抗乙型肝炎病毒的递送系统和生物制剂的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及抗乙型肝炎病毒领域，更具体涉及一种新型的抗乙型肝炎病毒的新型递送系统和生物制剂。

背景技术：

全球乙肝病毒感染者约有3.5亿人，其中约1亿人在中国。这些人由于乙肝病毒潜伏无法得到根治。乙肝病毒潜伏的主要原因是其基因组以一种共价闭环DNA(covalently closed circular DNA或cccDNA)的形式在病人的肝细胞核内长期稳定存在。现有的抗乙肝药物主要是干扰素和核苷(酸)类似物，但这两类药物均无法清除cccDNA，因而无法根治乙肝。

新兴的基因编辑技术CRISPR-Cas9系统由于其高效特异的DNA剪切和编辑能力而得到了在科研领域的广泛应用。CRISPR-Cas9是在细菌中发现的一种DNA剪切系统，通过DNA内切酶Cas9在一段小RNA(guide RNA)的帮助下识别特定的DNA序列并在特定的位点进行剪切。由于需要同时表达一个大的蛋白Cas9和一个小的guide RNA，如何在人体进行安全有效的输送有特异疗效的CRISPR-Cas9系统是一个亟待解决的问题，并已经成为CRISPR-Cas9在临床应用的瓶颈。

已有的CRISPR-Cas9体内输送是通过运用腺病毒表达体系来表达Cas9和guide RNA，但是腺病毒的安全性仍有问题。而且，腺病毒在细胞内的长期稳定表达Cas9这种DNA酶，也有可能带来长期的毒副作用。基于新型的脂质纳米颗粒(LNP)的核酸输送系统已经在活体内输送小RNA比如siRNA和长链RNA比如mRNA上表现出良好的效果。

因此，对于安全有效的输送有特异性疗效的CRISPR-Cas9系统仍存在需要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效的LNP递送系统，通过将LNP与Cas9mRNA和一段单链guide RNA(sgRNA)通过微流装置进行混合而得到，其能够有效的被输送到小鼠肝脏并对乙肝病毒cccDNA进行剪切，达到抑制乙肝病毒的目的。该试剂提供了一种在人体安全根治乙肝病毒的可能性。

本发明的第一个方面涉及靶向HBV基因保守区域的sgRNA分子，其具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所示的核酸序列之一：GAGGTGAAGCGAAGTGCACA(SEQ ID NO:1)；CCACCCAAGGCACAGCTTGG(SEQ ID NO:2)；CGGGGAGTCCGCGTAAAGAG(SEQ ID NO:3)；AAGCCACCCAAGGCACAGCT(SEQ ID NO:4)；GAAGCGAAGTGCACACGGTC(SEQ ID NO:5)；AGAAGATGAGGCATAGCAGC(SEQ ID NO:6)；CAAGCCTCCAAGCTGTGCCT(SEQ ID NO:7)；GGGGCGCACCTCTCTTTACG(SEQ ID NO:8)；GGACTTCTCTCAATTTTCTA(SEQ ID NO:9)；或TCCTCTGCCGATCCATACTG(SEQ ID NO:10)。

本发明的第二个方面涉及用于将基于CRISPR-Cas9系统的RNA分子运输到肝脏的脂质纳米颗粒。该脂质纳米颗粒由脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇构成。该脂质纳米颗粒包裹Cas9mRNA和如上述第一个方面所述的sgRNA分子。

在本发明的一种实施方式中，该脂多肽分子为脂多肽的多聚体。在本发明的一种具体实施方式中，脂多肽为1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3)，聚乙二醇为PEG2000。

在本发明的一种实施方式中，脂多肽分子、二油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和聚乙二醇的摩尔比为15:25:45:0.75或15:30:40:0.75。Cas9mRNA和/或sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为(1:10)-(1:5)。在一种优选的实施方式中，Cas9mRNA和/或sgRNA与脂多肽分子的质量比范围为1:10。

本发明的第三个方面涉及一种生物制剂，其包含本发明第二个方面所述脂质纳米颗粒、Cas9mRNA和/或本发明第一个方面所述的sgRNA分子，以及药学上可接受的赋形剂和辅料。

