一种哒嗪酮类化合物在肿瘤治疗中的应用的制作方法

技术领域：

本发明属于医药技术领域。更具体地，本发明涉及一种哒嗪酮类化合物在肿瘤治疗中的应用。

背景技术：
：

恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的常见病。目前临床应用的抗肿瘤药物的毒性是困扰肿瘤化疗的问题，寻找新的抗肿瘤药物是抗肿瘤药物研究的一大任务。本发明涉及的化合物是哒嗪酮类化合物。哒嗪酮类化合物是一类具有良好生物活性的杂环化合物，在农药医药等研究领域中占有重要地位。哒嗪酮类化合物可以作为钙增敏剂用于治疗心功能障碍和心力衰竭的强心药，另外在抗血小板聚集、降压及抗炎、抗休克、抗惊厥等方面也有一定疗效。某些哒嗪酮类衍生物在抗肿瘤作用也具有良好的活性，如：

中国专利200880017969.2公开了一种哒嗪酮衍生物，具有抗肿瘤活性。

中国专利200910127196.x公开了一种6-(3-(三氟甲基)苯基)哒嗪-3(2h)-酮为母核的具有下述结构式i所示的哒嗪酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，尤其是抗肝癌药物中的用途。

中国专利201410018618.0公开了一系列哒嗪酮类衍生物，及其抗肿瘤的作用。

中国专利201310306863.7公开了哒嗪酮类化合物作为酪氨酸激酶抑制剂，特别是c-met抑制剂中的用途。

化合物imb5036和imb5043为现有化合物库中的已知结构的化合物，可以从市场上购买得到，也可以根据相应的化学合成方法合成得到，本发明的两个化合物购买自enamineltd公司。其抗肿瘤活性迄今并未见有任何报道。两个化合物虽然都属于哒嗪酮类化合物，但在结构上和现有技术有显著的区别，本发明人在筛选抗肿瘤药物的过程中，意外的发现这两种化合物对多种肿瘤具有杀伤作用。

技术实现要素：
：

本发明提供了一种哒嗪酮类化合物，其结构式如下：

其中，r1，r2同时为卤素，优选同时为cl，或同时为br；r3为o，r4选自如下结构：

优选以下两种哒嗪酮类化合物：

化合物i，命名为imb5036，其cas号为1090393-42-2。

化合物ⅱ，命名为imb5043，其cas号为1089995-96-9。

本发明人研究了这两种化合物的药物活性，发现imb5036和imb5043具有良好的抗肿瘤活性，特别是对肝癌治疗效果最好。进一步发现能通过引起dna双链断裂造成dna损伤来发挥抗肿瘤作用。

为此，本发明提供一种上述哒嗪酮类化合物包括imb5036和imb5043在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的肿瘤选自：肝癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、纤维肉瘤以及其它治疗抵抗或耐受的肿瘤。

本发明进一步提供含有哒嗪酮类化合物的药物组合物，所述哒嗪酮类化合物结构如上面所述。

以下通过实验数据说明本发明的有益效果。

试验实施例1：化合物对培养细胞的细胞毒作用。

mtt(四甲基偶氮唑蓝盐)法检测化合物imb5036和imb5043对培养细胞的细胞毒作用。细胞用含10％胎牛血清(gibocobrlinc.)、2mm谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100u/ml青霉素的rpmi-1640培养基(gibocobrlinc.)在37℃含5％co2的培养箱中培养。

使用的肿瘤细胞株均为常见细胞株，本室保存，也可从商业途径如atcc细胞库(rockville,md,usa)、国家实验细胞资源共享平台等购得。取对数生长期的细胞消化计数，按4000个细胞/孔铺于96孔板，培养24小时后，加入不同浓度的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养48小时后，每孔加入以pbs溶解的5mg/ml的mtt(amresco,ohio,usa)20μl，37℃继续培养4小时后，吸弃上清，加入150μl二甲基亚砜，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪(thermolabsystems,multiskanmk3)上测定570nm的光吸收值a。每次实验均设无药对照孔和无细胞空白孔各3孔。按公式:抑制率％＝(a对照组-a给药组)/(a对照组-a空白组)×100％计算药物对细胞的增殖抑制率并计算半数抑制浓度(ic50)。结果如表1所示，两种化合物对不同来源的肿瘤细胞均有较好的杀伤作用，imb5036对人肝癌细胞smmc-7721的杀伤作用最强，ic50为1.85μm；imb5043也对smmc-7721的杀伤作用最强，ic50为3.56μm。而人胚胎肝细胞l02则对两个化合物不敏感。

表1.imb5036和imb5043对肿瘤细胞及正常细胞l02的细胞毒活性

试验实施例2：间接免疫荧光法检测imb5036和imb5043对dna损伤的影响。

取对数生长期的smmc-7721细胞接种于铺有盖玻片的六孔板中，24小时后分别加入1μm的imb5036和2μm的imb5046，同时设置对照孔，药物处理24小时后，取出盖玻片依次用pbs洗涤3次，用4％多聚甲醛固定15分钟，0.1％tritonx-100通透处理15分钟，1％bsa室温封闭30分钟；加入af488标记γ-h2ax抗体(emdmillipore)在温度37℃下孵育1小时,荧光显微镜(olympusix81)下观察拍照。结果显示imb5036和和imb5043处理的肿瘤细胞核与对照组相比，形成的磷酸化h2axfoci显著增多(图1)。

