686g、硬脂酸镁0.1686g。制备工艺：称取西洋参、川三七、炙甘草浸膏、淫羊藿浸膏及牛樟芝的粉末，加入辅料与之混匀(过80目筛混匀)，滴加80％乙醇做软材，过14目筛湿法制粒，烘箱60℃烘干(烘干2h)。干颗粒过一号筛整粒，再过四号筛筛去细粉，制成颗粒35.55g，即得本发明升百颗粒，分装，密封保存备用。实施例2本发明药物组合物颗粒剂的制备处方：牛樟芝3g、西洋参6g、川三七6g、淫羊藿浸膏1g(按原生药10g计，淫羊藿浸膏浸膏率为10％)、炙甘草浸膏0.86g(按原生药3g计，炙甘草浸膏浸膏率为28.57％)、微晶纤维素21.86g、海藻酸钠2.186g、硬脂酸镁0.2186g、β-环糊精8g。制备工艺：牛樟芝、西洋参、川三七、炙甘草粉碎成细粉；取淫羊藿浸膏1g，加10ml无水乙醇溶解，用滴管缓慢滴入β-环糊精饱和水溶液中，于60℃下搅拌3个小时，15～25℃搅拌1个小时，置于0℃下冷却18个小时，抽滤、干燥得淫羊藿包合物6g。按处方量称取牛樟芝、西洋参、三七、炙甘草细粉及淫羊藿包合物6g，加入微晶纤维素、海藻酸钠、硬脂酸镁，混匀，加入80％乙醇适量，制粒，干燥，制成颗粒46.12g，即得本发明升百颗粒，分装，密封保存备用。以下通过实验例证明本发明的有益效果。以下所述的升百颗粒即根据本发明实施例1制备得到的颗粒剂。实验例1本发明药物组合物对阿尔茨海默病大鼠模型的治疗作用1、阿尔茨海默病大鼠模型的建立将2mgAβ25～35肽段溶于400μl灭菌蒸馏水中，浓度为5μg/μl封口膜封好后，置37℃孵72h，使其变为聚集状态的Aβ。大鼠经10％水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉后，固定于小动物立体定位仪上，剪毛消毒,在头巧中部纵向切口,暴露颅骨，参照《大鼠脑立体定向图谱》，在颅骨相应位置钻孔(前囟后3.6mm，中线右侧2.1mm)。除假手术组大鼠外，在无菌条件下，右侧海马注射Aβ25～35寡聚体(浓度为2μg/μl)，恒速垂直注射到右侧海马内(硬膜下3.96mm)，以0.2μl/min速度持续注射5min，注射后留针5min，再缓慢撤针2min，以确保溶液充分弥散。假手术组按照上面的操作注射等量的生理盐水。皮肤切开处给予少量的青霉素粉剂，然后缝合切口。连续3天抗生素预防感染。2、分组与给药将造模的大鼠随机分为：模型组，假手术组，阳性药组，升百颗粒高、中、低剂量组，每组12只。动物造模后第二天，灌胃给药治疗(升百颗粒高、中、低剂量组分别给予升百颗粒1.31g/(kg·d)、2.63g/(kg·d)、5.26/(kg·d)灌胃；阳性药组给予安理申0.525mg/(kg·d)灌胃；模型组和假手术组给予等剂量生理盐水)。每天给药一次，连续给药14d。3、学习记忆能力测定采用Morris水迷宫测试仪，测定大鼠学习记忆能力。Morris测试系统由圆形水池、可移动平台和自动记录系统三部分组成。自动记录系统包括摄像机、监视器和计算机。水池上方约2m处安装摄像机，并与监视器和计算机相连接。利用计算机软件对大鼠在水池中的全部活动进行全程跟踪，显示整个期间大鼠的活动轨迹。当大鼠爬上平台或设定的时间已到，计算机将停止跟踪并巧录下大鼠的游泳轨迹，包括在水池中游泳的总路程、找到平台所需要时间(逃避潜伏期)、寻找平台所采用的策略以及朝向错误角度等，以此观察大鼠的空间学习记忆能力。参照Morris水迷宫实验方法，测量大鼠学习和记忆能力。所用水迷宫为一直径180cm，高55cm的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，水深30cm，距池壁35cm处放置一高29cm，直径10cm圆台。3.1、隐蔽平台试验监测实验前1天，在没有平台的水池中大鼠自由游泳90s，使其熟悉水迷宫的环境。实验期间保持平台位置不变，让平台中点与池壁之间的距离为35cm。在平台对侧选两个与之等距离的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录大鼠从入水至找到平台的游泳总路程及找到平台所需要的时间(逃避潜伏期)。如果在90s内未不到平台，大鼠的逃避潜伏期记为90s，连续监测5天，每天分上、下午2段，每段训练4次。