一种治疗癌症的药物组合物及其用途的制作方法

本发明涉及癌症用药领域，具体而言，涉及一种治疗癌症的药物组合物及其用途。

背景技术：

菊科泽兰属植物紫茎泽兰eupatoriumadenophorumspreng.，俗称“败马草”、“黑茎草”、“臭草”、“霸王草”等，具有强大的生物活性。紫茎泽兰，有作为民间草药使用的记载，滇南民间取其茎叶煮水洗,治香港脚和稻田湿疹,也有以叶揉擦患处,能止血、止痛、消炎。目前对紫茎泽兰的药理研究较少。因此为了为了充分开发紫茎泽兰潜在药用价值，控制入侵物种，变害为宝，本发明对紫茎泽兰进行深入的研究。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种治疗癌症的药物组合物，该药物组合物中的活性成分来源于紫茎泽兰，能够用于预防或治疗癌症。

本发明的第二目的在于提供一种药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，为癌症的预防或治疗提供新的治疗手段和思路，同时也开发了紫茎泽兰新的药用价值。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种治疗癌症的药物组合物，其包括紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮或克拉维醇中的至少一种，以及药学上可接受的载体或辅料。

一种药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，其包括紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮或克拉维醇中的至少一种，以及药学上可接受的载体或辅料。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明从紫茎泽兰中分离纯化得到具有抗癌功效的活性成分:紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮、克拉维醇，这三种活性成分无论是单独使用或是联合使用，均具有很好的抗癌活性，其通过诱导癌细胞凋亡和阻滞癌细胞周期来发挥功效，可用于制备临床抗癌药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中制备紫茎泽兰石油醚萃取物的流程图；

图2为本发明实施例2中制备化合物a、b、c的流程图；

图3为本发明实验例一中化合物a、b、c与紫茎泽兰石油醚萃取物对肝癌细胞hepg2与正常肝细胞lo2细胞活力的影响图，其中，纵坐标为肿瘤细胞的百分抑制率，横坐标为给药浓度；

图4为本发明实验例一中化合物a、b、c与紫茎泽兰石油醚萃取物细胞毒活性ic50值，其中，纵坐标为ic50值；

图5为本发明实验例二中紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞形态的影响图；

图6为本发明实验例三中紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞周期的影响图，其中，流式细胞术分析图的横坐边是荧光强度，纵坐标是细胞数量；直方图的横坐标是给药浓度，纵坐标是subg1期的占比；

图7为本发明实验例四中紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞dna的影响图；

图8中(a)为本发明实验例五中紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白表达的影响；(b)为紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞jak2/stat3信号通路的影响。

以上图中，norma表示正常组，cddp表示顺铂阳性药物组，ea-pe表示紫茎泽兰石油醚萃取物，a表示2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮，b表示克拉维醇，c表示紫茎泽兰内酯。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种药物组合物，其包括：紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮或克拉维醇中的至少一种，以及药学上可接受的载体或辅料。

其中，2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮(化合物a)的结构式为：

其中，克拉维醇(化合物b)的结构式为：

其中，紫茎泽兰内酯(化合物c)的结构式为：

进一步的，药物组合物包括紫茎泽兰石油醚萃取物，其中，紫茎泽兰石油醚萃取物的制备方法包括：采用乙醇-水混合溶液提取紫茎泽兰，将所得到的紫茎泽兰提取物用石油醚萃取，即得。这种提取方法工艺简单，出膏率高，所提取的提取物抗癌活性好，适合规模化生产。

本实施方式还提供一种治疗癌症的药物组合物的制备方法，其包括：

步骤s1:采用乙醇-水混合溶液提取紫茎泽兰，将所得到的紫茎泽兰提取物用石油醚萃取，得到紫茎泽兰石油醚萃取物。

进一步的，采用浸渍法提取。可选的，用95％的乙醇溶液以料液比为1：7～9浸渍紫茎泽兰2～4天。可选的，浸渍1～3次，每次2～4天。

步骤s2:采用硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱分离石油醚萃取物，得到紫茎泽兰内酯以及混合馏分。

可选的，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱，得到紫茎泽兰内酯，和三个馏段(f1-f3)，以第一馏段为混合馏分(f1)。其中，石油醚和乙酸乙酯优先使用60～90℃沸程规格的溶剂。

步骤s3:再次采用硅胶柱色谱，以丙酮-石油醚混合溶剂梯度洗脱分离混合馏分，得到2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮和克拉维醇。

