抗凝缓释材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗体领域，特别地，涉及一种抗凝缓释材料。此外，本发明还涉及一种抗凝缓释材料的制备方法及应用。
背景技术：
：近年来，由于体外循环管路和人工心肺的发展和改进，抗凝缓释涂层技术备受关注。华法林涂层是利用物理或者化学的方式，将华法林牢固的结合在管路的内表面或者人工心肺的表面。抗凝涂层的应用能明显提高材料的生物和血液相容性，减低炎症反应，降低血液及血流损害，可降低心脏外科手术术后住院时间和死亡率，提高了危重心肺疾病的治愈率，为材料的推广提供了基础和条件。目前临床上使用的抗凝涂层依赖进口，价格昂贵，病人负担重，也限制了使用。我们亟需开发自己的抗凝缓释涂层。技术实现要素：本发明提供了一种氧化石墨烯修饰的华法林，以解决现有的抗凝涂层价格昂贵的技术问题。本发明采用的技术方案如下：本发明一方面提供了一种抗凝缓释材料，抗凝缓释材料包括氧化石墨烯修饰的华法林，氧化石墨烯修饰的华法林包括华法林和氧化石墨烯，华法林和氧化石墨烯通过非共价键连接，氧化石墨烯为二维纳米氧化石墨烯或膜状氧化石墨烯。进一步地，氧化石墨烯和华法林的质量比为1:5～20。进一步地，氧化石墨烯为粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯。本发明另一方面提供了一种上述的抗凝缓释材料的制备方法，包括以下步骤：将华法林、氧化石墨烯加入体积百分数为10～50％的水中，在4～40℃下震荡摇匀，反应8～12小时得到抗凝缓释材料。进一步地，水的体积百分数为10％，水的用量为1mg氧化石墨烯加入0.5～1.5ml水，优选为1ml水。进一步地，反应温度为37℃，反应时间为12～24小时，优选为12小时。进一步地，氧化石墨烯为粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯，二维纳米氧化石墨烯的制备包括以下步骤：将氧化石墨烯原材料在0～4℃的条件下，通过超声波破碎，经过孔径0.22μm的滤网过滤，得到氧化石墨烯。进一步地，超声波破碎的操作包括以下步骤：将氧化石墨烯原材料配置为1～2mg/ml，在超声波的强度为3.5的条件下，超声2小时，超声模式为工作10秒，休息5秒。本发明还提供了一种抗凝缓释材料在生物材料中的应用。进一步地，抗凝缓释材料形成抗凝缓释层，并设置于人工心肺的表面或体外循环管路的内表面。本发明具有以下有益效果：上述抗凝缓释材料，华法林和氧化石墨烯通过非共价键连接，可大幅度的增强抗凝血性能，同时原料成本低廉，因此抗凝缓释材料价格便宜。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1是二维纳米氧化石墨烯/华法林与膜状氧化石墨烯/华法林的大体观对比图；图2是二维纳米氧化石墨烯的不同组别负载时实物图片。a:ti+二维纳米氧化石墨烯/华法林，b:ti+二维纳米氧化石墨烯，c:ti+华法林，d:ti+水；图3是二维纳米氧化石墨烯的不同组别孵育时实物图片。a:ti+水，b:ti+华法林，c:ti+二维纳米氧化石墨烯，d:ti+二维纳米氧化石墨烯/华法林；图4是不同浓度华法林对pt的影响的操作过程；图5是各组中的血清凝固相；图6是华法林的浓度-凝血酶原时间(pt)曲线图；图7是不同组别的凝血酶原时间(pt)柱状图；图8是膜状氧化石墨烯/华法林负载时实物图片；图9是膜状氧化石墨烯/华法林孵育后实物图片；图10是经过不同洗涤次数后的各组凝血酶原时间(pt)曲线图；图11是经过不同洗涤次数后的各组钛板实物图片；a:3次，b:6次；c:9次，d:12次；e:15次。具体实施方式以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。