miR‑378抑制心肌肥厚和心肌纤维化并诊断心力衰竭的用途的制作方法

本发明涉及一种心肌内源性的非编码小RNA保护心脏的用途，尤其涉及miR-378抑制心肌肥厚和心肌纤维化，并诊断心力衰竭的用途。

背景技术：

心血管疾病是当今人类健康第一杀手，在中国，心血管病患病率处于持续上升阶段。心肌重构是导致心血管疾病发病及死亡率升高的独立危险因素。控制心肌重构的发生发展，是防治心力衰竭发生的关键环节，是预防和治疗心血管疾病的医学与生物学的重要任务之一。

心肌重构是心脏功能从代偿期向失代偿期演变的关键时期，也是心脏结构从可逆向不可逆发展的关键阶段，是心功能受损并发生心力衰竭的病理生理基础。心肌重构通常表现为心肌细胞肥大、细胞外基质胶原沉积和纤维化、心肌细胞的凋亡与坏死，最终的结果是心脏的病理性增大、心肌收缩力下降，心功能失代偿，即心力衰竭。多种心血管疾病包括高血压、心肌梗死、心脏瓣膜疾病等都会导致心肌重构的发生，它是心血管疾病的一种综合性表现。当心脏在损伤因素的刺激下，心肌内源性的保护因子会被激活，发挥抗心肌重构作用。寻找这些保护因子及作用途径，有助于我们发现心脏疾病治疗的有效药物靶点，也有助于我们发现诊断心脏疾病发生的生物标志物。

MicroRNA(简称miRNA)是一种广泛存在于真核生物中，长度约为21nt的内源单链小分子RNA，属于非编码RNA。作为一种基因表达的调控因子，miRNA可以参加很多重要的生理过程，它们疾病中重要作用越来越受到人们的关注。许多研究表明miRNA对于维持心脏正常的生理功能具有重要作用，同时当其表达异常时与很多心脏疾病的发生密切相关。

目前，很多的miRNA作为人类疾病的生物标志物和治疗靶点被相继发现，但在心肌肥厚和心肌纤维化相关疾病中的miRNA发现甚少，其发挥的生物学作用及对心肌病变的诊断价值仍需要科研人员去挖掘，进而研发针对这些靶点的临床药物及诊断试剂，具有潜在的临床应用价值。

目前有关抗心肌重构，包括心肌肥厚、心肌纤维化的心肌内源miRNA研究甚少，而其重要的生物学作用和治疗疾病的靶点有待发掘。miRNA作为生物体的非编码小片段RNA较传统的分子标记物在疾病诊断中具有的优势包括其具灵敏性、发病不同阶段的表达特异性、稳定性、易检测性等特点，是较理想的疾病诊断标志物。然而目前在心力衰竭以及心衰发生不同阶段所开发出来的miRNA分子诊断试剂仍处于起步阶段，所发现的与心衰发生相关的血清miRNA的数量极其有限，发现新的心衰诊断标志物对于心脏疾病的预防和治疗十分重要。

技术实现要素：

有鉴于本技术领域中存在的上述缺陷，本发明提供了一种miRNA在预防或治疗心肌肥厚、心肌纤维化中的应用；其中，所述miRNA具体是指miR-378，其序列为：5’-CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU-3’(SEQ No.1)，本发明提供了miR-378在制备预防或治疗心肌肥厚、心肌纤维化的药物或试剂盒中的用途，并进一步提供了miR-378作为心力衰竭生物标志物的用途。

本发明通过实验发现miR-378在心肌肥厚和肥大的心肌细胞中显著下调。miR-378在心肌组织中高表达，并且在心肌细胞中特异性表达。在动物水平，利用化学修饰的miR-378模拟物和抑制剂通过静脉注射的方式分别干预肥厚刺激的野生C57b/L6小鼠，发现miR-378可以显著抑制心肌肥厚和心肌纤维化，miR-378基因敲除小鼠在肥厚因素刺激下对于野生型小鼠表现出更严重的心肌重构，即加重的肥大表现及纤维化程度；在细胞水平，心肌细胞过表达miR-378能显著抑制心肌细胞肥大，心肌成纤维细胞过表达miR-378能显著抑制细胞的纤维化反应。

进一步，本发明还提供了miR-378模拟物/合成的miR-378核酸序列在制备预防或治疗心肌肥厚、心肌纤维化的药物或试剂盒中的用途，优选地，所述miR-378模拟物/合成的miR-378核酸序列经过化学修饰，如与胆固醇、纳米颗粒、脂质体等修饰连接。