本发明的第四个方面涉及脂质纳米颗粒的制备方法，该方法包括：

(i)将脂多肽分子、胆固醇和聚乙二醇溶于酒精中，得到第一溶液；并将Cas9mRNA和/或sgRNA分子溶于水，得到第二溶液；

(ii)在微流装置中混合所述第一溶液和所述第二溶液，形成所述脂质纳米颗粒。

所述制备方法中的脂多肽为1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3)；所述聚乙二醇为PEG2000；并且该sgRNA分子为本发明第一个方面所述的sgRNA分子。

在一种具体的实施方式中，所述脂质纳米颗粒的半径为80-160nm，优选80-120nm。

本发明的包裹有CRISPR-Cas9系统的脂质纳米颗粒和包含该脂质纳米颗粒的生物制剂能够安全有效地输送有特异性疗效的CRISPR-Cas9系统，同时避免腺病毒递送系统带来的安全性问题和毒副作用。

附图说明

图1：根据本发明的方法通过微流装置合成包含Cas9mRNA和sgRNA的脂质纳米颗粒的方法的示意图。

图2：根据本发明的一种实施方式的用于合成脂质纳米颗粒的微流体芯片的显微镜照片，其中示意性示出了在显微镜下观察到的通道。

图3：根据本发明的一种实施方式通过微流体芯片合成包含Cas9mRNA或sgRNA的脂质纳米微粒的示意图。

图4：靶向HBV ayw亚型基因组的sgRNA设计。A.HBV ayw基因组成及sgRNA B1-B9的靶向区域；B.sgRNA B1-B9靶向序列的保守性分析。

图5：瞬时转染基于RNA组份的CRISPR/Cas9系统在HepAD38细胞系中的抗乙肝病毒作用。A.实验流程示意图；B.细胞培养上清表面抗原水平；C.细胞内乙肝病毒表面抗原水平，结果以各组相对于对照组水平的百分比表示，对照组只转染Cas9mRNA，t检验计算P值，以*表示显著性；D.Hirt法提取HepAD38细胞系cccDNA，T7E1错配酶实验检测Cas9/sgRNA靶向剪切DNA双链效率，酶切后的目的条带用黑色三角箭头标识。

图6：TT3脂质纳米微粒合成及体内表达验证。A.TT3脂质纳米微粒合成方法示意图；B.动态光散射测量TT3-O3和TT3-O14脂质纳米微粒的粒径及分布；C.提取小鼠肝细胞中的RNA，反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测Cas9mRNA水平；D.提取小鼠肝细胞中的RNA，反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测sgRNA水平；E.Western检测尾静脉注射后6h小鼠肝脏中的Cas9蛋白表达水平；F.Western检测尾静脉注射后6h小鼠脾脏中的Cas9蛋白表达水平。

图7：TT3-O3脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38细胞系中的抗乙肝病毒作用。A.实验流程示意图；B.细胞培养上清表面抗原水平；C.细胞内乙肝病毒e抗原水平，t检验计算P值，以*表示显著性；D.实时荧光定量PCR检测3.5kb前基因组RNA表达水平；E.Hirt法提取HepAD38细胞系cccDNA，T7E1错配酶实验检测Cas9/sgRNA靶向剪切DNA双链效率，酶切后的目的条带用黑色三角箭头标识。

图8：TT3-O3脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。A.小鼠实验流程示意图；B.ELISA检测血清乙肝病毒表面抗原水平；C.ELISA检测血清乙肝病毒e抗原水平；D.ELISA检测肝脏内乙肝病毒表面抗原水平；E.ELISA检测肝脏内乙肝病毒e抗原水平；F.肝脏内乙肝病毒3.5kb前基因组RNA相对表达水平；G.肝脏内rcccDNA相对含量；H.B10sgRNA在HBV DNA引起特异的基因突变，而在对照组中没有发现特异性的突变。

图9：TT3-O3脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。图9A示出了小鼠实验流程示意图；图9B示出了ELISA检测血清乙肝病毒表面抗原水平；图9C示出了ELISA检测血清乙肝病毒e抗原水平；图9D示出了ELISA检测肝脏内乙肝病毒表面抗原水平；图9E示出了ELISA检测肝脏内乙肝病毒e抗原水平；图9F示出了肝脏内乙肝病毒3.5kb前基因组RNA相对表达水平；图9G示出了肝脏内rcccDNA相对含量；图9H示出了B10sgRNA在HBV DNA引起特异的基因突变，而在对照组中没有发现特异性的突变。