本发明的优选实施例提供了本发明一方面提供了一种抗凝缓释材料，抗凝缓释材料包括氧化石墨烯修饰的华法林，氧化石墨烯修饰的华法林包括华法林和氧化石墨烯，华法林和氧化石墨烯通过非共价键连接，氧化石墨烯为二维纳米氧化石墨烯或膜状氧化石墨烯。氧化石墨烯(go)含有sp2杂化带羟基和羧基的苯环，不仅性质稳定、生物相容性好，还可以通过π键、疏水作用、氢键和离子键与抗体、药物分子、金属离子、荧光基团或者细胞非共价结合。go是其他石墨材料的基本构建块，可以裹成零维的球体，滚成一维的碳纳米管，层叠成三维结构的石墨。纳米材料的概念是指，任何三维结构中，只要有一维达到纳米级就可以称为纳米材料。通常购买(如sigma货号为763705的产品；苏州碳丰石墨烯科技有限公司，单层膜状氧化石墨烯)或一般方法制备的氧化石墨烯，厚度符合纳米级，但是直径较大，不符合纳米级要求。为区别二维纳米氧化石墨烯，将该种氧化石墨烯命名为氧化石墨烯原材料。在氧化石墨烯原材料的基础上，对其进行一步加工，进行破碎，使其厚度及直径均符合纳米级，则得到二维纳米氧化石墨烯。膜状氧化石墨烯为片径为小于200微米，厚度符合纳米级，如sigma货号为763705的氧化石墨烯。膜状氧化石墨烯可作为制备二维纳米氧化石墨烯的原料使用。尽管go可分散于水中，如生理盐水，然而由于盐的电荷屏蔽作用使得go易发生聚集。因此，go的表面修饰势在必行，目前主要分两种：共价和非共价，前者通常是通过氧化石墨烯的非饱和结构破坏而形成的原子掺杂或反应的技术；后者不改变go的自然结构，只通过非共价键，范德华力，电荷吸引，结合更加灵活。本申请中的氧化石墨烯/华法林中，华法林和氧化石墨烯通过非共价键连接，结合灵活，并且可增强华法林的抗凝血性能。本发明具有以下有益效果：上述抗凝缓释材料，华法林和氧化石墨烯通过非共价键连接，可大幅度的增强抗凝血性能，同时原料成本低廉，因此抗凝缓释材料价格便宜。可选地，氧化石墨烯和华法林的质量比为1:5～20。可选地，氧化石墨烯为粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯。二维结构的go的表面比任何其他纳米材料都高出至少4个量级，它的每个原子都暴露在表面，适合于运载药物。因为纳米材料的概念是指，任何三维结构中，只要有一维达到纳米级就可以称为纳米材料。比如未经改良的石墨烯(可购买于sigma)，虽然厚度符合纳米级，但是直径较大，不符合纳米级要求，容易聚集产生沉淀，稳定性较差。二维纳米氧化石墨烯，使得氧化石墨烯/华法林更加适合体外实验和体内试验，尤其是体内试验。二维纳米氧化石墨烯的粒径小于0.22μm。颗粒较大的氧化石墨烯在生理盐溶液下容易发生聚集，生成沉淀，性质不稳定。采用粒径小于0.22μm的氧化石墨烯可在人血清中稳定均匀分散。粒径小于0.22μm的氧化石墨烯可直接购买或将大颗粒的氧化石墨烯破碎制取，如通过超声波破碎制取。二维纳米氧化石墨烯修饰的华法林相比膜状氧化石墨烯修饰的华法林性质更均一，抗凝效果更稳定。本发明另一方面提供了一种抗凝缓释材料的制备方法，包括以下步骤将华法林、氧化石墨烯加入水中，在4～40℃下震荡摇匀，反应8～12小时得到抗凝缓释材料。华法林、氧化石墨烯在振荡摇匀的条件下反应，二者通过非共价键结合得到氧化石墨烯/华法林。制备得到的抗凝缓释材料可从作为溶剂的水中分离出来，也可不予分离仍在水中保持。在上述条件得到的氧化石墨烯/华法林在稀释一倍之后仍具有一定的杀伤效果。反应时间过短，华法林和氧化石墨结合时间不够，导致二者结合量较小，结合不稳定。而反应时间过长，则增加了抗体变异的风险。因此反应时间可优选为2～24小时。可选地，水的用量为1mg氧化石墨烯加入0.5～1.5ml所述水，优选为1ml水。可选地，反应温度为37℃，反应时间为12～24小时，优选为12小时。反应温度选择37℃。该温度也是生理温度，有利于保障体外和体内实验结果的稳定，并为得到体外和体内一致的结果奠定了基础。