在本发明的一种优选实施方式中，所述miR-378模拟物在反义链3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。

进一步，所述预防或治疗心肌肥厚、心肌纤维化的药物通过静脉或肌肉注射等方式，对心肌肥厚和心肌纤维化等心脏疾病进行治疗。

本发明还提供了与人类心力衰竭发生发展相关的血液miRNA标志物在制备诊断轻度和重度心力衰竭的试剂盒中的应用。我们发现心衰患者血清中miR-378表达水平对比健康对照组显著升高，并且轻度心衰患者(LVEF>45％)的血清中miR-378的表达水平要高于重度心衰患者(LVEF<45％)组。因此，miR-378还可以作为临床诊断心衰发生不同阶段的分子标志物。

进一步，miR-378还可以用于制备诊断心力衰竭发生及疾病发展状态的分子诊断试剂盒。

本发明具有以下有益技术效果：

miR-378通过抑制心肌细胞肥大和心肌纤维化对心脏具有抗心肌重构的保护作用，对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。

血清miRNA是一种新型生物标志物，具有灵敏性、发病不同阶段的表达特异性、稳定性、易检测性等特点，能显著提高疾病诊断的敏感性和特异性。miR-378有助于心力衰竭的辅助诊断，同时由于其在轻度和重度心力衰竭患者血液中的表达差异性，也有助于反映心力衰竭患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

以下将结合附图对本发明的构思、产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1所示为，小鼠使用主动脉缩窄方法(TAC)构建小鼠压力超负荷心肌重构模型，TAC术后连续三天分别通过静脉注射化学修饰的miR-378的模拟物和抑制剂，2周后，心脏超声分别检测假手术组、TAC组、TAC术后注射模拟物组、TAC术后注射抑制剂组的小鼠心功能指标。

图2所示为，2周后假手术组、TAC组、TAC术后注射模拟物组、TAC术后注射抑制剂组对照组及干预组代表性的心脏轮廓照片(标尺：2mm)、心肌组织HE染色(横切面)和胶原染色(蓝色代表胶原沉积)(放大200倍)。

图3所示为，TAC2周后的心重体重比。*代表与假手术组相比较p<0.05；**代表与假手术组相比较p<0.01；##代表与TAC组相比较p<0.01。

图4所示为，TAC2周后小鼠心脏左室横截面免疫组化HE染色，每组取3只小鼠，每只小鼠随机选取10个视野计算心肌细胞横截面积。**代表与假手术组相比较p<0.01；##代表与TAC组相比较p<0.01。

图5所示为，TAC2周后小鼠心脏左室Masson染色，纤维化比例为单切面蓝色部分面积所占切面面积比例。**代表与假手术组相比较p<0.01；#代表与TAC组相比较p<0.05；##代表与TAC组相比较p<0.01。

图6所示为，TAC2周后小鼠左室射血分数。#代表与TAC组相比较p<0.05。

图7所示为，miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠经过假手术及TAC造模，2周后各组小鼠心脏左室Masson染色。

图8所示为，miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠经过假手术及TAC造模，2周后小鼠心脏超声测量左室射血分数。&代表与野生型小鼠TAC造模组相比较p<0.05。

图9所示为，miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠经过假手术及TAC造模，2周后测量各组小鼠的心脏体重比值。*代表与野生型小鼠假手术组相比较p<0.05；**代表与野生型小鼠假手术组相比较p<0.01；##代表与基因敲除假手术组相比较p<0.01。

图10所示为，根据miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠经过假手术及TAC造模2周后心肌组织的Masson染色，纤维化比例为单切面蓝色部分面积所占切面面积比例。**代表与野生型小鼠假手术组相比较p<0.01；##代表与基因敲除假手术组相比较p<0.01；&&代表与野生型小鼠TAC造模组相比较p<0.01。

图11所示为，miR-378在小鼠各主要器官中的表达情况。取成年健康小鼠的肾、脑、胃、心脏、肺、骨骼肌和肝脏组织，分别提取总RNA，Northern blot检测miR-378表达情况，u6为内参。

图12所示为，体外分离原代大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞，提取总RNA，Northern blot检测miR-378表达情况，u6为内参。

图13所示为，心肌细胞分别转染miR-378模拟物、抑制剂及阴性对照物，48小时后分别给予机械牵张24小时刺激或不牵张。细胞免疫荧光检测表面积，红色为α辅肌动蛋白染色表示细胞形态，蓝色为细胞核染色。

