DEF8蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用的制作方法

本发明涉及蛋白质工程与生物医药应用
技术领域：
，具体地说，涉及DEF8蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用。
背景技术：
：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在很多地区已经超过子宫癌，成为严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的肿瘤之一。乳腺癌的发病与患者的遗传基因、生活习惯、常用食物、生育状况等紧密相关，不同人种、地域的乳腺癌发病率有着明显的区别。乳腺癌的高发地区，主要集中在北美、北欧和大洋洲，尤其白种女性居多。乳腺癌的中发地区，集中在南美、南欧和以色列。亚洲则是乳腺癌的低发地区。举例来说，美国白种女性一生乳腺癌发病率为13.1％，即平均每8-9人就有1人可能会患上乳腺癌，而亚洲女性的乳腺癌发病率为4-7％。WHO统计，全球每年新发乳腺癌达130万人左右，死亡50万人左右。在我国北京、上海、天津等大城市的乳腺癌发病已跃居女性各种癌瘤首位,而且有明显上升的趋势。肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内男性癌症患者中，肝癌比例排第六，死亡率排在第二；在女性癌症患者中，肝癌比例排第七，死亡率排第六。2008年，全世界共有748,300个新增肝癌病例，有695,900例肝癌患者死亡。而这些新增肝癌病例和死亡病例中有一半在中国。肝癌发生率最高的区域主要在东亚，东南亚，中非和西非国家。亚洲部分地区和非洲撒哈拉以南地区之所以肝癌发生率较高，可能是因为这些地区HBV盛行，因为这些地区8％的居民慢性感染HBV，在发展中国家60％的肝癌患者感染过HBV。骨髓祖代细胞差异表达蛋白8(DifferentiallyexpressedinFDCP8)最早发现其在造血系统中有差异性的表达。DEF8蛋白有着广泛的分布，尤其是在外周血白细胞中的表达极高，但是在胸腺和胎肝中几乎检测不到其表达，并且DEF8蛋白巨噬细胞和粒细胞分化时表达显著下调。但是关于DEF8蛋白的功能到目前为止依然不清楚。热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。热休克蛋白gp96蛋白具有多肽结合特性，在内质网内其能接受来自TAP复合体的多肽片段，协助将其组装至MHCI类分子，递呈于细胞膜上。不同组织来源的热休克蛋白gp96能携带有其来源组织内特异性表达的多肽片段。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能预防及治疗癌症的靶标蛋白及其多肽的应用方法。本发明首先提供了一种DEF8蛋白，所述DEF8蛋白的氨基酸序列含有如下：i)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；或ii)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列自N端起第2位至最后一位氨基酸序列；或iii)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。本发明提供了上述DEF8蛋白在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。本发明提供了编码DEF8蛋白的基因，该基因的核苷酸序列含有如下：i)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)与SEQIDNO.1所示的核苷酸具有75％及以上同源性的核苷酸序列；或iv)在严格条件下与SEQIDNO.1所示序列杂交的核苷酸序列；所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。本发明提供了编码DEF8蛋白的基因在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。本发明提供了含有编码DEF8蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌、昆虫或酵母。进一步地，本发明提供了上述生物材料在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。所述药物为治疗或预防乳腺癌或肝癌的药物，具有以下至少一种的功能：(1)降低化学物诱导的乳腺癌的发生率；(2)降低化学物诱导的肝癌发生率；(3)减缓或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的生长；(4)减缓或停止已建立的肝癌肿瘤灶的生长；(5)减少或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的转移；(6)减少或停止已建立的肝癌肿瘤灶的转移；(7)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；(8)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。本发明提供了含有DEF8蛋白或其多肽的药物。本发明提供了含有DEF8蛋白与热休克蛋白gp96组成的复合物或含有DEF8蛋白的多肽与热休克蛋白gp96组成的复合物的药物。所述热休克蛋白gp96的氨基酸序列含有SEQIDNO.4所述的序列或SEQIDNO.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。所述热休克蛋白gp96的获得方式为以下任一：(1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；(2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，包括利用酵母、哺乳动物细胞表达体系表达，纯化得到。所述离体哺乳动物可为人、鼠来源。所述鼠包括但不限于C57BL/6及BALB/c小鼠。所述复合物是通过以下方式获得：(1)将DEF8蛋白或其多肽与热休克蛋白gp96在体外以自然吸附或热击方式形成复合物；或(2)将编码DEF8蛋白或其多肽与编码热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养、纯化获得复合物。所述“将编码DEF8蛋白或其多肽与编码热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过汉逊酵母表达。所述“将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pFastBac1-gp96。所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为在质粒pFastBac1的多克隆位点插入序列表中SEQIDNO.3所示的DNA分子得到的重组质粒。所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为SEQIDNO.1所示的DNA分子得到的重组质粒。所述受体可为Sf9细胞。本发明提供了上述DEF8蛋白及其多肽与热休克蛋白gp96组成的复合物在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用。