反应时间为12～24小时，华法林和氧化石墨量大，结合稳定，继续增加反应时间，华法林和氧化石墨结合数量并不会明显增加。考虑到时间成本，反应时间可选优为12小时。可选地，氧化石墨烯为粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯，粒径小于0.22μm的二维纳米氧化石墨烯的制备包括以下步骤：将氧化石墨烯原材料在0～4℃的条件下，通过超声波破碎，经过孔径0.22μm的滤网过滤，得到氧化石墨烯。氧化石墨烯的制备很重要，严格控制大小和厚度。可从sigma购得氧化石墨烯原材料，透析纯化去除酒精。将氧化石墨烯原材料在超声仪下破碎成细小颗粒。然后将经过孔径0.22μm的滤网过滤。可采用全程在冰水混合物中进行操作以保证反应温度在0～4℃的条件。可选地，超声波破碎的操作包括以下步骤：将氧化石墨烯原材料配置为1～2mg/ml，在超声波的强度为3.5的条件下，超声2小时，超声模式为工作10秒，休息5秒。在美国misonix超声波破碎仪sonicator3000，强度3.5，持续超声2小时，模式工作10秒，休息5秒。在该条件下，氧化石墨烯的粒径小于50nm，厚度为1～3nm。未处理的氧化石墨烯原材料和处理后得到的二维纳米氧化石墨烯10μl的区别可参考申请号为201611203531.6的专利申请文件。本发明还提供了一种氧化石墨烯/华法林在生物材料中的应用。如可利用在人工心肺或者其他脏器或者组织的表面、体外循环管路或血管支架上。进一步地，抗凝缓释材料形成抗凝缓释层，并设置于人工心肺的表面或体外循环管路的内表面。抗凝缓释材料可通过涂制的方法在人工心肺的表面或体外循环管路的内表面上形成抗凝缓释涂层，也可采用其它方法形成抗凝缓释层。实施例1购得氧化石墨烯原材料(sigma货号为763705的氧化石墨烯)，透析纯化去除酒精，配制为浓度1mg/ml，在美国misonix超声波破碎仪sonicator3000强度3.5的条件下，持续超声2小时，模式工作10秒，休息5秒。注意全程在冰水混合物中进行。超声结束后，用0.22μm的过滤器过滤，制得二维纳米氧化石墨烯，nanodrop测量最终浓度，冷藏备用。将1mg华法林、0.2mg二维纳米氧化石墨烯加入1ml水中，在4℃下震荡摇匀，反应12小时，得到氧化石墨烯/华法林，参照图1中离心管内悬浊液，即抗凝缓释材料。实施例2和实施例1的区别在于，制备氧化石墨烯/华法林时的温度为37℃。实施例3和实施例1的区别在于，制备氧化石墨烯/华法林时的温度为40℃。实施例4和实施例1的区别在于，制备氧化石墨烯/华法林时的反应时间为2小时。实施例5和实施例1的区别在于，制备氧化石墨烯/华法林时的反应时间为24小时。实施例6实施例6和实施例1的区别在于，sigma购得货号为763705的膜状氧化石墨烯未经破碎处理，直接与华法林进行反应，并且反应过程中未经震荡处理。实施例6的膜状氧化石墨烯/华法林溶液凝固后如图1培养皿中所示。实验数据1、凝血酶原时间检测如图2和图8所示，分别取100μl的氧化石墨烯溶液、实施例1的二维纳米氧化石墨烯/华法林溶液、实施例6的膜状氧化石墨烯/华法林溶液、华法林溶液和水均匀地涂抹在相应的5mm的钛板上，各组在37℃下干燥过夜。再用100μl的双蒸水洗涤，共3次，干燥备用。涂抹过程中，确保涂抹均匀，以确保最终测量时，最大程度地减少干扰和误差。另取钛板不负载任何试剂，进行相同处理，作为空白对照。其中，氧化石墨烯溶液、二维纳米氧化石墨烯/华法林溶液、膜状氧化石墨烯/华法林溶液、华法林溶液的浓度相同，均为华法林为2μg/ml，纳米氧化石墨烯为2μg/ml，膜状氧化石墨烯为2μg/ml。如图3和9所示，各组的钛板中，随着水分蒸发，钛板表面的液体收缩，药物逐步负载至钛板上形成膜状形态得到抗凝缓释层，即为孵育过程。各组的钛板干燥后，在37℃预热3分钟，分别先后加入100μl的新鲜血清，和50μl的pt测试液，混匀，及时，并观察凝固发生的时间。