具体实施方式

除非另有说明，否则本发明的上下文中所用的术语具有下面给出的含义。本文没有具体给出含义的其他术语具有其在本领域中通常的含义。

1.定义：

TT3：1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-双十二烷氨基丙基)苯甲酰胺

PDMS：聚二甲基硅氧烷

DOPE：二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)

PEG：聚乙二醇

2.材料和方法

本发明的一种实施方式涉及新型LNP递送系统，包含：脂质纳米颗粒、Cas9mRNA和/或sgRNA，其中脂质纳米颗粒由脂多肽分子与胆固醇和聚乙二醇构成。

图1中示出了根据本发明的方法通过微流装置合成包含Cas9mRNA和sgRNA的脂质纳米颗粒的方法的示意图。将TT3、DOPE、PEG 2000和胆固醇溶于酒精中，并将Cas9mRNA和/或sgRNA溶于水中，然后将两种溶液一起在微流装置中被快速混合，形成半径为80－160nm的颗粒。

2.1.靶向HBVayw亚型的sgRNA序列设计

通过CRISPR设计工具(http://www.genome-engineering.org/crispr/)及sgRNA的设计原则，评估HBVayw序列上得分较高的靶位点设计sgRNA。从HBVdb中获得HBV不同基因型和亚型序列，运用CLC Sequence Viewer软件分析和序列比对分析靶位点序列在不同基因型和亚型的HBV基因序列中的保守性，选取并合成10条靶向HBV基因保守区域的sgRNA，分别命名为B1-B10。

表1中示出了靶向HBV基因保守区域的sgRNA的序列及其在HBV基因组上的区域和靶向的HBV ORF。

表1：靶向HBV基因保守区域的sgRNA序列

2.2.sgRNA-B1～B10表达载体构建

根据设计的sgRNA序列，在其5’末端加上CACCG得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC，3’末端加上C得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列。将合成的序列用T4多聚核苷酸激酶于37℃处理30分钟使其磷酸化，95℃变性5分钟、以1.5℃/分钟降温至25℃退火后，得到具有BsmBI(或BbsI)粘性末端的双链DNA片段，如下：

正向：5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

磷酸化、变性及退火体系为：

1μl 100μM正向寡核苷酸链

1μl 100μM反向寡核苷酸链

1μl 10×T4Ligation Buffer(NEB)

6.5μl ddH2O

0.5μl T4多聚核苷酸激酶

将双链DNA片段和用BsmbI酶切过的LentiCRISPRv2(Addgene#52961)载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行分析及测序，确定sgRNA表达载体构建成功，命名为LentiCRISPRv2-sgRNA(B1-B9)。

将双链DNA片段和用BbsI酶切过的PX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene#42230)载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行分析及测序，确定gRNA表达载体构建成功,命名为PX330-HBVgRNA(B1-B9)。

2.3.稳定表达Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的Huh7细胞系的构建以及sgRNA对于HBV抗病毒作用的分析检测

在六孔板中每孔接种8×10⁵个293T细胞，待细胞密度达到70-80％转染2μg CRISPR表达质粒、0.4μg vsvG、0.2μg Tat、0.2μg Gag/Pol及0.2μg Rev质粒。转染后6-8h更换新鲜培养基，48h收取293T培养上清，3000rpm离心10分钟去除沉淀，病毒上清立即使用或于-80℃贮存。

用293T细胞包装出的慢病毒感染Huh7细胞系，感染48h后用嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9和相应sgRNA的Huh7细胞系，命名为Huh7-B1～B9细胞系。培养条件为DMEM培养基，其中含10％FBS，2μg/ml Puromycin，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)，37℃，5％CO₂。

在转染前一天将Huh7-B1～B9细胞系分别接种于6孔板中，每孔6×10⁵个，待细胞密度达到70％-80％时进行转染。用Lipofectamine3000转染2.5μg prcccDNA，2.5μg pCMV-Cre，8-12h更换37℃预热的新鲜培养基。继续培养72h后收集细胞提取细胞中的HBV cccDNA，用T7E1错配酶检测经过在稳定表达Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的Huh7细胞系中转染的HBV基因组序列是否产生了突变。