进一步的，以2％丙酮-石油醚为洗脱剂，采用硅胶柱色谱分离混合馏分(f1)，得到3个馏段(f1.1-f1.3)，继续采用薄层层析法或hplc法制备得到克拉维醇和紫茎泽兰内酯。

本实施方式还提供一种药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，所述药物组合物包括紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮或克拉维醇中的至少一种，以及药学上可接受的载体或辅料。

发明人研究表明，紫茎泽兰的石油醚提取物及上述三种活性成分具有优良的抗癌活性，进一步研究发现，其通过促进癌细胞凋亡途径和阻滞癌细胞周期的作用来起到抗癌活性的，可用于临床抗癌用药。

进一步的，发明人经细胞试验证实，该紫茎泽兰的石油醚提取物及上述三种活性成分是通过影响jak-stat信号通路来诱导所述癌细胞凋亡的。

jak-stat信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，其参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。其中，stat3的活性在细胞恶变过程中起关键性作用。许多肿瘤来源细胞株都需要stat蛋白(特别是stat3)来保持转变后的表现型，这些肿瘤来源细胞株包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌或膀胱癌。

下面以肝细胞肝癌为例，进行详细论述：

许多肝细胞肝癌的危险因素，包括hbv、hcv的感染、以及肝脏的脂肪变性都可以促进stat3的活化。jak-stat信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的jak激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。jak激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”(dockingsite)，同时含有sh2结构域的stat蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶jak催化结合在受体上的stat蛋白发生磷酸化修饰，活化的stat蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。

stat3在肝细胞肝癌经常被持久性的激活，其在肝细胞肝癌的发生中是不可缺少的，它是肝细胞肝癌的主要致瘤转录因子。stat3的磷酸化及其下游基因bcl-2、bcl-xl、cyclind1、vegf的上调促进肝细胞肝癌的增殖，血管形成，侵袭转移及免疫逃逸，而且活化的stat3对于肝细胞肝癌细胞的存活也是必不可少的。因此，stat3被作为肝细胞肝癌治疗的一个非常重要的分子靶向目标。

发明人研究发现，紫茎泽兰石油醚萃取物以及三种活性成分能够降低jak2蛋白与stat3蛋白的磷酸化水平，即通过调控jak-stat信号通路，抑制其下游肿瘤相关蛋白表达。

与此同时，发明人还发现，该药物组合物是通过影响线粒体凋亡信号转导通路来诱导癌细胞凋亡的。bcl-2家族的表达和调控是影响线粒体细胞凋亡信号转导的关键因素之一，其主要作用位点在线粒体膜上。细胞受到死亡信号刺激后，bcl-2家族中的促凋亡蛋白在蛋白酶作用下发生构像变化，从细胞浆移位到细胞器膜上，尤其是线粒体外膜上，并与细胞器膜上和膜内的抗凋亡蛋白相互作用，使抗凋亡蛋白丧失对凋亡的抑制作用，引起细胞器功能丧失和各种促凋亡因子的释放，最终导致癌细胞凋亡。

bcl-2和bax分别是bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，并且bcl-2是stat3经典的靶基因表达蛋白。在正常肝组织中，bcl-2通常表达阴性，而bax表达阳性。但在如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌与膀胱癌等恶性肿瘤中，都观察到了bcl-2的上调与bax下调，并且细胞分化程度越低，这种趋势更加明显。

发明人研究发现，该组合物能够下调bcl-2蛋白的表达水平，上调bax蛋白的表达水平，从而降低bcl-2/bax的比值。

bcl-2/bax比值的改变，最终导致caspase家族引起的细胞凋亡。caspase家族是一类能特异性识别天冬氨酸位点的半胱氨酸蛋白酶，参与细胞凋亡信号转导的多个过程。在线粒体细胞介导的凋亡通路中，caspase家族参与凋亡信号的放大与凋亡效应，通过酶促级联反应的方式放大凋亡信号，并催化凋亡相关效应蛋白，最终导致细胞的凋亡。如在bcl-2家族的调控下，线粒体释放凋亡活化因子1(apaf1)，apaf1结合细胞色素c(cytoc)、atp，并经过自身构象变化及自身活化，使apaf1n端形成一种表面结构，可活化caspase8/9，再进一步活化caspase3/6/7，最终caspase3/6/7催化一系列凋亡相关底物，引起细胞凋亡。