所述药物为治疗或预防乳腺癌或肝癌的药物，具有以下至少一种的功能：(1)降低化学物诱导的乳腺癌的发生率；(2)降低化学物诱导的肝癌发生率；(3)减缓或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的生长；(4)减缓或停止已建立的肝癌肿瘤灶的生长；(5)减少或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的转移；(6)减少或停止已建立的肝癌肿瘤灶的转移；(7)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；(8)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。应用本发明的上述药物，针对免疫对象，免疫剂量为每次不少于10μg，总共不少于3次，采取皮下注射、皮内注射或腹腔注射方式进行免疫。本发明的药物(疫苗)免疫数周后，可引发机体的特异免疫反应，清除体内肿瘤干细胞和/或肿瘤休眠细胞，以及癌变的细胞，从而达到预防和治疗癌症的目的。本发明可作为肿瘤预防性疫苗，用于自体或异体肿瘤防治，降低健康人群中癌症的发生率，也可作为肿瘤治疗性疫苗，患者术后即时施治能有效防转移防复发，或作为化学疗法的辅助治疗。本发明的也可以用于异体肿瘤的免疫防治。附图说明图1为胎盘gp96的SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果。图2为酵母表达gp96的SDS-PAGE和WesternBlot鉴定结果，图中，1：分子量标准；2：步骤2的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：westernblot鉴定图。图3为昆虫表达gp96的SDS-PAGE和WesternBlot的鉴定结果。图4为多肽-gp96复合物对乳腺癌的治疗作用(肿瘤体积)。图5为多肽-gp96复合物对肝癌的治疗作用(肿瘤体积)。图6为多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳腺癌细胞杀伤作用。图7位多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳肝癌细胞杀伤作用。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。雌性C57BL/6与雌性BALB/C小鼠为北京维通利华实验动物有限责任公司产品；在下文中简称小鼠。多肽由上海吉尔生化有限公司合成。HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HB-8065TM。MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HTB-22TM。H22及HHCC细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，资源号分别为3111C0001CCC000309、3111C0002000000069。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。CellfectinIIreagent为Lifetechnologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBacTM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为SantaCruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-QSepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex20010/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。BSA、PMSF、NaHCO3、MnCl2、CaCl2、NaCl2、Tris、甲基α-D-吡喃甘露糖苷均为Sigma-Aldrich公司产品，产品目录号分别为V900933、P7626、792519、V900197、793639、746398、T1378、M6882。溶液A：溶质及其浓度为PMSF1mM和NaHCO330mM；溶剂为蒸馏水；pH值为7.4。溶液B：溶质及其浓度为2mMMnCl2、2mMCaCl2、500mMNaCl和PMSF1mM；溶剂为pH7.4、20mMTris-HCl缓冲液。溶液C：溶质及其浓度为10％(质量体积比)甲基α-D-吡喃甘露糖苷、500mMNaCl和1mMPMSF；溶剂为pH7.4、20mMTris-HCl缓冲液。清洗液：用蒸馏水将溶液B稀释至10倍体积。ConA琼脂糖凝胶柱为GE公司产品，产品目录号为17-0440-01，该柱的规格为1.6×2.5cm，填充介质为ConA-Sepharose4B。HitrapQ阴离子交换柱为GE公司产品，产品目录号为17-1153-01，该柱的规格为0.7×2.5cm。HRP标记的IgG抗体为SEROTEC公司产品，产品目录号为STAR117P。1×洗涤液为含0.1％(体积百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/LPBS缓冲液。50kD与3kD超滤管为MerckMillipore公司产品，产品目录号分别为UFC905096、UFC500324。实施例1胎盘中gp96的提取组织中热休克蛋白gp96(以下简称pgp96)的提取步骤如下：(1)分离分娩前的小鼠的胎盘组织，得到小鼠离体胎盘组织。取小鼠离体胎盘组织或人离体胎盘组织，剪碎，按质量体积比1g：4mL加入溶液A，然后用玻璃匀浆器磨碎。(2)完成步骤(1)后，16500g离心1h，得到上清液甲。(3)完成步骤(2)后，取上清液甲，16500g离心50min，得到上清液乙。(4)完成步骤(3)后，取上清液乙，按体积比9：1加入溶液B，混匀后得到上样液。(5)完成步骤(4)后，将上样液上样至ConA琼脂糖凝胶柱。(6)完成步骤(5)后，用清洗液洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm，直至洗脱产物的紫外吸收值低于0.01。(7)完成步骤(6)后，用溶液C洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，弃去首先流出的过柱后溶液0.5个柱体积，然后收集之后流出的过柱后溶液1个柱体积；将所述ConA琼脂糖凝胶柱孵育50min后，再收集过柱后溶液1.5个柱体积。将两次收集的过柱后溶液合并，即为ConA洗脱液。(8)完成步骤(7)后，将ConA洗脱液上样至HitrapQ阴离子交换柱。(9)完成步骤(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min。梯度洗脱程序：在pH7.412mM的PBS缓冲液中使NaCl含量由300mM匀速增至800mM，线性梯度洗脱20个柱体积。收集合并NaCl含量为400～450mM的洗脱液，即为洗脱液甲。(10)完成步骤(9)后，取洗脱液甲，用超滤管进行超滤浓缩，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96浓度为5mg/mL。将pgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot(以gp96单克隆抗体作为一抗，HRP标记的IgG抗体作为二抗)，实验结果见图1(箭头所指为pgp96)。结果表明，pgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa。实施例2利用汉逊酵母表达的重组gp96蛋白制备一、重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建1、提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。2、以步骤1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。PCR引物如下：Fp(5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3')Rp(5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3')3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号为V20520)，回收载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96并测序。测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码序列。二、gp96蛋白的表达1、采用电转化法将步骤1得到的重组质粒pHFMDZ-R1-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号为MYA-335)细胞，得到重组菌。2、将重组菌接种于5mLSD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12117.7)，37℃培养48h，然后转接到100mLSYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12116.1)，30℃培养48h，得到种子培养液。3、将两瓶种子培养液接种于含有2LSYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养。使用氨水控制pH维持在5.5，每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上。根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组gp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵，得到发酵液。三、gp96蛋白的分离纯化将步骤2得到的发酵液离心，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILLmodelKDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞，破碎后的细胞12000rpm/min离心20min，收集上清液。上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液。将滤液进行浓缩，得到浓缩液。将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(InvitrogenCorporation)的Ni-NTAPurificationSystem进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h。将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后上样，用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值<0.01，用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液。所有操作均在4℃下进行，流速为0.5mL/min。每升步骤2得到的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液再进行离子交换层析，主要步骤为：200mMNaCl的PBS液平衡柱子，上样，300mMNaCl的PBS液洗杂质，800mMNaCl的PBS液洗脱目的蛋白。将步骤2的发酵液、亲和层析后的洗脱液和离子交换层析后的洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色。将gp96蛋白进行westernblot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santacruz，产品号为sc-56399)，结果见图2。图2显示，离子交换层析后的洗脱液中的gp96蛋白纯度很高。实施例3昆虫细胞表达的重组热休克蛋白gp96的制备一、重组质粒pFastBacTM1-gp96的构建1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。2、根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoRⅠ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ识别序列)。3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。4、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒pFastBacTM1，回收约4700bp的载体骨架。6、将酶切产物与载体骨架连接，得到连接产物。7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac1-gp96。根据测序结果对重组质粒pFastBac1-gp96进行结构描述如下：将质粒pFastBac1的EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中SEQIDNO.3所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac1-gp96表达重组热休克蛋白gp96(以下简称rgp96)，rgp96的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。二、rgp96的表达1、将步骤一构建的重组质粒pFastBac1-gp96共转染Sf9细胞(每1×106个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac1-gp96；共转染过程中，转染试剂为CellfectinIIreagent，培养基为Insect-XPRESSTMProtein-freeInsectCellsmediumwithL-Glutamine，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。