一种提高宿主肠道微生物群落重塑效率的方法与流程

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种提高宿主肠道微生物群落重塑效率的方法。

背景技术：

健康稳定的肠道微生物群落与宿主健康状况及肠道的内环境稳态具有十分密切的作用。宿主的肠道共生菌群的结构组成与宿主的健康状态及宿主生活的环境处于相互依赖、相互制约的状态。因此，在肠道菌群结构正常的情况下，宿主本身具有抵抗外来病原菌的能力，且肠道内的正常菌群并不会对宿主健康形成危害。据目前研究，肠道微生物群落失调与肠炎、腹泻、便秘、肥胖、抑郁症、糖尿病、自身免疫疾病都具有相关性，肠道微生物群落状态也与宿主对营养物质的消化和吸收具有直接关系。因此，通过调节紊乱的肠道微生物群落，使之恢复为健康菌群的稳态，具有治疗多种疾病的应用前景；通过调控肠道微生物群落结构也可直接调节动物对营养物质的消化和吸收，调控动物机体的代谢状态，在畜牧业生产中具有广泛的应用前景。

粪菌移植是一种将外源健康微生物群落移植到受体肠道中，从而改变患病受体的肠道微生态紊乱，使之恢复健康稳态的一种技术手段。近年来，使用粪菌移植的方法治疗动物胃肠道疾病及改善胃肠道环境已经渐渐成为生产者和科研工作者深入研究的热门课题。据文字记载，早在中国东晋时期，《肘后备急方》中就描述了使用人的粪便上清液治疗食物中毒、腹泻、发热等疾病；奥地利维也纳医科大学的angelberger使用粪菌移植的方法对5位溃疡性结肠炎患者进行治疗，并取得了显著疗效。此后大量临床报道，利用粪菌移植治疗多种疾病，如慢性便秘、伪膜性肠炎、艰难梭状芽孢杆菌性肠炎等。另外，在畜牧业中，粪菌移植可以有效提高仔猪、雏鸡的生长性能，显著提高日增重和采食量，并可显著防治腹泻。因此，粪菌移植在临床治疗和生产实践的应用中，已经具有良好的效果。

谭本杰等人公开了一种利用粪菌移植提高雏鸡生长性能和防治鸡白痢的方法(cn105029030a)。粪菌移植的方法具有提高雏鸡平均日增重、平均日采食量，并可显著防治鸡白痢的优点。该发明采用健康动物的粪菌液来代替抗生素，可为粪菌移植在其它动物生产中的应用提供参考。

王士长等人公开了一种利用粪菌移植提高断奶仔猪生长性能和降低腹泻率的方法(cn105029031a)。通过粪菌移植的技术手段可以提高断奶仔猪平均日增重、平均日采食量，也可显著降低断奶仔猪的腹泻率。该发明使用健康动物的粪菌液来代替抗生素，为粪菌移植在动物生产中的应用提供参考。

然而，上述技术方案中均直接采用粪菌移植的方法达到改善宿主肠道微生物的目的，但是由于宿主肠道微生物群落具有稳健性，粪菌移植的微生物定植效率很低，这也大大降低了粪菌移植的应用效果。

因此，亟需研发一种提高宿主肠道微生物群落重塑效率的方法。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高宿主肠道微生物群落重塑效率的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种提高宿主肠道微生物群落重塑效率的方法，包括以下步骤：

(1)利用联合抗生素对宿主肠道进行预处理；

(2)对宿主进行肠道粪菌移植。

其中，所述联合抗生素包括氨苄青霉素、硫酸新霉素和万古霉素。

优选地，所述联合抗生素为氨苄青霉素、硫酸新霉素和万古霉素的混合物。

更为优选地，所述联合抗生素中，氨苄青霉素的浓度为8g/l，硫酸新霉素的浓度为8g/l，万古霉素的浓度为4g/l。

进一步地，所述联合抗生素通过口服方式进入宿主肠道，口服剂量相对宿主体重为20ml/kg·次。

优选地，利用联合抗生素对宿主肠道进行预处理的时间为3天，每天口服联合抗生素2次，每次间隔8h以上。

进一步地，宿主通过口服健康供体粪便上清的方式实现肠道粪菌移植。

进一步地，所述健康供体粪便上清的制备方法为：取健康供体的新鲜粪便，使用无菌0.9％生理盐水充分捣匀，使用2层纱布过滤，获得健康供体粪便上清；其中，新鲜粪便与生理盐水的体积比为1:5。