以每天八次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。结果见表1。表1升百颗粒对AD大鼠Morris水迷宫试验平均逃避潜伏期的影响(n＝8)注：与假手术组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.053.2、空间探索试验在隐蔽平台试验结束24h后，撤除水池中的平台。然后任选一相同的入水点，将大鼠面向池壁放入水中。对大鼠在原平台象限的停留时间进行统计分析，测其在90s内在原平台象限活动时间与总时间比值及跨过原平台相应位置的次数。分上、下午2段，每段训练4次，结果见表2。表2升百颗粒对AD大鼠Morris水迷宫试验空间探索能力的影响(n＝8)注：与假手术组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.054、大鼠海马乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性检测学习记忆能力测定实验结束后，禁食12h以上，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，以1500r/min，离心8min，分离血清。检测时将血清用磷酸盐缓冲液按1:9稀释，严格按照试剂盒说明书进行AChE和ChAT的检测。断头取脑，在冰盘上分离海马组织，用4℃的生理盐水反复冲洗，海马组织称重后转移到匀浆管中，然后加入组织质量g/生理盐水体积ml＝l:9的生理盐水，匀浆，使海马组织充分的研碎、匀浆化，制成浓度为10％的脑组织液，3000r/min，离心10min，提取上清液，严格按照试剂盒说明书进行AChE和ChAT的检测。结果见表3和表4。表3升百颗粒对AD模型大鼠海马组织和血清中AchE含量的影响(n＝8)注：与假手术组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05表4升百颗粒对AD模型大鼠海马组织和血清中ChAT含量的影响(n＝8)注：与假手术组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.055、尼氏染色法检测大鼠海马组织的病理变化实验结束后，经4％多聚甲醛灌流滴注大脑后，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，经石蜡包埋，切片，常规脱蜡，无水乙醇浸泡2h，焦油紫浸泡1h，95％乙醇快速分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，在光学显微镜下观察大脑神经元病理变化。结果如图1所示，假手术组中大鼠海马CA1区锥体细胞核大而圆，核仁明显，细胞排列较致密整齐，锥体细胞可见多层(图1A)。模型组中大鼠海马CA1区锥体细胞稀疏，层次不清楚；有部分细胞缺失；有的细胞旁有空染区，出现核固缩、胞质浓染、胞体变小；出现炎性细胞浸润，胶质细胞有多处增生形成结节(图1B)。药物组中大鼠海马组织CA1区锥体细胞细胞排列尚整齐，层次尚清楚；较少见核固缩现象；未发现炎性细胞浸润(图1C)。综合以上实验结果，升百颗粒对Aβ1-40所致AD模型大鼠的学习记忆功能损伤具有明显的改善作用，并显著性降低海马组织和血清中AchE水平，提升ChAT水平，同时，抑制AD大鼠海马CA1区细胞坏死、脱失造成的数量减少，表明升百颗粒具有显著的防治阿尔茨海默病的作用。实验例240例老年性痴呆患者应用升百颗粒治疗的临床研究阿尔茨海默症(Alzheimerdisease，AD)属于临床常见的神经退行性病症，也是一种最为常见的老年性痴呆症，其临床主要特征为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。本研究目的在于分析探究升百颗粒治疗老年性痴呆患者的情况及临床疗效。1、一般资料本组AD患者40例，其中男22例，女18例，年龄62-81岁，平均年龄72.13±6.53岁，痴呆病程2-6年，平均4.57±1.51年。