2.4.稳定表达Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的HepAD38细胞系的构建以及sgRNA对于HBV抗病毒作用的分析检测

采用上述相同方法在293T细胞中包装出慢病毒后感染HepAD38细胞系，感染48h后用嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9和靶向HBV DNA的sgRNA的HepAD38细胞系，命名为HepAD38-B1～B9细胞系。培养条件为DMEM培养基，其中含10％FBS，2μg/ml Puromycin，400μg/ml G418，0.3μg/ml Tet，penicillin(100U/ml)和treptomycin(100μg/ml)，37℃，5％CO₂。

将HepAD38-B1～B9细胞系分别接种于6孔板中，每孔6×10⁵个，72h后收集细胞。提取细胞中的HBV cccDNA，用T7E1错配酶检测经过在稳定表达Cas9和靶向HBVayw的sgRNA的HepAD38细胞系中HBV基因组序列是否产生了突变。

2.5.在HepAD38细胞系中分析检测转染Cas9mRNA和sgRNA对于HBV的抗病毒作用

将HepAD38细胞系接种于6孔板中，每孔6×10⁵个，待细胞密度达到70％-80％时进行转染。用Lipofectamine3000转染9.6ug Cas9mRNA和9ul 20uM sgRNA，8h更换37℃预热的新鲜培养基。继续培养72h后收集细胞培养上清和细胞，用ELISA检测细胞培养上清和细胞内的乙肝病毒表面抗原水平，细胞内的乙肝病毒e抗原水平。提取细胞中的HBV cccDNA，用T7E1错配酶检测转染Cas9mRNA和sgRNA后HepAD38细胞系中HBV基因组序列是否产生了突变。

2.6.Hirt法提取细胞内HBVcccDNA

胰酶消化收取细胞后3000rpm离心5分钟，用PBS洗涤一遍，3000rpm离心5分钟，收取细胞沉淀。加入500μl裂解液I(1％NP-40,1mM EDTA,50mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH 8.0)，冰上裂解30分钟，10000g，4℃离心20分钟收集沉淀，保留裂解上清用于ELISA法检测HBV表面抗原和e抗原表达的变化。向沉淀加入1ml裂解液II(1％SDS,10mM EDTA,150mM NaCl,50mM Tris-HCl,pH 8.0)，4℃旋转60分钟裂解细胞核。加入200μl 3M氯化钾，4℃旋转过夜。14000rpm，4℃离心20分钟，取上清，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇，剧烈混匀，室温静置7分钟，14000rpm，4℃离心10分钟，取上清。按收取的上清体积加入2倍体积乙醇和1/10体积的3M醋酸钠，于-80℃沉淀2小时。14000rpm，4℃离心20分钟，弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，14000rpm，4℃离心20分钟，弃上清。于37℃烘箱晾干以去除残留乙醇，20μl ddH2O溶解沉淀，Nanodrop测定DNA浓度。

2.7.T7E1错配酶检测

根据sgRNA B1-B9在HBVayw基因组上的靶位点设计引物PCR扩增出包含sgRNA靶位点的片段，表2中示出了引物序列。

表2：根据sgRNA B1-B9在HBVayw基因组上的靶位点设计的PCR引物

PCR体系如下：

PCR反应循环

使用Axygen公司胶回收试剂盒或天根公司超薄PCR产物纯化试剂盒回收PCR得到目的片段，具体方法按照公司提供的说明书进行，Nanodrop测定DNA浓度。

向回收得到的目的片段中加入NEB Buffer 2，按如下方式退火：

向退火产物中加入1μl T7E1内切酶，37℃，30min。加入6X Purple Loading Dye，2％琼脂糖凝胶电泳检测。

Cas9在识别的PAM上游3bp的位置切断目的DNA双链。表3中示出了预测的酶切目的片段大小。

表3：sgRNA的预测的酶切目的片段大小

2.8.ELISA法测定HBV表面抗原和e抗原表达的变化

收集细胞培养上清或细胞裂解后上清，以合适比例稀释后按照乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒及乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(上海科华)说明书测量HBV表面抗原及e抗原，具体步骤如下：