研究发现，该组合物能够增加caspase-9与caspase-3的活化水平，从而通过酶促级联反应的方式放大凋亡信号，最终导致癌细胞的凋亡。

进一步的，该药物组合物是通过阻滞癌细胞周期来预防或治疗癌症的。

细胞周期调控是机体维持细胞状态的另一重要手段。癌变细胞除了抵抗凋亡过程，往往还表现异常的增殖能力。如p53、brca1、rb、p16、p15以及p53、brca1的下游调控基因如p21、gadd45是细胞周期监测点的重要组成部分。但在多数肿瘤发生过程中，这些抑癌基因多有基因改变而失活，造成细胞周期监测点功能缺陷，最终结果是细胞获得失控性增殖能力，导致肿瘤的发生。

发明人研究发现，紫茎泽兰石油醚萃取物以及三种活性成分能够阻断癌细胞的细胞周期，使其停滞在g2期、或者m期，并且能够诱导这两类癌细胞的凋亡。

由此说明，该药物组合物可以用于癌症的治疗，例如肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌或膀胱癌。可选的，用于肝癌的治疗。

进一步的，为了使该药物快速、连续并在很长一段时间里释放活性成分，本发明的药物组合物可以根据公开在那些本技术领域中的常规方法制造。本实施方式的药物的给药途径可以为口服、鼻吸入、或肠胃外给药。包含该组合物的制剂可以是片剂、软胶囊、硬胶囊、口服液、丸剂、栓剂、粉末、颗粒、乳剂、糖浆、气雾剂、灭菌注射剂、和灭菌粉等。

本发明中，术语“药学上可接受的”指当化合物给人类施用时该化合物是生理上可接受的，且不会发生胃肠道紊乱、头晕等过敏反应或者类似这些过敏反应的全身过敏反应。

在本发明中，“药学上可接受的载体或辅料”包括但不限于：粘合剂(如微晶纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(如淀粉、蔗糖、葡萄糖和无水乳酸)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、和低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(硬脂酸镁、硬脂酸铝、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠)、润湿剂(如甘油)、表面活性剂(如十六烷醇)以及吸收促进剂、矫味剂、甜味剂、稀释剂、包衣剂等。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种药物组合物，其包括紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮或克拉维醇中的至少一种，以及药学上可接受的载体或辅料。

其制备方法包括：

如图1所示，取紫茎泽兰全株干燥粉末10kg，按料液比1:8(1kg药材对应8l的溶剂)用体积浓度为95％的乙醇浸渍3天，过滤取滤液，对滤渣采用同样的操作浸提两次，过滤合并三次提取的滤液，减压浓缩得到紫茎泽兰浸膏806g。按体积比1:10加水混悬，用三倍体积石油醚萃取样品，石油醚萃取液减压浓缩，回收溶剂蒸干，得到紫茎泽兰石油醚萃取物182g。

如图2所示，取100g紫茎泽兰石油醚萃取物，经硅胶柱(200-300目)层析，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯梯度洗脱，得到化合物a：2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮(3.362g)与3个馏段(f1-f3)；f1经硅胶柱层析,2％丙酮-石油醚洗脱得3个馏段(f1.1-f1.3)；f1.2以5％丙酮-苯为展开剂进行制备薄层层析得6个馏段(f1.2.1-f1.2.6)，f1.2.6以3％丙酮-二氯甲烷为展开剂进行制备薄层层析得化合物b：克拉维醇(85mg)；f1.2.5经硅胶柱层析，2％丙酮-苯洗脱得化合物c：紫茎泽兰内酯(28mg)。

实施例2

本实施例提供一种药物组合物，其包括紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮或克拉维醇中的至少一种，以及药学上可接受的载体或辅料。

其制备方法包括：

取紫茎泽兰全株干燥粉末10kg，按料液比1:9(1kg药材对应9l的溶剂)用体积浓度为90％的乙醇浸渍4天，过滤取滤液，对滤渣采用同样的操作浸提一次，过滤合并两次提取的滤液，减压浓缩得到紫茎泽兰浸膏780g。按体积比1:9加水混悬，用四倍体积石油醚萃取样品，石油醚萃取液减压浓缩，回收溶剂蒸干，得到紫茎泽兰石油醚萃取物176g。