所有患者均参照参考美国神经病语言障碍卒中研究所针对神经系统疾病制定的诊断标准：①患者自述或家人代述本人有半年以上的记忆力减退史；②患者的认知功能发生明显障碍，且反复测试时不能改正；③在患者的相关症状出现时，情景记忆损害与认知功能障碍相关或独立存在。上述3条症状同时满足可确诊为老年痴呆症。并进行AD、VD及混合性痴呆鉴别诊断。排除良性老年遗忘、老年抑郁症、颅内占位、急性脑外伤以及全身性疾病伴发痴呆。将患者按照1:1的比例随机分为对照组与治疗组，每组20例。其中，对照组中男性患者10例，女性患者10例，平均年龄70.48±5.11岁，轻度痴呆患者6例、中度痴呆患者7例、重度痴呆患者7例。治疗组中男性患者12例，女性患者8例，平均年龄73.78±7.95，轻度痴呆患者5例、中度痴呆患者8例、重度痴呆患者7例。两组患者的一般资料以及病症严重分期方面比较无显著性差异(P＞0.05)，具有可比性。2、治疗方法两组患者均首先给予常规治疗，即给予对照组患者口服吡拉西坦片治疗，1.2g/次，3次/d。治疗组患者在对照组常规治疗的基础上给予升百颗粒治疗，用量10g/次，3次/d。1个月为一个疗程，治疗3个月后评价疗效。吡拉西坦片(山东鲁抗医药有限公司，规格：每片0.4g)临床用量为：2-4片/每次，一日三次，本药物组合物临床用量为：11.85g/袋，一日三袋。活性成分的用量配比：吡拉西坦:本发明药物组合物的原料药＝3:2～3:1.5，安全用量比可订2:1。3、疗效判定在治疗结束后分别记录MMSE(老年认知功能障碍量表)及ADL(日常生活能力量表)，MMSE检测患者的认知功能及痴呆的严重程度，ADL检测患者的日常生活自理能力。依照中华全国中医学会制定的老年性痴呆的中医诊断标准及疗效评定标准对患者进行疗效判定。其标准为：显效：治疗后评分增加≥5分，患者主要症状消失，神智清晰，定向健全，回答问题正确，反应灵敏，生活能自理，能进行一般社会活动。有效：治疗后评分增加2-4分，患者主要症状有所减轻或部分消失，回答问题基本正确，但反应迟钝，生活基本能自理，智力与自尊意识仍有部分障碍。无效：治疗后评分增加小于等于1分，主要症状无变化或病情发展，回答问题不够正确，生活不能自理，神智呆傻。同时对两组患者的CDR和GDS量表进行记录并整理分析。CDR量表即老年痴呆评定量表，通过医疗人员与患者及其家属交流，收集信息，对患者的认知功能，记忆力以及生活的基本能力做出判断分析。GDS量表即全面衰退量表，通过对患者及护理者进行访谈，对患者的认知能力做出记录及分析。采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。4、结果对照组与治疗组比较用药3个疗程之后，治疗组总有效率为75％，对照组总有效率为55％，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，两组临床疗效比例：治疗组20例：显效2(10％)、有效13(65％)、无效5(25％)、总有效率75％。对照组20例：显效1(5％)、有效10(50％)、无效9(45％)、总有效率55％。两组患者治疗前后CDR、GDS量表评估结果比较见表5、6：表5两组患者治疗前后CDR量表评估结果比较注：与对照组治疗后比较，*P＜0.05；与本组治疗前比较，#P＜0.05。两组患者治疗前的CDR量表评估结果比较，无显著差异性(P＞0.05)；治疗后的CDR量表评估结果进行比较，治疗组患者的评估结果明显优于对照组患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)。表6两组患者治疗前后GDS量表评估结果比较注：与对照组治疗后比较，*P＜0.05；与本组治疗前比较，#P＜0.05。两组患者治疗前的GDS量表评估结果比较，无显著差异性(P＞0.05)；治疗后的GDS量表评估结果进行比较，治疗组患者的评估结果明显优于对照组患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)。本组资料显示，经过三个疗程治疗后治疗组患者MMSE和ADL评分明显高于对照组，治疗组组患者的总有效率明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。