每孔加入待测样本(表面抗原75μl，e抗原50μl)，设阴、阳性对照各两孔，每孔加入与待测样品等体积的阴性对照(或阳性对照)，并设空白对照1孔。

表面抗原反应板于37℃孵育1小时(e抗原反应板无需孵育)，每孔加入酶结合物50μl(空白对照除外)，手工轻轻震荡10秒钟，用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育30分钟。

取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次：弃去孔内液体，用工作浓度洗涤液注满各孔，静置30-60秒，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干。

洗涤结束后立即在各孔内加入显色剂A、显色剂B各50μl，手工轻轻震荡10秒钟。用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育10-15分钟。

在各孔内加入50μl终止液，震荡反应板5秒钟，使之充分混匀。用酶标仪读数，波长450nm。

2.9.在小鼠模型中分析检测sgRNA-B5、B6对于HBV复制的抑制作用

将6ug prcccDNA、4ug pCMV-Cre和20ug PX330/PX330-B5/PX330-B6质粒溶于1.7mlPBS中，用2ml医用注射器加1ml医用注射针头将溶有质粒的PBS在5-7秒钟内通过尾静脉注射到野生型C57BL/6小鼠体内。

注射后的小鼠养3天后腹腔注射200-250μl Avertin麻醉，用毛细管自眼眶采血50-100ul。养5天后腹腔注射200-250μl Avertin麻醉，摘取眼球取血，处死后剖开取肝脏，液氮速冻后于-80℃保存。采集的小鼠血液均于4℃冰箱放置过夜后，3500rpm，4℃离心15min后分离血清。取少量小鼠血清稀释后用ELISA检测其中的乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原水平。取少量肝脏用裂解液匀浆、冰上裂解后测定蛋白浓度，将各小鼠肝脏样品蛋白浓度标准化后用ELISA检测其中的乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原水平。Hirt法提取小鼠肝脏中的cccDNA，用T7E1错配酶实验检测经过sgRNA处理的小鼠肝脏中的HBV基因组序列是否产生了突变。

2.10.包裹Cas9mRNA或sgRNA的脂质纳米微粒的合成

2.10.1用于合成脂质纳米微粒的PDMS微流体芯片制备

将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物和固化剂在烧杯中充分混合，放入真空箱内除去混合物内的气泡。浇铸到使用光刻加工的SU-8模具上，放入烘箱内加热固化，从SU-8模具上揭下固化后的PDMS块。在PDMS块上结构的入口和出口位置打孔，沿芯片边界裁切PDMS块。对PDMS块做氧气等离子体清洗，将PDMS块对准，按压键合。每次在合成脂质纳米微粒前用氧气等离子体做亲水处理。

2.10.2脂质纳米微粒合成

下表4中示出了各脂质纳米微粒的两种配方(O3配方和O14配方)：

表4：脂质纳米微粒的组成

合成方法：用无水乙醇溶解各脂质成分得到储液，按包裹的Cas9mRNA或sgRNA的质量以及各脂质成分的比例计算各脂质成分所需用量，将配制好的乙醇相的脂质成分与水相的RNA组分一起推入微流体芯片装置使其快速混合，通过静电相互作用组装成内部包裹有RNA的脂质纳米微粒。用于小鼠体内实验的脂质纳米微粒在尾静脉注射前需用3.5K MWCO的透析卡在PBS缓冲液中透析1小时，透析完成后于4℃保存。图3中是示出了根据本发明的一种实施方式通过微流体芯片合成包含Cas9mRNA或sgRNA的脂质纳米微粒的示意图。

脂质纳米微粒的表征：用动态光散射(DLS)测量合成的脂质纳米微粒粒径和分布，用Quant-iT RiboGreen RNA Kit检测脂质纳米微粒的包裹效率。

2.10.3 Quant-iT RiboGreen试剂盒定量检测脂质纳米微粒的包裹效率

用DEPC水稀释20×TE溶液配制成1×TE工作液，将合成的脂质纳米微粒一份用1×TE工作液按1：100的比例稀释，一份用含有Triton-X100(终浓度为1％)的1×TE工作液按1：100的比例稀释，室温放置15分钟以破坏脂质纳米微粒从而释放出包裹的RNA。

