甘草苷治疗神经病理性疼痛的制药用途的制作方法

本发明涉及甘草苷的应用，特别涉及甘草苷在制备治疗神经病理性疼痛的药物中的用途。

背景技术：

神经病理性疼痛(neuropathicpain)是一种慢性疼痛综合征，其发病机制较为复杂，一般是由于神经系统功能发生异常或者受到损伤而产生的疼痛，常见于自身免疫性疾病(如多发性硬化)、代谢性疾病(如糖尿病性神经病变)、感染(带状疱疹后神经痛)、血管病(如卒中)、神经受压迫、神经创伤和癌症等。神经病理性疼痛困扰着世界上1/6的人，不仅造成躯体本身的疼痛和功能障碍，同时还会伴发抑郁、焦虑等心理精神障碍，对患者的的生活和生命质量产生严重影响，并给家庭、社会带来巨大负担。近年来，随着病理学、生理学、分子生物学及疼痛临床治疗技术的迅速发展，神经病理性疼痛的研究已取得较大进展。目前神经病理性疼痛的主要治疗药物多是抗抑郁药、非甾体类抗炎药、阿片类药物等，但这些药物因其各种不良反应，严重影响患者的生活质量，进而限制了在临床上的使用。因此进一步研究神经病理性疼痛的发生机制，在此基础上寻找安全性高，临床疗效好的治疗神经病理性疼痛的药物具有重要的学术价值和现实意义。

中药甘草,具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药的功效。现代研究表明其具有肾上腺皮质激素样作用，能够调节机体免疫功能，以及抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、镇咳、祛痰等作用。甘草中的主要活性成分为皂苷类与黄酮类物质，代表物分别是甘草酸和甘草苷。甘草苷(liquiritin,lq)属于以2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)为母核的二氢黄酮类化合物,其分子式为c21h22o9。甘草苷具有抗心律失常、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等生物活性。近年来，国内外研究发现甘草苷还具有抗炎、神经保护、抗抑郁作用等多种药理活性和临床功能，但关于其对神经病理性疼痛的保护作用目前未见文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是通过对甘草苷的药理作用研究，提供甘草苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明提供甘草苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，所述甘草苷的结构式如式(1)所示：

具体地，所述神经病理性疼痛为外周神经损伤的神经病理性疼痛。

进一步地，所述甘草苷单次应用剂量为30-120mg/kg。

优选地，所述甘草苷单次应用剂量为60-120mg/kg。

优选地，所述甘草苷单次应用剂量为120mg/kg。

具体地，所述甘草苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

具体地，所述药物的剂型为药剂学上可接受的剂型，优选为允许的口服剂型或注射剂型。

本发明提供的甘草苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途具有以下有益效果：

(1)甘草苷能显著缓解机械痛觉超敏、冷痛觉超敏和热痛觉过敏；

(2)甘草苷能改善受损的坐骨神经，增加神经传导速度及感觉神经动作电位振幅，显著抑制了脊髓组织中促炎性细胞因子tnf-α、il-6及il-1β蛋白的表达并且促进il-10蛋白的表达。

实验结果表明甘草苷具有治疗小鼠坐骨神经慢性压迫性损伤所致神经病理性疼痛的作用，可用于制备神经病理性疼痛的治疗药物。

附图说明

图1：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的机械缩足反射阈值图；

图2：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的冷抬足次数图；

图3：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的热缩足反射潜伏期图；

图4：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经功能指数图；

图5：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经复合动作电位图；

图6：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的感觉神经传导速度图；

图7：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的感觉神经动作电位振幅图；

图8：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经组织超微结构变化的透射电镜图；

图9-12：甘草苷对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织tnf-α、il-6、il-1β及il-10蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝6))；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，以下实施例中使用的甘草苷均为前述式(1)所示的化合物，可通过商购获得。

实施例1

甘草苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，

其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的的神经病理性疼痛，甘草苷单次应用剂量为小鼠30mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例2