通过CDR以及GDS量表评估法对两组患者治疗后的疗效进行记录比较。治疗后的CDR量表评估结果进行比较，治疗组患者的评估结果明显优于对照组患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明治疗组患者接受治疗后的痴呆症状即生活自理能力要明显优于对照组；治疗后的GDS量表评估结果进行比较，治疗组患者的评估结果优于对照组患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，证实治疗组患者在治疗后的认知功能高于对照组。说明升百颗粒治疗老年性痴呆有较好的疗效，能有效改善患者的认知能力，提高患者日常生活自理能力，值得临床推广。实验例3本发明药物组合物对免疫力低下小鼠模型的治疗作用1、动物分组及给药方法将小鼠随机分为6组：空白组，模型组，阳性药组，升百颗粒高、中、低剂量组，每组12只。各组每天灌胃一次，升百颗粒高、中、低剂量组分别给予升百颗粒1.90g/(kg·d)、3.80g/(kg·d)、7.60/(kg·d)灌胃；阳性药组给予贞芪扶正颗粒1.30g/(kg·d)灌胃；模型组和空白组给予等剂量生理盐水。连续给药14d。于灌胃的第10天开始，模型组，阳性药组，升百颗粒高、中、低剂量组于灌胃后腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，制造免疫力低下模型，空白组注射生理盐水，连续4d。给药方法与时间见下表：表7给药方法及时间2、增强免疫力功效评价目前关于功能食品增强免疫力的功能检测主要从4个方面进行：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性4个方面任2个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能。其中，单核-巨噬细胞功能指标由小鼠碳廓清实验进行评价，其原理为：血液中的单核-巨噬细胞系统具有对进入体内的异物吞噬清除的功能。当碳颗粒以注射的方式进入血液后即迅速被肝、脾等器官中的巨噬细胞吞噬而使其在血浆中的浓度降低，可通过吞噬率来反映单核-巨噬细胞系统的功能。在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系，即吞噬速度与血碳浓度成正比，而与已吞噬的碳粒量成反比。细胞免疫功能指标由脾淋巴细胞转化实验进行评价，其原理为：T细胞在体外收到特异性抗原或非特异性有丝分裂原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化。淋巴细胞转化率的高低可以反应机体的细胞免疫水平。因此可作为测定机体细胞免疫功能的指标之一。体液免疫功能指标由血清溶血素实验进行评价，其原理为：以SRBC为细胞性抗原对小鼠进行免疫。B细胞在抗原刺激下增殖、分化成浆细胞，浆细胞在淋巴结或淋巴组织中经(3-4d)成熟，分泌与SRBC相对应的抗体－－溶血素，并释放到体液中，通过测定溶血素可反映机体的特异性体液免疫功能。NK细胞杀伤活性指标通过测定乳酸脱氢酶(LDH)进行评价，其原理为：正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后细胞膜通透性增加，LDH释放到细胞外。通过使用LDH基质液(含乳酸锂等)在酶联免疫检测仪上比色测定乳酸脱氢酶，可间接反映机体的NK细胞杀伤活性。2.1小鼠碳廓清实验于第14天灌胃2小时后，按小鼠体重5ml/kg尾静脉注射体积比1:4稀释的墨汁，分别于尾静脉注射后2分钟(t2)和10分钟(t1)，用定量毛细管于球后毛细血管丛取血20ul，溶于3ml0.1％NaCO3溶液。同毛细管吹打均匀，置分光光度计在波长680nm下比色，分别测定光密度值(OD)：A1、A2。