在透明的平底96孔板中各加入100μl样品稀释液，同时设置浓度为0，10，50，90，100ng/ml的RNA标准品稀释孔。在各孔中加入100μl Reagent A工作液，室温避光反应5分钟后用荧光酶标仪读数，激发光480nm，发射光520nm。根据标准品的读数绘制标准曲线，计算各样品的RNA浓度，脂质纳米微粒的包裹效率计算公式为：(1-不加入Triton-X100反应孔RNA浓度/加入Triton-X100反应孔RNA浓度)×100％

2.11.在小鼠模型中分析检测脂质纳米微粒对于HBV复制的抑制作用

将prcccDNA和pCMV-Cre通过尾静脉高压注射的方法注射到小鼠体内，构建乙型肝炎病毒的小鼠模型。2天后用毛细管自眼眶采血50-100μl，分离血清后用ELISA检测乙肝病毒表面抗原水平。根据血清乙肝病毒抗原水平进行分组，保证组间平均水平无显著差异。分别合成包裹Cas9mRNA和靶向HBV的sgRNA或对照sgRNA的脂质纳米微粒，于尾静脉高压注射后第3天和第4天进行尾静脉注射。第5天腹腔注射200ul Avertin麻醉小鼠，摘除眼球取血，处死后剖开腹腔，取出肝脏，液氮速冻保存。分离血清，稀释后用ELISA检测血清乙肝病毒表面抗原和e抗原水平。取肝脏匀浆后用BCA法测定蛋白浓度并作标准化，用ELISA试剂盒检测肝脏内乙肝病毒表面抗原和e抗原水平。Trizol法提取肝脏RNA，反转录成cDNA后用荧光实时定量PCR检测其中的HBV 3.5kb RNA含量。Hirt法提取HBV cccDNA，并用荧光实时定量PCR检测其中的HBV cccDNA的含量变化。表5中列出了荧光实时定量引物。

表5：荧光实时定量引物

Cas9mRNA或sgRNA的质量以及各脂质成分的比例可随脂质成分的性质以及用于免疫的动物而变化。多种途径可以用于施用本发明的包裹有CRISPR-Cas9系统的脂质纳米颗粒和包含该脂质纳米颗粒的生物制剂：包括皮下、肌肉内、真皮内、静脉内、腹膜内、和脾内等等。

3.结果

3.1.靶向HBV ayw亚型基因组的sgRNA设计及验证

根据CRISPR设计网站获得靶向HBV ayw亚型基因组上不同ORF的sgRNA，从HBVdb上获取HBV不同亚型的基因组序列进行比对，从找到的靶位点中选出位于保守性较高区域的sgRNA序列，命名为B1-B9。B1-B9在HBV ayw亚型基因组的靶向区域和保守性分析结果如图4A和图4B所示。图4示出了靶向HBV ayw亚型基因组的sgRNA设计，其中图4A.HBV ayw基因组成及sgRNA B1-B9的靶向区域；图4B为sgRNA B1-B9靶向序列的保守性分析。

3.2.瞬时转染基于RNA组分的CRISPR/Cas9系统在HepAD38细胞系中的抗乙肝病毒作用及sgRNA效果的体外鉴定

因为CRISPR系统介导的基因编辑可以通过瞬时作用完成，因此在验证了LentiCRISPRv2慢病毒载体递送的靶向HBV ayw的CRISPR系统在细胞系中对乙肝的抗病毒作用后，我们在稳定表达HBV基因组的HepAD38细胞系中评估了瞬时转染Cas9mRNA和体外合成的sgRNA B1-B9的抗病毒作用。图5示出了瞬时转染基于RNA组份的CRISPR/Cas9系统在HepAD38细胞系中的抗乙肝病毒作用，其中图5A为实验流程示意图；图5B-5C分别为细胞培养上清和细胞内乙肝病毒表面抗原水平，结果以各组相对于对照组水平的百分比表示，对照组只转染Cas9mRNA，t检验计算P值，以*表示显著性，图5D为Hirt法提取HepAD38细胞系cccDNA，T7E1错配酶实验检测Cas9/sgRNA靶向剪切DNA双链效率，酶切后的目的条带用黑色三角箭头标识。