2、将Sf9细胞悬浮液1(含1×108个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×108个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行western杂交，western杂交具体步骤参考如下文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5。western杂交实验结果表明，rgp96在Sf9细胞中表达。三、rgp96的纯化1、向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×108个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。2、取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。3、取所述上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。4、将所述上样液上样于HiTrap-QSepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所述浓缩液即含有rgp96。5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex20010/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到rgp96的溶液。采用BCA法测定rgp96的溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。将步骤5得到的rgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图3(泳道由左到右分别为高分子量标准蛋白质和rgp96)。将步骤5得到的重组热休克蛋白gp96的溶液进行Westernblot(以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图3。结果表明，rgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量与预期一致。实施例4DEF8多肽与胎盘gp96结合的复合物制备与鉴定一、小鼠胎盘gp96结合的多肽鉴定1、多肽洗脱：取5mg实施例1提取的浓度为10mg/mL小鼠胎盘pgp96，加入5μL含有20％(体积比)三氟乙酸的水溶液，4℃中孵育1h。2、将步骤1中的孵育液加入3kD超滤管中，12,000rpm离心30min，取穿透液。3、将步骤2中的穿透液注入Agilent1200高压液相色谱仪进行脱盐纯化(色谱柱型号SB-C182.1mm×250mm)，程序如下：A相：5％(体积比)乙腈水溶液，含0.1％三氟乙酸；B相：乙腈，含0.1％三氟乙酸；0-30min100％A，30-70min100％B。4、收集步骤3中30-70分钟的洗脱液，冻干。5、将步骤4的冻干粉末用0.1％(体积比)的甲酸水溶液重溶，注入OrbitrapFusion高分辨率质谱仪，分析多肽序列，并从数据库中进行匹配。匹配结果见表1。表1与小鼠胎盘gp96结合的蛋白多肽匹配结果二、DEF8多肽-gp96复合物制备1、将表1得到的DEF8蛋白结果氨基酸序列输入该网址http://tools.immuneepitope.org/mhci/进行MHCI类分子的表位预测，分别选取最优的H-2Kd、H-2Kb及HLA-A2限制性表位并化学合成，预测HLA-A2表位时所选用的氨基酸序列应为人类中的同源蛋白。表位筛选结果见表2。表2DEF8蛋白多肽的表位筛选结果MHCI限制型多肽序列多肽位置H-2KdRYLALMVSRPVL273-284H-2KbCSMRYLAL270-277HLA-A2LLFNYVEELVEI292-3032、分别化学合成以上多肽(上海吉尔生化有限公司)，将合成的多肽用细胞级DMSO(Sigma-Aldrich公司，目录号D2650)复溶为20mg/mL浓度，分别取1mg多肽与1mg实施例3中制备的重组rgp96，用pH7.40.01mol/LPBS缓冲液稀释至4mL体积。55℃热击10分钟，在室温冷却30分钟。然后采用50kD超滤管洗去未结合的多肽，分别制备获得不同限制性表位的DEF8多肽-gp96复合物。实施例5DEF8多肽-gp96复合物对乳腺癌的预防与治疗作用一、DEF8多肽-gp96复合物对原发性乳腺癌的预防作用取8周龄C57BL/6小鼠20只分成两组，每组10只，分别进行如下处理：第一组：腹部皮下注射实施例4制备的DEF8多肽(H-2Kb)-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；第二组：腹部皮下注射实施例3制备的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；以上两组中：实验第1天进行第一次免疫；第8天进行第二次免疫；第22天进行第三次免疫。免疫完成后1周开始每只小鼠按50mg/kg剂量口服灌胃食用橄榄油配制的DMBA(Sigma-Aldrich公司，目录号D3254)溶液，每周1次，连续5周，诱导乳腺癌发病。自有小鼠产生乳腺癌肿瘤开始(约造模后14周左右)每周检测肿瘤生长，并统计肿瘤发生率与计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式V＝ab2/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。一直观察到34周，计算肿瘤发生率、肿瘤个数与平均肿瘤大小。统计结果见表3。从结果可以看出，DEF8多肽-gp96复合物对DMBA诱导的乳腺癌有明显的预防作用。免疫DEF8多肽-gp96复合物后乳腺癌的发病率明显降低，发病时间推迟，肿瘤个数及肿瘤体积均减小。表3DMBA诱导的小鼠乳腺癌肿瘤统计结果二、DEF8多肽-gp96复合物对诱导乳腺癌模型的治疗作用取20只6-8周的雌性Balb/c小鼠，每只皮下分别接种6×105TUBO细胞，第2天将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：第一组：腹部皮下注射实施例4制备的DEF8多肽(H-2Kd)-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；第二组：腹部皮下注射实施例3制备的gp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；以上两组中：接种肿瘤细胞后第2天进行第一次免疫；第5天进行第二次免疫；第8天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab2/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图4。从结果可以看出，DEF8多肽-gp96复合物对皮下接种的诱导型乳腺癌模型有明显的治疗作用。DEF8多肽-gp96复合物治疗后皮下肿瘤的生长速度明显减慢，肿瘤体积变小。实施例6DEF8多肽-gp96复合物对肝癌的预防与治疗作用一、DEF8多肽-gp96复合物对原发性肝癌的预防作用取20只6周龄雌性C57BL/6小鼠，平均分为两组，每组10只，分别进行如下处理：第一组：腹部皮下注射实施例4制备的DEF8多肽(H-2Kb)-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；第二组：腹部皮下注射实施例3制备的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；以上两组中：实验第1天进行第一次免疫；第8天进行第二次免疫；第22天进行第三次免疫。