根据小鼠体重m、肝重m1和脾重m2，按下式计算廓清指数K、吞噬指数α：廓清指数K＝(lgA1-lgA2)/(t2-t1)吞噬指数α＝[m/(m1+m2)]×3√K实验结果见下表：表8升百颗粒对免疫力低下小鼠模型廓清指数的影响(n＝10)注：与空白组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.052.2脾淋巴细胞转化实验2.2.1脾细胞悬液制备于第14天灌胃2小时后，将小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用消毒磨棒轻轻捻碎，制成单个细胞悬液。经200目筛过滤，低渗去除红细胞，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中。2.2.2使用台盼蓝染色计数活细胞数将细胞悬液0.5ml加入试管中。加入0.5ml0.4％台盼蓝染液，染色2-3分钟。吸取少许悬液涂于载破片上，加上盖片。镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力(死细胞能被台盼蓝染色，镜下可见深蓝色细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状)。计数活细胞数应在95％以上。2.2.3调整细胞浓度为2×107/ml将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3分钟。镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只记左侧和上方的。按下式计算：细胞数/ml＝(四大格细胞总数/4)×10000。(镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，按单个细胞计算。)2.2.4淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入96孔培养板中，每孔1ml，一孔加浓度100μg/mlConA50μL(相当于5μg)，另一孔不加ConA作为对照，每份分装3孔作为平行样，置5％CO2，37℃培养72小时。培养结束前4小时，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPM11640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μl/孔，继续培养4小时。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。结果见下表：表9升百颗粒对免疫力低下小鼠模型脾淋巴细胞转化的影响(n＝10)注：与空白组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.052.3血清溶血素测定实验2.3.1动物分组及给药方法将小鼠随机分为6组：空白组，模型组，阳性药组，升百颗粒高、中、低剂量组，每组12只。各组每天灌胃一次，升百颗粒高、中、低剂量组分别给予升百颗粒1.90g/(kg·d)、3.80g/(kg·d)、7.60/(kg·d)灌胃；阳性药组给予贞芪扶正颗粒1.30g/(kg·d)灌胃；模型组和空白组给予等剂量生理盐水。连续给药14d。于灌胃的第10天开始，模型组，阳性药组，升百颗粒高、中、低剂量组于灌胃后腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，制造免疫力低下模型，空白组注射生理盐水，连续4d。于灌胃第9天开始，同时腹腔注射5％(V/V)绵羊红细胞，每只0.2ml，免疫6d。2.3.2半数溶血值(HC50)的测定摘除小鼠眼球取血，放置1h，2000r/min离心10min，分离血清，血清用生理盐水作1:2稀释。制备绵羊红细胞(SRBC)悬液(从健康年轻(约半岁)绵羊颈静脉采血，加入两倍量的Alsever’s血细胞保存液，置4℃保存。实验时取保存的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次2000r/min离心5min，除去其中的纤维蛋白和白细胞、血小板等，以生理盐水配成所需浓度)；制备豚鼠血清(豚鼠心脏抽血，分离血清，将血清加入压积绵羊红细胞(SRBC)中。按豚鼠血清：SRBC＝5:1(V/V)，于4℃冰箱中放置30min，以除去非特异性补体参与的溶血，2000r/min离心10min，吸取上清液，用生理盐水稀释成1:10血清，备用)。