图5A中所示的方法包括如下步骤：在接种的HepAD38细胞系中用TransIT-mRNA分别转染Cas9mRNA和B1-B9sgRNA，72h后收取细胞和培养上清。ELISA检测细胞培养上清中和细胞内的乙肝表面抗原水平，结果表明与只转染Cas9mRNA的对照组相比，sgRNA B3,B5,B6和B7能够显著降低HepAD38系细胞内和分泌的乙肝表面抗原水平(图5B-5C)。Hirt法提取HepAD38细胞中的cccDNA，T7E1错配酶实验结果表明B1,B3,B4,B5,B6,B7,B8均能靶向剪切HBV cccDNA，但相比较于稳定表达Cas9/sgRNA的细胞系剪切效率较低(图5D)。

3.3.包裹CRISPR系统RNA组分的TT3脂质纳米微粒合成及体内表达验证

由于mRNA与siRNA有着不同的特性，尤其在分子量上相距甚远，Cas9mRNA大约有4200nt，使其在利用脂质纳米微粒包裹时更为困难。我们通过体外筛选和优化，得到用于递送mRNA的新型的TT3脂质纳米微粒，合成方法示意图如图5A所示。经过优化得到的两种配方的TT3脂质纳米微粒：TT3-O3和TT3-O14。以60μg/ml作为Cas9mRNA的起始浓度合成相应的TT3-O3和TT3-14脂质纳米微粒，动态光散射测量其粒径和分布，结果显示相比较于TT3-14，TT3-O3配方合成的脂质纳米微粒半径更小且分布更加集中(图6B)。图6A-F中示出了TT3脂质纳米微粒合成及体内表达验证，其中图6A为TT3脂质纳米微粒合成方法示意图；图6B示出了动态光散射测量TT3-O3配方和TT3-O14配方脂质纳米微粒的粒径及分布；图6C为提取小鼠肝细胞中的RNA，反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测Cas9mRNA水平；图6D示出了提取小鼠肝细胞中的RNA，反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR检测sgRNA水平；图6E示出了Western检测尾静脉注射后6h小鼠肝脏中的Cas9蛋白表达水平；图6F示出了Western检测尾静脉注射后6h小鼠脾脏中的Cas9蛋白表达水平。

以60μg/ml作为RNA的起始浓度合成包裹Cas9mRNA和B6sgRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒，在C57BL/6小鼠中通过尾静脉注射包裹Cas9mRNA和B6sgRNA的TT3-O3脂质纳米微粒(5μg/20g体重)，于不同时间点收取小鼠肝脏检测TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA的表达。图6C和图6D中的RT-qPCR结果显示在尾静脉注射6h后，肝细胞内已经能够检测到Cas9mRNA、sgRNA，12h后Cas9mRNA、sgRNA已经下降到较低的水平。尾静脉注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒6h后，在肝脏中能够检测到Cas9的蛋白表达(图6E)而在脾脏中检测不到(图6F)，证明TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的RNA组分主要在肝脏中高表达。

实施例

实施例1:TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38细胞系中的抗乙肝病毒作用

TT3-O3配方无需外源添加其他物质即可在体外培养的细胞系中递送包裹的RNA组分。因此我们首先在稳定表达HBV基因组的HepAD38细胞系中评估了TT3-O3脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA B6的抗病毒作用。

图7示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38细胞系中的抗乙肝病毒作用。图7A示出了实验流程的示意图；图7B-7C分别示出了细胞培养上清和细胞内乙肝病毒e抗原水平，t检验计算P值，以*表示显著性；图7D示出了实时荧光定量PCR检测3.5kb前基因组RNA表达水平；图7E示出了Hirt法提取HepAD38细胞系cccDNA，T7E1错配酶实验检测Cas9/sgRNA靶向剪切DNA双链效率，酶切后的目的条带用黑色三角箭头标识。