最后一次免疫结束后1周，将两组小鼠每日饮水换为含30μg/mLDEN(Sigma-Aldrich公司，目录号73861)的无菌蒸馏水，连续饲养40周，至第40周时处死小鼠，取出肝脏进行比较分析比较。比较结果见表4。从结果可以看出，DEF8多肽-gp96复合物对DEN诱导的肝癌有明显的预防作用。免疫DEF8多肽-gp96复合物后肝癌的发病率明显降低，发病时间推迟，肿瘤个数及肿瘤体积均减小。表4DEN诱导的小鼠肝癌统计结果二、DEF8多肽-gp96复合物对诱导肝癌模型的治疗作用将液氮冻存的小鼠肝癌H22细胞于37℃水浴锅中快速解冻，细胞密度调至1×107/mL，腹腔接种2只BALB/c小鼠，每只0.2mL。待小鼠腹部胀大后，将小鼠颈椎脱臼处死，消毒腹部，抽取腹水合并，用PBS调整细胞密度至1×107/mL，皮下接种20只BALB/c小鼠，每只0.2mL。12天后将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：第一组：腹部皮下注射实施例4制备的DEF8多肽(H-2Kd)-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；第二组：腹部皮下注射实施例3制备的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；以上两组中：接种肿瘤细胞后第12天进行第一次免疫；第15天进行第二次免疫；第18天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab2/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图5。从结果可以看出，DEF8多肽-gp96复合物对皮下接种的诱导型肝癌模型有明显的治疗作用。DEF8多肽-gp96复合物治疗后皮下肿瘤的生长速度明显减慢，肿瘤体积变小。实施例7DEF8多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳腺癌细胞杀伤效应一、人源多肽特异性效应细胞的制备1、使用人淋巴细胞分离液(Cellgro,25-072-CI)分离HLA-A2阳性志愿者的抗凝新鲜全血，获得外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％胎牛血清(Gibco，10099-141-FBS)的RPMI-1640完全培养基(Gibco，12633012)调整细胞浓度为1.0X106/ml，接种于24孔板，每孔1ml。2、次日每组分别加入DEF8多肽(HLA-A2)-gp96复合物至终浓度为10μg/ml。3、第三天每孔加入IL-2(PeproTech公司，目录号212-12)至终浓度为50U/ml，每2-3天半量换液并补充IL-2至终浓度为50U/ml。4、分别于第七天、第十四天进行第二轮、第三轮DEF8多肽-gp96复合物刺激，次日加入IL-2至终浓度为50U/ml。5、第三轮刺激后3天，得到人源多肽效应细胞CTL。二、靶细胞：人乳腺癌细胞系MCF-7(HLA-A2表达阳性)，多肽孵育的T2细胞(HLA-A2表达阳性)、T2细胞。三、乳腺癌细胞特异性杀伤效应的检测：使用非放射性细胞毒性检测(Promega，目录号G1780)进行细胞毒活性检测，主要步骤如下(详见试剂盒使用说明书)：1、以MCF-7细胞、多肽孵育的T2细胞、Τ2细胞作为靶细胞，接种靶细胞数目为5×103/孔，按照效靶比10:1的比例加入上述效应细胞，效应细胞以50μ1/孔接种于96孔培养板中，终体积100μ1；此外另设效应细胞自发LDH释放组，用来校准效应细胞自发释放出来的LDH(各组效应细胞以50μ1/孔加入96孔板，补充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终体积100μ1；)。靶细胞自发LDH释放组，用来校正靶细胞自发释放出来的LDH(各组靶细胞以50μ1/孔加入96孔板，补充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终浓度100μ1；)。靶细胞最大LDH释放组,用来计算时作为确定100％的LDH释放的参照(细胞上样同靶细胞自发释放组；)。体积校正对照组，用来校正由于加入裂解液引起的体积变化(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基100μ1；)。培养基背景对照组，用来校正由培养基中血清产生的LDH活性以及酚红造成的背景吸收(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基100μ1；)。2、细胞接种后，使用250g离心4min，接着于37℃培养箱中孵育4h；在收获上清前45min，向靶细胞最大LDH释放组中加入裂解液(10×)，10μ1/孔；接着使用250g离心4min，收获上清；3、转移50μ1上清至酶标板中，用检测缓冲液配制底物，把配好的底物50μ1/孔加到酶标板中，盖好平板，室温避光反应30min，向每空加入50μ1终止液，1h内于酶标仪检测490nm吸光值OD。4、计算细胞杀伤率杀伤率(％)＝[(实验组OD值-效应细胞自发释放组OD值-靶细胞自发释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自发释放组OD值)]×100％细胞杀伤结果见图6。结果表明DEF8多肽-gp96复合物可以从人的外周血淋巴细胞(PBMC)中诱导出表位特异性的细胞毒性T细胞(CTL)，该细胞可对人乳腺癌细胞MCF-7杀伤，表明DEF8多肽-gp96复合物有预防和治疗人乳腺癌的能力。实施例8DEF8多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人肝癌细胞杀伤效应一、人源多肽特异性效应细胞的制备：DEF8多肽(HLA-A2)-gp96复合物诱导的特异性CTL制备方法同实施例7，用含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。二、靶细胞：人肝癌细胞HHCC(HLA-A2表达阳性)，多肽孵育的T2细胞(HLA-A2表达阳性)、T2细胞三、肝癌细胞特异性杀伤效应的检测：检测方法同实施例7，将靶细胞换为人肝癌细胞HHCC，实验组按效靶比10:1的比例加入效应细胞与靶细胞，同时设立效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、背景对照组、体积校正对照组。37℃条件下孵育4h后加入细胞裂解液，收获上清做LDH检测。细胞杀伤结果见图7。结果表明DEF8多肽-gp96复合物可以从人的外周血淋巴细胞(PBMC)中诱导出表位特异性的细胞毒性T细胞(CTL)，该细胞可对人肝癌细胞HHCC杀伤，表明DEF8多肽-gp96复合物有预防和治疗人肝癌的能力。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。