图14所示为，各组细胞表面积的比较。**代表与与转染miR-378阴性对照物未受机械牵张刺激组相比较p<0.01；#代表与转染miR-378阴性对照物并给予机械牵张刺激组相比较p<0.05；##代表与转染miR-378阴性对照物并给予机械牵张刺激组相比较p<0.01。

图15所示为，心肌成纤维细胞转染miR-378模拟物及阴性对照物，48小时后分别给予机械牵张24小时刺激或不牵张。实时荧光定量PCR检测心肌成纤维细胞中胶原I基因的表达。**代表与与转染miR-378阴性对照物未受机械牵张刺激组相比较p<0.01；##代表与转染miR-378阴性对照物并给予机械牵张刺激组相比较p<0.01。

图16所示为，心肌成纤维细胞转染miR-378模拟物及阴性对照物，48小时后分别给予机械牵张24小时刺激或不牵张。Western blot检测心肌成纤维细胞中基质金属蛋白酶9的表达，GAPDH为内参。**代表与与转染miR-378阴性对照物未受机械牵张刺激组相比较p<0.01；##代表与转染miR-378阴性对照物并给予机械牵张刺激组相比较p<0.01。

图17所示为，利用绝对定量的实时荧光定量PCR方法检测血清中miR-378的表达情况。根据心衰患者外周血中NT-proBNP的表达情况将心衰组分为两组，NT-proBNP<2000(n＝12)组及NT-proBNP>2000(n＝15)组。*代表与健康对照组相比较p<0.05；**代表与健康对照组相比较p<0.01；##代表与NT-proBNP<2000心衰组相比较p<0.01。

图18所示为，心衰患者的左室射血分数与其血清中miR-378表达量的关系。根据心衰患者血清中miR-378的表达情况将心衰组分为两组，miR-378大于200个拷贝(n＝11)组及miR-378小于200个拷贝(n＝16)组。**代表与健康对照组相比较p<0.01；##代表与miR-378大于200个拷贝心衰组相比较p<0.01。

具体实施方式

实施例1miR-378能够抑制压力超负荷引起的心肌重构

8周到10周的C57B/L6小鼠使用主动脉缩窄方法(TAC)构建小鼠压力超负荷心肌重构模型，TAC术后连续三天分别通过静脉注射化学修饰的miR-378的模拟物和抑制剂(80mg/kg)。

具体地，每组8-10只，模拟物序列是5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’(反义链)5’-UUCUGACUCCAAGUCCAGUUU-3’(SEQ No.2)，模拟物在反义链进行修饰，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。miR-378抑制剂序列是5’-CCUUCUGACUCCAAGUCCAGU-3’(SEQ No.3)，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。miR-378模拟物和抑制剂购于上海吉玛制药技术有限公司。

2周后，心脏超声检测显示心功能指标包括舒张期左室后壁厚度、左室舒张期内径、射血分数，以及心重体重比；免疫组化进行HE染色和胶原染色。结果显示，注射miR-378模拟物能够显著抑制压力超负荷(TAC)引起的心肌肥厚和心肌细胞肥大(见图1-4)，抑制心肌胶原沉积(见图2、图5)，而注射miR-378抑制剂会加重压力超负荷引起的心肌肥厚和心肌纤维化(见图1-5)，同时射血分数所反映的心功能下降(见图6)。证明了miR-378对心脏的保护作用。

实施例2miR-378基因敲除小鼠的制得

构建sgRNA载体，使用工具载体pUC57-sgRNA(51132；Addgene,Cambridge,MA)，合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BsaI线性化的载体上，目标靶点位置序列为5’-GGCTCAGAGCTGAGCGGGAATGG-3’(SEQ No.4)，合成的gRNA单链分别是：M-mir378-be-gR-top:TAGGCTCAGAGCTGAGCGGGAA(SEQ No.5)和M-mir378-be-gR-dow:AAACTTCCCGCTCAGCTCTGAG(SEQ No.6)。构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

构建CAS9载体，CAS9表达质粒使用pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(44758,Addgene)，PmeI线性化后使用T7Ultra kit(AM1345；Thermo Scientific,Waltham,MA)体外转录成为可注射的Cas9-RNA。