实验管中依次加入125μl10％SRBC(V/V)、250μl补体(稀释的豚鼠血清)以及250μl稀释后的血清样品；对照1管依次加入125μl10％SRBC(V/V)、250μl补体(稀释的豚鼠血清)以及250μl生理盐水；对照2管依次加入125μl10％SRBC(V/V)、250μl生理盐水以及250μl稀释后的血清样品。37℃孵育30min后，冰浴终止反应10min，以2000r/min离心10min。取上清250μl加入到96孔培养板中，以酶联免疫检测仪测定波长540nm的吸光度(A)值。用实验管吸收度减去对照管(对照1管和对照2管)吸收度，结果见下表：表10升百颗粒对免疫力低下小鼠模型血清溶血素水平的影响(n＝10)注：与空白组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.052.4乳酸脱氢酶(LDH)测定实验2.4.1脾细胞悬液的制备(效应细胞)无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用消毒磨棒轻轻捻碎，制成单个细胞悬液。经200目筛过滤，低渗去除红细胞，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中。用台盼蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/ml。2.4.2靶细胞的传代实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。2.4.3NK细胞活性检测取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50：1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μl；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h。然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，以酶联免疫检测仪测定波长490nm的吸光度(A)值。NK细胞活性为X，计算公式为：X＝[(Af-An)/(Am-An)]×100式中：Af－－反应孔吸光度An－－自然释放孔吸光度Am－－最大释放孔吸光度结果见下表：表11升百颗粒对免疫力低下小鼠模型NK细胞活性的影响(n＝10)注：与空白组相比*P＜0.05；与模型组相比#P＜0.05综合小鼠碳廓清实验、脾淋巴细胞转化实验、血清溶血素测定实验和乳酸脱氢酶测定实验结果，证明升百颗粒对环磷酰胺所致免疫力低下模型小鼠的单核-吞噬细胞功能、细胞免疫功能、体液免疫功能和NK细胞活性均具有明显的改善作用。实验例4填充剂及其用量对本发明颗粒剂质量的影响发明人前期对润湿剂浓度进行了考察，从制粒难易度及用料成本考虑，以80％乙醇作为润湿剂为最佳。分别选用可溶性淀粉，乳糖，甘露醇，微晶纤维素，糊精，木糖醇作为填充剂，根据实施例1工艺制备颗粒剂，主要从成型率，吸湿性，流动性和性状等方面考察填充剂对颗粒剂质量的影响。4.1成型性检测将制备好的颗粒称重先过一号筛再过五号筛，收集能通过一号筛但不能通过五号筛的颗粒称重。反复测试5批颗粒成型率。结果见图2。成型率＝(过筛后颗粒质量(g)/过筛前颗粒质量(g))×100％由图2可知，参与评价的5种辅料中，微晶纤维素的成型率最高(82.05％)。由此可说明，从成型性方面考虑，微晶纤维素最适宜作为填充剂添加至本发明升百颗粒剂中。4.2休止角检测采用固定漏斗法将3只漏斗串联并固定于水平放置的滤纸上一定的高度(H＝1.5cm)，小心地将颗粒沿漏斗壁倒入最上的漏斗中直到滤纸上形成的颗粒圆锥体尖端接触到漏斗口为止，由滤纸上量出的圆锥底部的直径(2R)，计算出休止角(tga)，每组5次试验，取平均值，见图3。休止角值(tga)＝H/R4.3吸湿性检测取所制颗粒剂3g，置25℃烘箱中恒重48h。将底部放有NaCl饱和溶液的玻璃干燥器中定时放入NaCl直到形成过饱和溶液，此时干燥器内的相对湿度为75％。