试验实施例3：imb5036和imb5043的动物试验性治疗方案。

运用人肝癌smmc-7721异种移植瘤模型评价化合物的体内疗效。取smmc-7721细胞按1×10⁷/0.2ml/只接种于nihnu/nu小鼠腋窝皮下，两周后取瘤块在生理盐水中剪切成2mm³的小块，用套管针将瘤块移植到裸鼠腋窝皮下。第七天将裸鼠按瘤块大小分组，每组7只，使每组动物的瘤块大小平均值接近。将化合物溶于二甲基亚砜(sigma)/聚氧乙烯蓖麻油(cremophorel)(sigma)/生理盐水(1:2:17)混合液中，腹腔给药，给药剂量为12.5或25mg/kg，5次/周，0.2ml/只，连续给药两周。实验期间每2-3天测量一次肿瘤长径a和与之垂直的短径b，并记录动物体重。以公式v＝1/2ab²计算瘤体积和抑制率(对照组瘤体积-试验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％。当瘤体积达到1000mm³时脱颈处死动物。

实验结果表明，imb5036可显著抑制肿瘤的生长，12.5和25mg/kg的imb5036通过腹腔给药，给药后第28天的抑瘤率分别为30.6％和66.2％(图2)，所有处理组的动物没有明显的体重下降或行为的异常(图3)，说明小鼠能较好的耐受这一剂量的药物。imb5043显示出中等程度的抑瘤效果，12.5和25mg/kg的imb5043通过腹腔给药，给药后第28天的抑瘤率分别为28.6％和58.8％(图4)，所有处理组的动物没有明显的体重下降或行为的异常(图5)，说明小鼠能较好的耐受这一剂量的药物。

本发明进一步包括本发明化合物或其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐选自与无机酸或有机酸形成的盐，如与盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸，或乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、草酸、琥珀酸、苯甲酸、酒石酸、富马酸、扁桃酸、抗坏血酸、苹果酸形成的盐，也可按常规方法制备它们的碱金属盐、碱土金属盐、银盐、钡盐等。

本发明还提供含有本发明化合物或其药用盐的药物组合物。药物组合物以适合药用的制剂形式存在。药用的制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂，口服液，注射剂等。

本发明的药物组合物，作为制剂形式，每剂中含有的发明化合物的有效量为0.1～1000mg，所述每剂指的是，每一制剂单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，也可指每次服用剂量，如每次服用100mg。

本发明的药物组合物在制备成片剂、胶囊剂形式的固体药物制剂时，可使用固体载体。可使用的固体载体优选为选自稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、膨胀剂等中的一种或多种物质，或可为包封物质。适宜的固体载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、蔗糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、可可脂等。由于它们易于给药，片剂和胶囊代表最有利的口服固体制剂。

所述药物组合物含有的本发明化合物在组合物中的重量比为0.1～99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1～99.9％。

为了易于给药及剂量均一，将上述药物制剂配制成剂量单位形式是特别有利的。制剂的剂量单位形式指适于作为单一剂量的物理分离单位，每个单位含有产生所期望的治疗效果的计算好的预定量的活性成分。这种剂量单位形式可为包装形式，如片剂、胶囊。

虽然剂量单位形式中所含活性成分的量可以变化，但一般根据所选择活性成分的效力，调节在1～800mg范围内。

本领域技术人员可按常规方法确定适于某种情况的优选剂量。一般，开始治疗的量低于活性成分的最佳剂量，然后逐渐增加给药剂量，直到达到最佳治疗效果。为方便起见，总的日剂量可分为几部分，分数次给药。

本发明和现有技术中的哒嗪酮类化合物相比，抗肿瘤活性更高，毒副作用更小，本发明哒嗪酮类化合物ld50数值远高于现有技术的哒嗪酮类化合物，适合作为口服抗肿瘤药物使用。

附图说明：

图1imb5036和imb5043可以引起人肝癌细胞smmc-7721细胞核γ-h2axfoci形成增多(图1)。

图2imb5036可显著抑制肿瘤的生长，12.5和25mg/kg的imb5036通过腹腔给药，给药后第28天的抑瘤率分别为30.6％和66.2％(图2)。

图3所有imb5036处理组的动物没有明显的体重下降或行为的异常(图3)。

图4imb5043显示出的抑瘤效果，12.5和25mg/kg的imb5043通过腹腔给药，给药后第28天的抑瘤率分别为28.6％和58.8％(图4)。

图5所有imb5043处理组的动物没有明显的体重下降或行为的异常(图5)。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

片剂的制备

取imb5036和imb5043任意一种化合物0.5g、淀粉4.5g、糖粉0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，制粒，整粒，干燥，加入少量润滑剂压片分装，即得。

实施例2

胶囊剂的制备

取imb5036和imb5043任意一种化合物0.5g、淀粉4.5g、糖粉0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，制粒，整粒，干燥，分装胶囊，即得。

实施例3

颗粒剂的制备

取imb5036和imb5043任意一种化合物0.5g、淀粉4.5g、糖粉0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，制粒，整粒，干燥，分装，即得。