30只3-4周龄C57BL/6J小鼠注射激素进行超排，取约250枚受精卵进行注射(注射两次，第一次150枚，第二次100枚)，制作30只8周龄输精管结扎的ICR雄鼠，8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠，将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部。出生后7-10天小鼠取鼠尾DNA鉴定基因型，扩增产物为：

M-mir378-F1：GATTGCCTGGAGTCGTGTCC(SEQ No.7)

M-mir378-R1：TAGCCACCAAAGACAAGAAGAACTC(SEQ No.8)

PCR反应体系及扩增程序(TaKaRa RR042A)：

●反应体系：

●扩增程序：

95℃ 15min；

95℃,30s 60℃,30s 72℃,60s 30循环；

72℃ 10min；

●6×loading buffer终止反应

●用1％的琼脂糖凝胶进行电泳

选取PCR检测有缺失条带的PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。其中野生型扩增片段为890bp，缺失位点扩增片段为583bp。该基因敲除小鼠购于中国医学科学院医学实验动物研究所(北京)。

实施例3miR-378基因敲除小鼠对比野生小鼠在压力超负荷刺激表现出更严重的心肌肥厚和心肌纤维化

8周到10周的miR-378基因敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)使用主动脉缩窄方法(TAC)构建小鼠压力超负荷心肌重构模型，2周后，心脏超声检测显示心功能指标包括舒张期左室后壁厚度、左室舒张期内径、射血分数，以及心重体重比；免疫组化进行HE染色和胶原染色。结果显示，miR-378基因敲除小鼠心肌组织对比野生型小鼠心肌肥厚和纤维化程度加重(见图7、图9、图10)，同时射血分数所反映的心功能下降明显(见图8)。

实施例4miR-378表达水平具组织和细胞特异性

我们使用northern blot和real-time PCR的方法检测了miR-378在小鼠各种组织中的发现，结果显示miR-378主要在心脏组织和骨骼肌中呈高表达(见图11)。进一步体外分离出心脏组织中的心肌细胞和心肌成纤维细胞，发现miR-378在心肌细胞中特异性表达(见图12)。

实施例5体外原代心肌细胞过表达miR-378显著抑制肥大，抑制内源miR-378在肥大因素刺激下加重心肌细胞肥大

实验中使用Ambion公司的mirVanaTM mimics(35nM)和mirVanaTM miR-378inhibitor(50nM)转染原代心肌细胞，48小时后肥大机械牵张刺激，发现miR-378能显著抑制心肌细胞表面积、肥大基因表达和³[H]摄取量，相反，抑制内源miR-378心肌细胞肥大加重、肥大基因表达上调，³[H]摄取量增加(见图13、图14)。

实施例6体外心肌成纤维细胞过表达miR-378显著抑制成纤维细胞纤维化反应

实验中使用Ambion公司的mirVanaTM mimics(35nM)转染心肌成纤维细胞，48小时后机械牵张刺激，发现miR-378能显著抑制心肌成纤维细胞胶原基因和MMP金属蛋白酶的表达(见图15、图16)。

实施例7人血清中miR-378的表达与心力衰竭疾病状态密切相关

收集28例健康人和27例心力衰竭患者的血清，其中心衰患者(左室射血分数<45％)16例，心衰患者(左室射血分数>45％)11例。上述所有样本的取得均通过伦理委员会的同意。使用Trizol提取血清中的总RNA，用ABI的Taqman探针方法检测miR-378表达水平，先用100ng总RNA为模板使用 MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)反转录，然后real-time PCR检测miR-378表达，扩增程序95℃10分钟，(95℃15秒，60℃60秒)40个循环。通过绘制标准曲线来分析miR-378的表达量。我们发现心衰患者血清中miR-378表达水平对比健康对照组显著升高，并且轻度心衰患者(左室射血分数>45％)的血清中miR-378的表达水平要高于重度心衰患者(左室射血分数<45％)组(见图17、图18)。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> miR-378抑制心肌肥厚和心肌纤维化并诊断心力衰竭的用途

<130> 2017

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人

<400> 1

cuccugacuc cagguccugu gu 22

<210> 2

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 反义链

<222> (1)..(21)

<400> 2

acuggacuug gagucagaag guucugacuc caaguccagu uu 42

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccuucugacu ccaaguccag u 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 载体

<400> 4

ggctcagagc tgagcgggaa tgg 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taggctcaga gctgagcggg aa 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacttcccg ctcagctctg ag 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gattgcctgg agtcgtgtcc 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagccaccaa agacaagaag aactc 25