SEQUENCELISTING<110>北京热休生物技术有限公司<120>DEF8蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用<130>KHP171110225.0<160>11<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1536<212>DNA<213>DEF8蛋白<400>1atggccatcctgtccctgcgagcccctgggccctggcaggcgatgcaggtatgggcagac60aggacgctgttgactccgcacaccggggtgacttctcaggttctcggggtggcagctgca120gtgatgacaccgcttcctggtggtcacgccgcgggcaggacgcgggaggccaggtgggat180gctatggaatatgatgagaagctggcccgtttccggcaggcccacctcaaccccttcaac240aagcagtctgggccgagacagcatgagcagggccctggggaggaggtcccggacgtcact300cctgaagaggccctgcctgagctgccccctggggagccggaattccgctgccctgaacgc360gtgatggatctcggcctgtctgaggaccacttctcccgccctgtgggtctgttcctggcc420tctgacgtccagcagctgcggcaggcgatcgaggagtgcaagcaggtgattctggagctg480cccgagcagtcggagaagcagaaggatgccgtggtgcgactcatccacctccggctgaag540ctccaggagctgaaggaccccaatgaggatgagccaaacatccgagtgctccttgagcac600cgcttttacaaggagaagagcaagagcgtcaagcagacctgtgacaagtgtaacaccatc660atctgggggctcattcagacctggtacacctgcacagggtgttattaccgctgtcacagt720aagtgcttgaacctcatctccaagccctgtgtgagctccaaagtcagccaccaagctgaa780tacgaactgaacatctgccctgagacagggctggacagccaggattaccgctgtgccgag840tgccgggcgcccatctctctgcggggtgtgcccagtgaggccaggcagtgcgactacacc900ggccagtactactgcagccactgccactggaacgacctggctgtgatccctgcacgcgtt960gtacacaactgggactttgagcctcgaaaggtttctcgctgcagcatgcgctacctggcg1020ctgatggtgtctcggcccgtactcaggctccgggagatcaaccctctgctgttcagctac1080gtggaggagctggtggagattcgcaagctgcgccaggacatcctgctcatgaagccgtac1140ttcatcacctgcagggaggccatggaggctcgtctgctgctgcagctccaggatcggcag1200cattttgtggagaacgacgagatgtactctgtccaggacctcctggacgtgcatgccggc1260cgcctgggctgctcgctcaccgagatccacacgctcttcgccaagcacatcaagctggac1320tgcgagcggtgccaggccaagggcttcgtgtgtgagctctgcagagagggcgacgtgctg1380ttcccgttcgacagccacacgtctgtgtgcgccgactgctccgcggtcttccacagggac1440tgctactacgacaactccaccacttgtcccaagtgtgcccggctcagcctgaggaagcag1500tcgctcttccaggagccaggtcccgatgtggaggcc1536<210>2<211>512<212>PRT<213>DEF8蛋白<400>2MetAlaIleLeuSerLeuArgAlaProGlyProTrpGlnAlaMetGln151015ValTrpAlaAspArgThrLeuLeuThrProHisThrGlyValThrSer202530GlnValLeuGlyValAlaAlaAlaValMetThrProLeuProGlyGly354045HisAlaAlaGlyArgThrArgGluAlaArgTrpAspAlaMetGluTyr505560AspGluLysLeuAlaArgPheArgGlnAlaHisLeuAsnProPheAsn65707580LysGlnSerGlyProArgGlnHisGluGlnGlyProGlyGluGluVal859095ProAspValThrProGluGluAlaLeuProGluLeuProProGlyGlu100105110ProGluPheArgCysProGluArgValMetAspLeuGlyLeuSerGlu115120125AspHisPheSerArgProValGlyLeuPheLeuAlaSerAspValGln130135140GlnLeuArgGlnAlaIleGluGluCysLysGlnValIleLeuGluLeu145150155160ProGluGlnSerGluLysGlnLysAspAlaValValArgLeuIleHis165170175LeuArgLeuLysLeuGlnGluLeuLysAspProAsnGluAspGluPro180185190AsnIleArgValLeuLeuGluHisArgPheTyrLysGluLysSerLys195200205SerValLysGlnThrCysAspLysCysAsnThrIleIleTrpGlyLeu210215220IleGlnThrTrpTyrThrCysThrGlyCysTyrTyrArgCysHisSer225230235240LysCysLeuAsnLeuIleSerLysProCysValSerSerLysValSer245250255HisGlnAlaGluTyrGluLeuAsnIleCysProGluThrGlyLeuAsp260265270SerGlnAspTyrArgCysAlaGluCysArgAlaProIleSerLeuArg275280285GlyValProSerGluAlaArgGlnCysAspTyrThrGlyGlnTyrTyr290295300CysSerHisCysHisTrpAsnAspLeuAlaValIleProAlaArgVal305310315320ValHisAsnTrpAspPheGluProArgLysValSerArgCysSerMet325330335ArgTyrLeuAlaLeuMetValSerArgProValLeuArgLeuArgGlu340345350IleAsnProLeuLeuPheSerTyrValGluGluLeuValGluIleArg355360365LysLeuArgGlnAspIleLeuLeuMetLysProTyrPheIleThrCys370375380ArgGluAlaMetGluAlaArgLeuLeuLeuGlnLeuGlnAspArgGln385390395400HisPheValGluAsnAspGluMetTyrSerValGlnAspLeuLeuAsp405410415ValHisAlaGlyArgLeuGlyCysSerLeuThrGluIleHisThrLeu420425430PheAlaLysHisIleLysLeuAspCysGluArgCysGlnAlaLysGly435440445PheValCysGluLeuCysArgGluGlyAspValLeuPheProPheAsp450455460SerHisThrSerValCysAlaAspCysSerAlaValPheHisArgAsp465470475480CysTyrTyrAspAsnSerThrThrCysProLysCysAlaArgLeuSer485490495LeuArgLysGlnSerLeuPheGlnGluProGlyProAspValGluAla500505510<210>3<211>2409<212>DNA<213>热休克蛋白gp96<400>3atgagggccctgtgggtgctgggcctctgctgcgtcctgctgaccttcgggtcggtcaga60gctgacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa120ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatgga180ttaaatgcatcacaaataagagaacttagagagaagtcggaaaagtttgccttccaagcc240gaagttaacagaatgatgaaacttatcatcaattcattgtataaaaataaagagattttc300ctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagataagataaggctaatatcactg360actgatgaaaatgctctttctggaaatgaggaactaacagtcaaaattaagtgtgataag420gagaagaacctgctgcatgtcacagacaccggtgtaggaatgaccagagaagagttggtt480aaaaaccttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaa540gcacaggaagatggccagtcaacttctgaattgattggccagtttggtgtcggtttctat600tccgccttccttgtagcagataaggttattgtcacttcaaaacacaacaacgatacccag660cacatctgggagtctgactccaatgaattttctgtaattgctgacccaagaggaaacact720ctaggacggggaacgacaattacccttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaa780ttggatacaattaaaaatctcgtcaaaaaatattcacagttcataaactttcctatttat840gtatggagcagcaagactgaaactgttgaggagcccatggaggaagaagaagcagccaaa900gaagagaaagaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaagaagaagaagaaaagaaa960ccaaagactaaaaaagttgaaaaaactgtctgggactgggaacttatgaatgatatcaaa1020ccaatatggcagagaccatcaaaagaagtagaagaagatgaatacaaagctttctacaaa1080tcattttcaaaggaaagtgatgaccccatggcttatattcactttactgctgaaggggaa1140gttaccttcaaatcaattttatttgtacccacatctgctccacgtggtctgtttgacgaa1200tatggatctaaaaagagcgattacattaagctctatgtgcgccgtgtattcatcacagac1260gacttccatgatatgatgcctaaatacctcaattttgtcaagggtgtggtggactcagat1320gatctccccttgaatgtttcccgcgagactcttcagcaacataaactgcttaaggtgatt1380aggaagaagcttgttcgtaaaacgctggacatgatcaagaagattgctgatgataaatac1440aatgatactttttggaaagaatttggtaccaacatcaagcttggtgtgattgaagaccac1500tcgaatcgaacacgtcttgctaaacttcttaggttccagtcttctcatcatccaactgac1560attactagcctagaccagtatgtggaaagaatgaaggaaaaacaagacaaaatctacttc1620atggctgggtccagcagaaaagaggctgaatcttctccatttgttgagcgacttctgaaa1680aagggctatgaagttatttacctcacagaacctgtggatgaatactgtattcaggccctt1740cccgaatttgatgggaagaggttccagaatgttgccaaggaaggagtgaagttcgatgaa1800agtgagaaaactaaggagagtcgtgaagcagttgagaaagaatttgagcctctgctgaat1860tggatgaaagataaagcccttaaggacaagattgaaaaggctgtggtgtctcagcgcctg1920acagaatctccgtgtgctttggtggccagccagtacggatggtctggcaacatggagaga1980atcatgaaagcacaagcgtaccaaacgggcaaggacatctctacaaattactatgcgagt2040cagaagaaaacatttgaaattaatcccagacacccgctgatcagagacatgcttcgacga2100attaaggaagatgaagatgataaaacagttttggatcttgctgtggttttgtttgaaaca2160gcaacgcttcggtcagggtatcttttaccagacactaaagcatatggagatagaatagaa2220agaatgcttcgcctcagtttgaacattgaccctgatgcaaaggtggaagaagagcccgaa2280gaagaacctgaagagacagcagaagacacaacagaagacacagagcaagacgaagatgaa2340gaaatggatgtgggaacagatgaagaagaagaaacagcaaaggaatctacagctgaaaaa2400gatgaattg2409<210>4<211>803<212>PRT<213>热休克蛋白gp96<400>4MetArgAlaLeuTrpValLeuGlyLeuCysCysValLeuLeuThrPhe151015GlySerValArgAlaAspAspGluValAspValAspGlyThrValGlu202530GluAspLeuGlyLysSerArgGluGlySerArgThrAspAspGluVal354045ValGlnArgGluGluGluAlaIleGlnLeuAspGlyLeuAsnAlaSer505560GlnIleArgGluLeuArgGluLysSerGluLysPheAlaPheGlnAla65707580GluValAsnArgMetMetLysLeuIleIleAsnSerLeuTyrLysAsn859095LysGluIlePheLeuArgGluLeuIleSerAsnAlaSerAspAlaLeu100105110AspLysIleArgLeuIleSerLeuThrAspGluAsnAlaLeuSerGly115120125AsnGluGluLeuThrValLysIleLysCysAspLysGluLysAsnLeu130135140LeuHisValThrAspThrGlyValGlyMetThrArgGluGluLeuVal145150155160LysAsnLeuGlyThrIleAlaLysSerGlyThrSerGluPheLeuAsn165170175LysMetThrGluAlaGlnGluAspGlyGlnSerThrSerGluLeuIle180185190GlyGlnPheGlyValGlyPheTyrSerAlaPheLeuValAlaAspLys195200205ValIleValThrSerLysHisAsnAsnAspThrGlnHisIleTrpGlu210215220SerAspSerAsnGluPheSerValIleAlaAspProArgGlyAsnThr225230235240LeuGlyArgGlyThrThrIleThrLeuValLeuLysGluGluAlaSer245250255AspTyrLeuGluLeuAspThrIleLysAsnLeuValLysLysTyrSer260265270GlnPheIleAsnPheProIleTyrValTrpSerSerLysThrGluThr275280285ValGluGluProMetGluGluGluGluAlaAlaLysGluGluLysGlu290295300GluSerAspAspGluAlaAlaValGluGluGluGluGluGluLysLys305310315320ProLysThrLysLysValGluLysThrValTrpAspTrpGluLeuMet325330335AsnAspIleLysProIleTrpGlnArgProSerLysGluValGluGlu340345350AspGluTyrLysAlaPheTyrLysSerPheSerLysGluSerAspAsp355360365ProMetAlaTyrIleHisPheThrAlaGluGlyGluValThrPheLys370375380SerIleLeuPheValProThrSerAlaProArgGlyLeuPheAspGlu385390395400TyrGlySerLysLysSerAspTyrIleLysLeuTyrValArgArgVal405410415PheIleThrAspAspPheHisAspMetMetProLysTyrLeuAsnPhe420425430ValLysGlyValValAspSerAspAspLeuProLeuAsnValSerArg435440445GluThrLeuGlnGlnHisLysLeuLeuLysValIleArgLysLysLeu450455460ValArgLysThrLeuAspMetIleLysLysIleAlaAspAspLysTyr465470475480AsnAspThrPheTrpLysGluPheGlyThrAsnIleLysLeuGlyVal485490495IleGluAspHisSerAsnArgThrArgLeuAlaLysLeuLeuArgPhe500505510GlnSerSerHisHisProThrAspIleThrSerLeuAspGlnTyrVal515520525GluArgMetLysGluLysGlnAspLysIleTyrPheMetAlaGlySer530535540SerArgLysGluAlaGluSerSerProPheValGluArgLeuLeuLys545550555560LysGlyTyrGluValIleTyrLeuThrGluProValAspGluTyrCys565570575IleGlnAlaLeuProGluPheAspGlyLysArgPheGlnAsnValAla580585590LysGluGlyValLysPheAspGluSerGluLysThrLysGluSerArg595600605GluAlaValGluLysGluPheGluProLeuLeuAsnTrpMetLysAsp610615620LysAlaLeuLysAspLysIleGluLysAlaValValSerGlnArgLeu625630635640ThrGluSerProCysAlaLeuValAlaSerGlnTyrGlyTrpSerGly645650655AsnMetGluArgIleMetLysAlaGlnAlaTyrGlnThrGlyLysAsp660665670IleSerThrAsnTyrTyrAlaSerGlnLysLysThrPheGluIleAsn675680685ProArgHisProLeuIleArgAspMetLeuArgArgIleLysGluAsp690695700GluAspAspLysThrValLeuAspLeuAlaValValLeuPheGluThr705710715720AlaThrLeuArgSerGlyTyrLeuLeuProAspThrLysAlaTyrGly725730735AspArgIleGluArgMetLeuArgLeuSerLeuAsnIleAspProAsp740745750AlaLysValGluGluGluProGluGluGluProGluGluThrAlaGlu755760765AspThrThrGluAspThrGluGlnAspGluAspGluGluMetAspVal770775780GlyThrAspGluGluGluGluThrAlaLysGluSerThrAlaGluLys785790795800AspGluLeu<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>5ccggaattcatggacgatgaagttgatg28<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>6ccgctcgagctattagaattcatctttttcagctgtag38<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7ggaattcatggacgatgaagttgat25<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8gctctagactattagaattcatctttttc29<210>9<211>12<212>PRT<213>H-2Kd<400>9ArgTyrLeuAlaLeuMetValSerArgProValLeu1510<210>10<211>8<212>PRT<213>H-2Kb<400>10CysSerMetArgTyrLeuAlaLeu15<210>11<211>12<212>PRT<213>HLA-A2<400>11LeuLeuPheAsnTyrValGluGluLeuValGluIle1510当前第1页1 2 3