将颗粒剂平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过3mm，精密称定后置于上述干燥器内(扁称量瓶盖打开)。48h后称量计算吸湿百分率。共做两组计算平均值，见图4。吸湿率＝((吸湿后重量-吸湿前重量)/吸湿前重量)×100％4.4堆密度检测将过筛后的颗粒称取10g(M)放入干燥的量筒(50ml量筒)中轻轻振动读出刻度数(V)mL，每组5次试验，取平均值，见表12：表12堆密度检测4.5性状描述表13性状描述由表13可知，综合归纳各颗粒剂性状描述，结合颗粒均匀度、硬度、制粒过程是否结块，可认为微晶纤维素所制颗粒效果最好。综合考虑上述各项指标，以用量为处方原药量比例1:1的微晶纤维素为填充剂，80％乙醇作为润湿剂进行制粒，所得颗粒剂成型率高，性状好，流动相与吸湿性均良好。实验例5辅料的选用对本发明颗粒剂口感的影响1、甜味剂在实施例1处方的基础上增加甜味剂阿巴斯甜，用量分别为总处方量的0.3％，0.5％，0.7％，经品尝发现其甜味无法遮盖药物的苦味，而是形成一股又苦又甜的味道，口感更为怪异，故最终不予考虑。2、包和材料发明人研究发现，本发明颗粒剂的苦味主要由淫羊藿所致。选用β-环糊精作为包合材料，选取淫羊藿浸膏粉末和β-环糊精的比例为1:4，1:6，1:8，1:10的条件下进行实验。称取β-环糊精8g，使用磁力搅拌器在60℃下加水制成饱和溶液(8g量的β-环糊精在60℃下于100ml水中达到饱和)。精密称取相应比例淫羊藿提取物，加十倍量乙醇溶解后，缓慢滴入60℃的β-环糊精饱和溶液，恒温搅拌3h，之后降温至室温搅拌1h，取出，冷藏12h，抽滤，用少量乙醇洗涤滤饼，之后再用少量水洗涤。于60℃烘箱中干燥4h，既得，称取重量，计算产率(见表14)。表14淫羊藿β-环糊精包合物产率淫羊藿提取物(g)β-环糊精(g)包合物(g)产率(％)286.3463.401.3386.1666.02186.1368.110.885.9267.27最终确定淫羊藿提取物:β-环糊精＝1:8，即：精密称取淫羊藿提取物1g，溶于10ml乙醇后，缓慢滴入60℃的β-环糊精饱和溶液，恒温搅拌3h，之后降温至室温搅拌1h，取出，冷藏12h，抽滤，用少量乙醇洗涤滤饼，之后再用少量水洗涤。于60℃烘箱中干燥4h，平均得6g淫羊藿包和物。在未计算包和率的情况下，将6g产物全部添加至处方中。淫羊藿经包和之后，口感没有先前那么苦，将改良后的处方进行试喝，发现口感较之前好了很多，苦味完全能够接受，说明此方法可行。实验例6辅料的选用对本发明混悬型颗粒剂沉降时间的影响由于升百颗粒剂中的主要成分为西洋参，三七生药直接打粉，不溶于水，故本颗粒的溶解度差，从而导致口感及外观较差。由于粉末量太大，故采用添加助悬剂增加溶液粘稠度的方法延长其沉降时间(制成混悬型颗粒剂)。分别采用了不同用量的羧甲基纤维素钠(4％，5％，6％,)，和海藻酸钠(4％，5％，6％)，同时均加以处方量0.5％的硬脂酸镁增强其助悬性。通过实验测量比较其沉降容积比，来确定不同用量的羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的助悬性的高低。称取6份样品(加入处方量4％、5％和6％的羧甲基纤维素钠分别为1号处方、2号处方和3号处方；加入处方量4％、5％和6％的海藻酸钠分别为4号处方、5号处方和6号处方；以上1-6号处方均再加入处方量0.5％的硬脂酸镁；不添加助悬剂的纯处方药材为7号处方)各5g置入具塞量筒中，加入蒸馏水至50ml刻度，密塞，用力振摇1min，根据下降液面补加蒸馏水至50ml刻度，之后用力振摇1min，静置，记下混悬物的开始高度Ho，之后分别记录静置5min、10min、30min、1h、2h、3h、12h后的沉降面高度H，按下式计算：沉降体积比(F)＝H/Ho经实验比较(见图5)，海藻酸钠的助悬效果优于羧甲基纤维素钠，助悬效果最好的为添加处方量6％的海藻酸钠配以处方量0.5％的硬脂酸镁。但5％的海藻酸钠配以处方量0.5％的硬脂酸镁已能达到助悬要求，综合考虑用料成本及总处方量，最终选择5％的海藻酸钠配以处方量0.5％的硬脂酸镁作为助悬剂。当前第1页1 2 3