甘草苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，

其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的的神经病理性疼痛，甘草苷单次应用剂量为小鼠60mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例3

甘草苷作为治疗神经病理性疼痛药物的用途，

其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的的神经病理性疼痛，甘草苷单次应用剂量为小鼠120mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

雄性icr小鼠，18-22g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：ncxk(宁)2013-0005。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

甘草苷(北京中科质检生物技术有限公司)，以cmc-na配制成混悬液，母液浓度120mg/ml，现配现用。戊巴比妥钠(sigma-aldrich公司),普瑞巴林胶囊(辉瑞制药有限公司),vonfreyfilaments(danmicglobal,美国)，冷板仪(bioseb科技仪器公司，法国),pl-200热刺痛仪(成都泰盟科技公司),透射电镜(h-7650日立,日本东京)，兔抗tnf-α、il-6、il-1β及il-10多克隆抗体(购自abcam公司),酶标仪(1510，thermofisher公司)，电泳仪、电转仪(powerpacbasic,美国bio-rad公司)，凝胶成像分析仪(js-860b,上海培清公司)。

1.3实验动物分组及给药

小鼠随机分为慢性压迫性损伤(cci)模型组，甘草苷不同剂量组。小鼠在手术造模后按0.1ml/10g体重12h/次灌胃给药。假手术组同法给予等量的cmc-na。在cci造模后的第0，7，8，10，12天进行行为学、电生理学、组织病理学和分子生物学等药效学评价。

1.4小鼠慢性压迫性损伤(cci)模型建立

通过对小鼠坐骨神经进行结扎，建立慢性缩窄性损伤致神经病理性疼痛动物模型。小鼠称重后，采用0.8％戊巴比妥钠注射液以0.1ml/10g的剂量腹腔注射对小鼠进行麻醉。麻醉后，将小鼠俯卧位置于消毒后的手术台上，在右侧臀股交界处剪毛备皮，碘伏消毒液进行皮肤表面消毒，用手术剪在此处沿坐骨神经走行方向剪开约1.5cm的切口，顺着肌纹，用玻璃挑针钝性分离股二头肌和臀肌,使坐骨神经主干暴露出来，用消毒并用生理盐水浸泡过的4-0医用铬制羊肠线对暴露的坐骨神经主干进行3个间距为1mm的松弛结扎，逐层缝合肌肉层及皮肤。为避免结扎力度过大引起组织坏死，应以结扎侧肢发生细微的颤动为准，以避免神经外膜的血液流动受到干扰。

二、实验过程

(一)行为学参数测定

1.1实验方法：

测定机械缩足反射阈值(pawwithdrawalthreshold,pwt)：将一有机玻璃箱(22×12×22cm)置于金属筛网上，待小鼠在箱中适应15min后，用vonfrey纤毛机械刺激器垂直刺激小鼠后肢足底中部，持续时间≤4秒，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。刺激由小到大，每个强度反复刺激10次(次－次间隔3～5s)，将出现缩足反射5次左右的强度定为pwt。

测定冷抬足次数：于安静环境中，将小鼠放在温度为4℃的冷板仪的金属冷板上，其活动采用玻璃罩加以限制，待其适应约5min左右安静下来后，观察并记录小鼠手术侧肢在5min内的的抬足次数，即为冷缩足反射次数。

测定热缩足反射潜伏期(pawwithdrawallatency,pwl)：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，将小鼠放人有机玻璃箱内，使其自由活动30min以适应测试环境和温度。用pl-200型热痛刺激仪照射小鼠足底。照射开始至小鼠出现抬腿回避时间为pwl。刺激部位为紧贴玻璃板的手术侧后爪部分。当后爪移动时，停止照射。照射自动切断时间为20sec，以防止组织损伤。整个实验中，热刺激强度保持相同。重复刺激三次，取pwl的平均值。