图7A中示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒的制备方法：在接种的HepAD38细胞系中加入分别包裹有Cas9mRNA和sgRNA-B6的TT3-O3脂质纳米微粒，sgRNA-sgGFP和sgRNA-B6S2(sgRNA-B6序列随机打乱)作为对照组，48h后收取细胞和培养上清。Cas9mRNA和sgRNA-B6根据图7中所示出的方法分别形成脂质纳米微粒，其可以序贯递送或同时递送。ELISA检测细胞培养上清中和细胞内的乙肝表面抗原和e抗原水平，结果表明与对照组相比，sgRNA-B6实验组能够显著降低HepAD38系细胞内和分泌的乙肝e抗原水平(图7B-7C)，细胞内3.5kb前基因组RNA相对表达水平也有显著的下降(图7D)。Hirt法提取HepAD38细胞中的cccDNA，T7E1错配酶实验结果表明TT3-O3脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6能靶向剪切HBV cccDNA，但剪切效率较低(图7E)，这是由于大部分cccDNA在发生剪切以后被降解，因而无法在最终的T7E1错配酶实验中检测到。

在证实了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在HepAD38细胞系中的抗乙肝病毒作用后，我们进一步评估了其在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。

图8示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。图8A示出了小鼠实验流程示意图；图8B示出了ELISA检测血清乙肝病毒e抗原水平；图8C示出了ELISA检测血清乙肝病毒RNA水平；图8D示出了ELISA检测肝脏内乙肝病毒DNA水平。

图8A中示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在小鼠乙肝模型中的实验流程：通过尾静脉高压注射prcccDNA和pCMV-Cre质粒在C57BL/6小鼠中构建乙肝感染模型，根据小鼠体重随机分组，根据Cas9蛋白和sgRNA表达水平的动力学变化，于24h尾静脉注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒(200μl/10g体重)，6h后尾静脉注射包裹sgRNA-B5或对照组sgRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒(100μl/10g体重)。48h后采集小鼠外周血分离血清，收取小鼠肝脏，ELISA检测肝脏内的乙肝病毒e抗原水平。结果表明，TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B6在小鼠乙肝模型中有的抗乙肝病毒作用，且对于小鼠乙肝模型内乙肝病毒e抗原(图8B)，RNA(图8C)和cccDNA(图8D)有显著的靶向破坏作用。

实施例2：TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用

以与实施例1中相似的方法评估了其在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。

图9示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中的抗乙肝病毒作用。图9A示出了小鼠实验流程示意图；图9B示出了ELISA检测血清乙肝病毒表面抗原水平；图9C示出了ELISA检测血清乙肝病毒e抗原水平；图9D示出了ELISA检测肝脏内乙肝病毒表面抗原水平；图9E示出了ELISA检测肝脏内乙肝病毒e抗原水平；图9F示出了肝脏内乙肝病毒3.5kb前基因组RNA相对表达水平；图9G示出了肝脏内rcccDNA相对含量；图9H示出了B10sgRNA在HBV DNA引起特异的基因突变，而在对照组中没有发现特异性的突变。

图9A中示出了TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在在小鼠乙肝模型中的实验流程：通过尾静脉高压注射prcccDNA和pCMV-Cre质粒在C57BL/6小鼠中构建乙肝感染模型，根据小鼠体重随机分组，根据Cas9蛋白和sgRNA表达水平的动力学变化，于24h尾静脉注射包裹Cas9mRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒(200μl/10g体重)，6h后尾静脉注射包裹sgRNA-B5或sgRNA-B10或对照组sgRNA的TT3-O3配方脂质纳米微粒(100μl/10g体重)。48h后采集小鼠外周血分离血清，收取小鼠肝脏，ELISA检测血清和肝脏内的乙肝病毒表面抗原和e抗原水平。ELISA结果显示相比于sgGFP对照组，sgRNA:B5和B10实验组小鼠的血清乙肝病毒表面抗原和e抗原(图9B和图9C)，肝脏内表面抗原和e抗原有显著下降(图9D-9E)，肝脏内3.5kb前基因组RNA相对表达水平也有显著下降(图8F)。提取肝脏总DNA，经Plasmid-Safe DNaseI消化处理后用cccDNA特异引物检测其含量变化，结果显示相比较于对照组，sgRNA B10实验组小鼠肝脏内cccDNA含量有显著下降(图9G)。通过深度测序，我们进一步确认了在B10处理的小鼠的乙肝病毒DNA中确实有特异性的突变(图9H)。以上结果表明，TT3-O3配方脂质纳米微粒递送的Cas9mRNA和sgRNA-B5或sgRNA-B10在小鼠乙肝模型中有一定的抗乙肝病毒作用，且对于小鼠乙肝模型内HBV cccDNA有显著的靶向破坏作用。

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