血清凝固后的状态如图4和图5所示。参照图6、7以及表1。表1不同组别的凝血酶原时间表图4和5中为血清凝固状态。从表1中可看出，在ti组(空白对照组)、ti+h2o组(钛板上负载水)、ti+go组(钛板上负载二维纳米氧化石墨烯)、ti+华法林组(钛板上负载华法林)的pt时长相近，在20秒左右。ti+go+华法林组(钛板上负载二维纳米氧化石墨烯/华法林)和ti+膜状go+华法林(钛板上负载膜状氧化石墨烯/华法林)的时长相近，在25秒左右。可见单纯在钛板上负载水、氧化石墨烯和华法林并不能延长pt时间。ti+华法林组不能延长pt时间的原因是华法林与钛板结合不牢固，华法林处于游离状态，在双蒸水洗涤过程中被冲走，导致其不能发挥延长pt时间的作用。二维纳米氧化石墨烯/华法林、膜状氧化石墨烯/华法林不仅明显延长pt时间，增强疗效，更重要的是，上述两组材料的pt时间在安全范围之内，没有超过30，当pt时间超过30时，使用者会有自发出血的风险，本发明的抗凝缓释材料可以安全有效的使用。上述两组在双蒸水洗涤3次后，仍可起到延长pt时间的作用，这一方面说明华法林已牢固的负载在钛板上，另一方面也可在一定程度上说明二维纳米氧化石墨烯/华法林、膜状氧化石墨烯/华法林具有缓释性。如华法林释放很快，则在双蒸水洗涤过程中，华法林已释放完全，没有华法林可与血清结合发挥作用；如氧化石墨烯将华法林紧密包裹，华法林释放很慢，没有游离的华法林与血清结合发挥作用，也无法达到延长pt时间的作用。2、单纯华法林的浓度-凝血酶原时间(pt)曲线取100μl华法林配置7个梯度的华法林溶液，各梯度的华法林溶液的溶度为0.0002μg/ml、0.002μg/ml、0.02μg/ml、0.2μg/ml、2μg/ml、20μg/ml、200μg/ml。分别取不同梯度浓度的华法林溶液，均匀地覆盖在相应的钛板上。另取一钛板不负载任何试剂，进行相同处理，作为空白对照。用100μl的双蒸水洗涤，共3次，干燥。干燥后，在37℃预热3分钟，分别先后加入100μl的新鲜血清，和50μl的pt测试液，混匀，及时，并观察凝固发生的时间。为保证全程在37℃的条件下进行，将96孔板置于37℃的水浴温箱中。实验结果如图7和表1所示。表1华法林的浓度和凝血酶原时间表浓度(μg/ml)00.00020.0020.020.2220200pt(秒)14.1215.4418.9418.9321.7921.720.7919.5可见随着华法林浓度的增加，凝血酶原时间(pt)延长。但是，当华法林浓度超过10μg/ml时，pt反而有下降的趋势。这与临床观察到的现象相吻合，华法林必须从低剂量开始逐渐加量，直接给大剂量反而导致血液高凝状态，目前还没有公认的解释。可见不能通过单纯提高华法林的浓度来提高抗凝效果。3、缓释性能考察分别取100μl的实施例1的二维纳米氧化石墨烯/华法林溶液均匀地涂抹在相应的5mm的钛板上，在37℃下干燥过夜。参照图11，将处理后的钛板分为不同组别，各组别再分别用100μl的双蒸水洗涤3、6、9、12、15次，干燥备用。涂抹过程中，确保涂抹均匀，以确保最终测量时，最大程度地减少干扰和误差。另取一钛板不负载任何试剂，进行相同处理，作为空白对照。其中，二维纳米氧化石墨烯/华法林溶液和膜状氧化石墨烯/华法林溶液为2μg/ml。实验结果参照图10和表2。表2华法林的缓释实验结果显示随着洗涤的次数增加，具有二维纳米氧化石墨烯/华法林抗凝缓释材料的钛板pt时间逐步缩短，但是相比空白钛板，仍有延长，提示二维纳米氧化石墨烯/华法林溶液负载至钛板后华法林缓慢释放，具有较好的缓释效果。同时，在后续清洗过程中发现，二维纳米氧化石墨烯/华法林形成的膜状结构与钛板结合牢固，普通水洗难以将其从钛板上分离，只有通过超声清洗才可将其分离。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12