测定坐骨神经功能指数(sciaticfunctionalindex，sfi)：自制一个35×5×10cm的小鼠行走槽，槽的远端出口放置饲料，在底部铺一张与之长宽相等的白纸。测试前，小鼠整个双侧后足底部均匀涂蘸红色印油，然后将小鼠由行走槽近端放入其中，经由饲料引诱，诱使小鼠向行走槽的远端行走，小鼠走过的白纸上留下其左右后足的足印，选取3个清晰并连续的足印，并测量以下3个数值：①足尖与足跟之间的距离，即足印的长度(podogramlength,pl)；②第一趾与第五趾之间的距离，即足趾的宽度(toespreading,ts)；③第二趾与第四趾之间的距离，即中间足趾的宽度(intermediarytoesspread,it)。大头针确定小鼠足趾印的位置，利用游标卡尺测量其之间的距离，记录一组最长的足印数值作为选定的数据。将记录的数据采用以下公式，计算小鼠的坐骨神经功能指数(sfi)：sfl＝-38.3(epl-npl)/npl+109.5(ets-nts)/nts+13.3(eit-nit)/nit-8.8。其中手术侧足由e表示，正常侧足由n来表示。sfi＝0表示坐骨神经正常未受损伤；sfi＝100说明坐骨神经断离。

1.2实验结果：

手术前各组小鼠的pwt(图1)、冷抬足次数(图2)、pwl(图3)和sfi(图4)均无显著差异。在手术后第7天，与假手术组相比，其余小鼠的pwt，pwl,sfi均明显降低(p﹤0.01)，冷抬足次数明显升高(p﹤0.01)。在造模后8、10、12、14天，与模型组组相比，甘草苷(120mg/kg)组及普瑞巴林(40mg/kg)组的pwt、pwl和sfi均显著升高，冷抬足次数明显降低(p<0.05)；甘草苷(60mg/kg)组在造模后12、14天，与模型组组相比，pwt、pwl和sfi均显著升高，冷抬足次数明显降低(*p﹤0.05,**p﹤0.01)；而甘草苷(30mg/kg)组的各行为学参数均无显著性差异。

(二)电生理学测定

2.1实验方法：

坐骨-腓神经电生理活动的观测：小鼠麻醉后，于造模时相同的部位切口打开，钝性分离肌肉及筋膜，暴露出坐骨神经主干至坐骨切迹及远端羊肠线结扎处，分离过程需用温热的石蜡油对坐骨神经进行保护。将针灸针制成钩状并连接在刺激电极的鳄鱼夹上，将连接在鳄鱼夹上的钩状针灸针钩在接近坐骨切迹处的坐骨神经干上，记录针电极分别插在小鼠足踝部及足底第二与第三趾间肌肉中，参比电极置于受坐骨神经支配的腓肠肌内，两个参比电极的距离约为5mm。测试过程中以生理盐水为导电的介质，并要根据具体情况及时补充。将上述各电极连接bl-420f生物机能实验系统，实验项目选择“肌肉神经实验”子选项中的“神经干兴奋传导速度的测定”，设定好参数值。测量并记录一下数据：①两个电极所记录的动作电位潜伏期并计算其差值(两个波峰之间的时间差)，即潜伏期之差△t；②两记录电极之间的距离s；③感觉神经动作电位振幅(sensorynerveactionpotentialsamplitudes，snapamplitudes)即动作电位波峰与波谷间的距离。以上数据中的①和③均选取三个动作电位波形图进行数据统计，取其均值作为最终统计数据。神经传导速度(nerveconductionvelocity，ncv)计算方法为记录电极之间距离比上潜伏期之差，即ncv＝s/△t。根据此公式计算感觉神经传导速度(sensorynerveconductionvelocity，sncv)。

坐骨-胫神经电生理活动的观测：将参比电极插入小鼠术侧肢的胫骨前肌其余方法同上，引导出坐骨-胫神经的动作电位，即运动神经动作电位(motornerveactionpotentials，mna)。记录潜伏期之差△t，运动神经动作电位振幅(mnapamplitudes)，及记录电极间的距离s。依照ncv的计算公式，计算出运动神经传导速度(motornerveconductionvelocity，mncv)。

