短葶山麦冬皂苷C在制备治疗前列腺癌药的应用的制作方法

本发明属于制药领域，具体涉及短葶山麦冬皂苷c的新用途。

背景技术：

前列腺癌是一类高发的男性生殖系统疾病，在西方国家前列腺癌发病率在男性所有癌症中居第一位，死亡率居第二位，仅次于肺癌。虽然现在我国前列腺癌的发病率低于西方国家，但近年来由于人们生活方式日益西化、人口老龄化的加剧及前列腺特异性抗原筛查的普及，前列腺癌发病率及死亡率呈显著上升趋势，已成为严重影响中国男性健康的重要疾病。目前治疗前列腺癌的方法主要有手术治疗、放射治疗以及内分泌治疗等，但这些传统治疗效果并不理想。因此，开发和探索更为有效的新型前列腺癌治疗药物具有重要意义。

短葶山麦冬皂苷c，又名dt-13，为百合科植物短葶山麦冬的主要活性成分。现有研究报导，dt-13能够抑制乳腺癌细胞mda-mb-435的生长、迁移和粘附，对黑色素瘤细胞b16的肺转移也具有明显抑制作用，但目前在抗前列腺癌方面的研究及应用尚未报道。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供短葶山麦冬皂苷c在制备治疗前列腺癌药的应用。

本发明的技术方案概述如下：

短葶山麦冬皂苷c在制备治疗前列腺癌药的应用。

实验证明，短葶山麦冬皂苷c(dt-13)可显著抑制前列腺癌pc3和du145细胞的生长增殖，ic50值分别为4.825μm和5.102μm。2.5μm-10μm的dt-13对前列腺癌pc3和du145细胞的凋亡诱导率分别为8.21％-25.6％和7.67％-25.4％,可见其具有抑制肿瘤的活性。机制研究表明，dt-13通过抑制pi3k/akt通路发挥其抗肿瘤作用，pi3k/akt通路在前列腺癌中是高度活化的，说明其具有靶向前列腺肿瘤细胞的特性，具有良好的开发前景。对dt-13的抗前列腺癌pc3和du145细胞的作用及机理研究可为抗前列腺癌药物的开发研究提供理论支持。

附图说明

图1为dt-13对前列腺癌pc3(a)和du145细胞(b)的增殖抑制作用。

图2dt-13对pc3(a)和du145(b)细胞凋亡的影响。

图3dt-13对pc3(a)和du145(b)细胞线粒体膜电位的影响。

图4dt-13对pc3(a)和du145(b)细胞凋亡及pi3k/akt通路相关蛋白的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

细胞增殖抑制实验

利用mtt细胞增殖抑制实验检测短葶山麦冬皂苷c(以下简称dt-13)对pc3和du145细胞活性的影响。

取对数期生长的两种前列腺癌细胞pc3和du145细胞(购自中国科学院上海细胞库)，均用胰酶消化得到细胞悬液，计数并调整细胞密度为2×10⁴个/ml。每孔200μl细胞接种于96孔板中，于37℃、5％co2的孵箱内培养24小时后加入不同浓度的dt-13(见图1)，每个浓度3个复孔，对照组加入相应体积的溶剂(dmso)后继续置于37℃，5％co2的孵箱内培养48小时。之后加入终浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2即(mtt)20μl

培养4小时。用bio-rad酶标仪检测各孔在490nm波长下吸光度值。细胞数(％空白组)＝100×(dt-13处理组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)，每组实验重复3次，用graphpadprism软件作图并计算其ic50值。

结果如图a和图b所示，dt-13剂量依赖性抑制前列腺癌细胞pc3和du145的生长增殖，经统计学计算dt-13对pc3和du145细胞增殖活性的半数抑制浓度分别为4.825μm和5.102μm。结合图1和上面的描述，本领域技术人员能够重复上述实验。