优选地，粪菌移植的时间持续三天。

更为优选地，宿主每天口服健康供体粪便上清一次，剂量为20ml/kg·次。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明所述的方法可广泛应用到微生物技术领域、动物医学领域、营养学领域等。本发明通过使用联合抗生素对宿主肠道进行前处理，能够显著提高粪菌移植的移植效率，可高效的改变个体肠道微生物群落，必要时，可达到疾病防治的目的。

附图说明

图1为本发明采用肠道预处理的方法进行粪菌移植技术流程图。

图2为本发明采用不同肠道预处理方法能够显著提高粪菌定植效率；其中：con，对照组；bc，清肠液预处理组；at，联合抗生素预处理组；fmt，粪菌移植；a，空肠内微生物群落组成变化；b，结肠内微生物群落组成变化；c，空肠内粪菌定植效率；d，结肠内粪菌定植效率。

图3为本发明联合抗生素预处理和粪菌移植后耐药微生物丰度分布图；其中：con，对照组；at，联合抗生素预处理组；fmt，粪菌移植；a，空肠中，使用联合抗生素预处理后和粪菌移植后耐药微生物丰度分布；b，结肠中，使用联合抗生素预处理后和粪菌移植后耐药微生物丰度分布。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、试验动物和饲养条件

从北京华阜康生物科技股份有限公司购买无特殊病原菌(specific-pathogenfree，spf)的8周龄雌性小鼠(icr)，在中国农业大学饲料工业中心鼠房进行饲养，保持20℃恒温条件，12小时光照/黑暗交替循环，采用小鼠基础饲料(18％蛋白质，4％脂肪，5％纤维)进行饲喂，自由采食无菌饮水。饲料和饮水每天更换一次，以保证新鲜的饲料和饮水供给。每个处理组的小鼠在独立的鼠笼中进行饲养。

2、试验处理

实验小鼠被随机分成3大组，每组10只，分别为对照组、清肠液预处理组和联合抗生素预处理组。对照组自由采食无菌清洁的饮水，清肠液预处理组和抗生素处理组分别使用清肠液和联合抗生素溶液进行灌服(灌胃针操作)，每次灌服计量为500μl/只，2次/天，连续灌服3天。抗生素处理组采用联合抗生素(氨苄青霉素(ampicillin，8g/l)、硫酸新霉素(neomycinsμlphate，8g/l)和万古霉素(vancomycin，4g/l))混合水溶液进行口腔灌服，清肠液预处理组使用清肠液(peg3350，100g/l；nacl，46mmol/l；naso4，53mmol/l和l-抗坏血酸，30mmol/l)灌服。预处理三天后，每大组随机分出5只进行空肠和结肠的采样，各组剩余的5只小鼠接受粪菌移植，粪菌移植液采用异源微生物群落，此处为人的新鲜粪便，使用无菌0.9％生理盐水充分捣匀(粪：生理盐水＝1:5)，使用2层纱布过滤，使用灌胃针分别灌服给小鼠，500μl/只，1次/天，连续灌服3天。

实验技术流程图如图1所示。

3、采样及样品测定

使用断头法杀鼠，在干净的解剖盘中解剖小鼠，截取空肠和结肠肠段，截取的肠段使用无菌0.9％生理盐水冲洗内容物，再使用无菌刀片将冲洗干净的肠段剖开，并刮取肠粘膜，保存至新的1.5ml无菌离心管中，获得肠粘膜样品。送往北京奥维森基因科技有限公司进行全dna的提取及16srdnav3-v4区域高通量测序。样品暂存在-80℃冰箱中。在北京奥维森基因科技有限公司，使用qiagendnaextractionkit进行总dna的提取，使用带barcode的引物对16srdnav3-v4区域进行扩增，采用nebnextμltradnasamplepreparationkit进行序列文库的构建，使用illuminamiseq测序平台进行序列测定，获得420bp双端测序序列。