2.2实验结果：

各组小鼠在造模后的14天，与假手术组相比，模型组小鼠坐骨-腓神经动作电位的振幅明显下降并且潜伏期明显增长(图5)，a-f分别表示假手术组、模型组、普瑞巴林组、甘草苷组(30、60、120mg/kg)。与假手术组相比，模型组小鼠的感觉神经动作电位振幅和感觉神经传导速度显著降低(p<0.01)。与模型组相比，甘草苷(60、120mg/kg)组及普瑞巴林(40mg/kg)组小鼠在造模后的14天感觉神经动作电位振幅和感觉神经传导速度显著增高(*p﹤0.05,**p﹤0.01)；而甘草苷(30mg/kg)组的小鼠在给药7天后感觉神经动作电位振幅和感觉神经传导速度并无明显变化(图6、图7)。

(三)电镜下观察组织超微结构变化

3.1实验方法：

坐骨神经结扎点与分支前这段主干作为取材部位，神经暴露后用锋利的刀片迅速取材，置于盛有3％戊二醛的烧皿中，将标本修至约1mm3的微小细块，3％戊二醛固定4小时。0.1％锇酸固定48小时，丙酮逐级梯度脱水，常规环氧树脂包埋剂包埋，最后制成75nm的切片进行枸橼酸铅和醋酸铀双重染色。使用日立h-7500透射电子显微镜观察坐骨神经超微结构的改变。

3.2实验结果：

如图8：a-f分别表示假手术组、模型组、普瑞巴林组、甘草苷组(30、60、120mg/kg)。假手术组神经结构完整，髓鞘板层规则；模型组组髓鞘板层质地松散，偶见严重病变处呈灶性溶解坏死，出现空泡状和空网状改变，甚至髓鞘脱落轴突断裂；甘草苷(60、120mg/kg)组及普瑞巴林(40mg/kg)组情况开始好转，髓鞘板层质地均匀排列紧密，轴突外有施万细胞质膜形成的髓鞘紧密包裹，空泡数量减少。而甘草苷(30mg/kg)组与模型组相比没有大的变化。m:髓鞘，u施万细胞核，a:轴索。

(四)westernblot检测新生大鼠脑缺血损伤侧脑组织tnf-α、il-6、il-1β及il-10蛋白的表达

4.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，bca蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。sds—聚丙烯酰胺凝胶电泳，用将硝酸纤维素膜(nc膜)进行湿法转膜。转膜结束后取出硝酸纤维素膜，将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭1h。封闭结束孵育5％脱脂奶粉稀释的一抗，4℃过夜，室温复温1h，洗膜孵育二抗。用pbst洗nc膜3次，每次10min。滴加蛋白化学发光剂(ecl)，nc膜固定于片盒内，压入胶片进行曝光。取出胶片，放入显影液和定影液中各1min，最后清水清洗。凝胶图像分析成像系统(培清，js-860b)对胶片上每个目的条带进行扫描和图像分析。

7.2实验结果：

如图9至图12，与假手术组比较，模型组tnf-α、il-6、il-1β蛋白表达明显增加，il-10蛋白表达明显减少(##p<0.01)；如图7至图10所示，与模型组比较，甘草苷(120mg/kg)组小鼠脊髓组织tnf-α、il-6、il-1β蛋白表达明显减少(*p﹤0.05,**p﹤0.01)；如图10所示，与模型组比较，甘草苷(120mg/kg)组小鼠脊髓组织il-10蛋白表达明显减少(*p﹤0.05,**p﹤0.01)。提示甘草苷的保护作用可能通过上调il-10蛋白的表达，降低tnf-α、il-6、il-1β的表达与活化，发挥抗炎作用,从而对小鼠慢性压迫性损伤致神经病理性疼痛产生保护作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。