实施例2

流式细胞术检测细胞凋亡

通过流式细胞术检测dt-13是否能够诱导pc3和du145细胞发生凋亡。凋亡检测步骤如下：

1.将pc3和du145细胞均以2×10⁵个/ml的细胞密度接种于6孔板中，37℃孵育24小时，更换培养液后给予对照组dmso及不同浓度的dt-13(2.5，5，10μm)孵育48小时；

2.收集细胞，pbs洗涤2次，并加入50μl的1×bindingbuffer重悬细胞；

3.加入annexin-v和propidiumiodide(pi)各2.5μl，室温避光30分钟，随后加入200μl的1×bindingbuffer，流式细胞仪上机检测并分析。

4.利用flowjo7.6.1软件分析流式结果，见图2。

给药48小时后，不同浓度的dt-13(2.5，5，10μm)以剂量依赖性方式诱导pc3和du145细胞凋亡，2.5μm-10μmdt-13对前列腺癌pc3和du145细胞的凋亡诱导率分别为8.21％-25.6％和7.67％-25.4％。

实施例3

流式细胞术检测细胞线粒体膜电位

线粒体膜电位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早的事件之一。通过检测加入dt-13后前列腺细胞pc3和du145线粒体膜电位的变化，进一步确认dt-13可诱导前列腺癌细胞凋亡并分析其作用机制。线粒体膜电位检测步骤如下：

1.将pc3和du145细胞以2×10⁵个/ml的细胞密度接种于6孔板中，37℃孵育24小时后，给药组加入不同浓度的dt-13(2.5，5，10μm)，对照组加入dmso，孵育48小时；

2.收集细胞，pbs重复洗涤2次，取1×10⁵个/ml的细胞重悬于0.5ml培基后，加0.5mljc-1染色缓冲液，避光孵育20min；

3.孵育结束，用1×jc-1染色缓冲液洗涤2次，并加入200μl的1×jc-1染色缓冲液重悬，流式细胞仪上机检测并分析。

4.利用flowjo7.6.1软件分析流式结果，见图3。

在给药48小时后，不同浓度的dt-13(2.5，5，10μm)可显著降低pc3和du145细胞线粒体膜电位。表明dt-13通过激活内源性线粒体途径诱导前列腺癌细胞凋亡。

实施例4

westernblot实验检测dt-13对前列腺癌pc3和du145细胞凋亡和pi3k/akt通路蛋白的影响

为了进一步探讨dt-13诱导pc3和du145细胞凋亡的机制，利用westernblot实验检测dt-13对pc3和du145细胞中凋亡相关蛋白bax、bad、bcl-2表达水平的变化。其中，bax和bad作为bcl-2家族中的一员，具有促凋亡作用，bcl-2作为公认的抗凋亡基因，可以阻断多种原因导致的细胞凋亡过程。当bax与bcl-2凋亡抑制蛋白相结合时，会导致线粒体功能异常并引发细胞凋亡，bad作为促凋亡蛋白，通过中和bcl-2蛋白的拮抗作用，在此过程中也起到重要作用。结果如图4所示，dt-13可显著增加pc3和du145细胞中bax、bad蛋白的表达，并抑制bcl-2蛋白的表达。由此可推断，dt-13可能通过激活前列腺癌细胞线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。

akt是pi3k信号通路的下游信号分子，活化的akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白mtorc、p70s6k、bad等，进而对细胞的增殖、凋亡等进行调节。为了探究dt-13对pc3和du145细胞的影响是否与该通路相关，同样利用westernblot方法检测dt-13作用后该通路主要信号分子p-akt，akt、p-mtor以及p-p70s6k表达或磷酸化水平的变化。结果如图4所示，利用dt-13处理pc3和du145细胞48小时后，akt、mtor和p70s6k的磷酸化水平呈剂量依赖性方式下降，而akt表达水平未见变化。因此，我们推断dt-13可能通过抑制pi3k/akt通路信号传导来诱导前列腺癌细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。