4、试验结果

使用微生物群落的bray-curtis距离参数来描述微生物群落相似性，对比粪菌移植后的微生物群落(空肠和结肠)与供体的相似性，并计算粪菌移植的效率。图2(a，b)所示，联合抗生素预处理组在粪菌移植后，空肠(a)和结肠(b)中的微生物群落结构与其它两组都存在显著差异，而且清肠液预处理组和对照组在粪菌移植后和移植以前的微生物群落结构高度相似，没有显著差异。因此，使用联合抗生素对宿主肠道进行预处理，在宿主接受粪菌移植后，空肠和结肠中的微生物群落都与不进行预处理的组有显著差异，抗生素的预处理促进了外源粪菌的定植；而使用清肠液预处理却没有促进粪菌定制的效果，移植后的微生物群落状态与对照组类似。图2(c，d)所示，粪菌移植前对肠道进行预处理并没有提高微生物在空肠中的定植效率(c)，联合抗生素预处理肠道却显著提高了结肠中粪菌移植的定植效率(d)。因此，粪菌移植前抗生素对肠道的前处理，可以显著提高粪菌移植在结肠中的定植效率。

通过对空肠和结肠中的微生物进行总dna提取及16srdna高通量测序，使用qiime流程进行分析，greengene数据库进行物种注释，可分析出肠道中微生物的物种组成及其丰度值。在空肠(a)和结肠(b)中，使用联合抗生素预处理后和粪菌移植后发生变化的微生物可以归为3个大组：1组，联合抗生素预处理后，丰度升高，粪菌移植后，丰度又降低至对照组水平的微生物；2组，联合抗生素预处理后消失，且粪菌移植后也没有恢复的微生物；3组，不同于宿主肠道内的原驻菌，使用联合抗生素预处理和粪菌移植后新增加的微生物(见图3)。经检测可知，耐药微生物都分布在1组，在联合抗生素预处理后，空肠和结肠中的耐药微生物丰度都显著升高了，而进行了后续的粪菌移植后，耐药微生物丰度又恢复到了对照组的正常水平。因此，在联合抗生素预处理之后再进行粪菌移植，能够使宿主肠道内的耐药微生物降低到健康供体的水平。

以上试验结果表明：(1)使用联合抗生素预处理宿主肠道，再进行粪菌移植，与非预处理组相比，显著改变了空肠和结肠中的微生物群落结构；(2)使用联合抗生素预处理宿主肠道之后，再进行粪菌移植，与非预处理组相比，显著提高了外源粪菌的定植效率；(3)使用联合抗生素预处理，虽然使得空肠和结肠的耐药微生物丰度升高，但是当进行后续粪菌移植后，空肠和结肠中的耐药微生物丰度均显著降低，恢复到健康对照组的水平。由此可见，使用联合抗生素预处理宿主肠道，再进行粪菌移植，可以显著提高外源粪菌的定植效率，并且不会导致耐药微生物的升高。因此，粪菌移植前的宿主肠道预处理技术在动物医学领域和临床领域都具有广泛的应用前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但因原理相同，实际应用并不仅限于说明书中所列的方法，对具体示例的描述只是为了例证，并非将本发明限定为所公开的精确形式。对于对本领域熟悉的研究人员而言，可以根据肠道预处理的概念，使用不同的抗生素配比预处理剂，广泛应用于临床、动物医学和营养学等领域，用于疾病的防治和代谢的改善，也可以进行灵活的修改，从而应用于不同的宿主，而不仅限定在对小鼠的应用。因此，在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明不限定于说明书中特定的抗生素配比和被应用的宿主。