取100g紫茎泽兰石油醚萃取物，经硅胶柱(200-300目)层析，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯梯度洗脱，得到化合物a：2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮(3.24g)与3个馏段(f1-f3)；f1经硅胶柱层析,2％丙酮-石油醚洗脱得3个馏段(f1.1-f1.3)；f1.2以3％丙酮-苯为展开剂进行制备薄层层析得6个馏段(f1.2.1-f1.2.6)，f1.2.6以6％丙酮-二氯甲烷为展开剂进行制备薄层层析得化合物b：克拉维醇(82mg)；f1.2.5经硅胶柱层析，2％丙酮-苯洗脱得化合物c：紫茎泽兰内酯(24mg)。

实施例3

本实施例提供一种药物组合物，其包括紫茎泽兰内酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮或克拉维醇中的至少一种，以及药学上可接受的载体或辅料。

其制备方法包括：

取紫茎泽兰全株干燥粉末10kg，按料液比1:7(1kg药材对应7l的溶剂)用体积浓度为98％的乙醇浸渍2天，过滤取滤液，对滤渣采用同样的操作浸提两次，过滤合并三次提取的滤液，减压浓缩得到紫茎泽兰浸膏812g。按体积比1:11加水混悬，用两倍体积石油醚萃取样品，石油醚萃取液减压浓缩，回收溶剂蒸干，得到紫茎泽兰石油醚萃取物186g。

取100g紫茎泽兰石油醚萃取物，经硅胶柱(200-300目)层析，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯梯度洗脱，得到化合物a：2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮(3.43g)与3个馏段(f1-f3)；f1经硅胶柱层析,2％丙酮-石油醚洗脱得3个馏段(f1.1-f1.3)；f1.2以5％丙酮-苯为展开剂进行制备薄层层析得6个馏段(f1.2.1-f1.2.6)，f1.2.6以3％丙酮-二氯甲烷为展开剂进行制备薄层层析得化合物b：克拉维醇(87mg)；f1.2.5经硅胶柱层析，2％丙酮-苯洗脱得化合物c：紫茎泽兰内酯(29mg)。

实验例

下面结合药效试验对本发明实施例1～3中提供的紫茎泽兰石油醚萃取物(ea-pe)和三种活性成分进行药效评价，其中三种活性成分具体为：紫茎泽兰内酯(化合物c)、2-乙酰基-3,4,6,11-四氢杜松烷-7-酮(化合物a)、克拉维醇(化合物b)。

实验例一紫茎泽兰石油醚萃取物和三种活性成分对肝癌细胞hepg2与正常肝细胞lo2细胞活力的影响

取对数生长期hepg2细胞株，调节细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔0.2ml接种至96孔培养板，继续培养24h后，每孔分别添加由含10％小牛血清rpmi1640液配制成的待测样品0.2ml，使样品浓度分别为5、10、25、50、100、150、200μg/ml继续培养24h与48h；每个浓度一式3孔，同时设不加测试样品的实验对照和不加样品和细胞的空白对照孔。达到给药时间后每孔加入5μg/ml的mtt20ml继续孵育4h，到达孵育时间后吸弃培养液，每孔加入0.15mldmso，振摇30min，充分溶解细胞内生成的紫色甲臜结晶，于550nm下测定每孔吸光度a值。lo2细胞的培养与给药除给药时间为24h外，其余操作同hepg2。

hepg2与lo2细胞的生长抑制率＝[1-(实验组a值-空白组a值)/(对照组a值-空白组a值)]×100％。使用spss19.0计算半数抑制浓度(ic50)。

结果见图3、图4，化合物a、b、c与紫茎泽兰石油醚萃取物在5-200μg/ml的浓度范围内，对肝癌细胞hepg2均显示较好的活力抑制，也显示出明显的量效、时效关系，但对正常肝细胞lo2影响不大(图3)。化合物a、b、c与紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg224h的ic50分别为44.8、31.8、27.1和25.1μg/ml，48h的ic50分别为31.4、21.4、17.8和13.4μg/ml。上述各化合物以及紫茎泽兰石油醚萃取物对lo2细胞几乎不显示活力抑制，ic10皆大于200μg/ml。

实验例二、紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞形态的影响

取对数生长期的hepg2细胞，以5×10⁴个/孔的浓度接种入6孔板，培养24h，吸弃培养液，加入不同浓度的紫茎泽兰石油醚萃取物(样品浓度分别为10，30，50μg/ml)，加入空白液组(生理盐水)作为阴性对照组，继续培养24h，显微镜明场观察细胞形态后，吸弃培养液，每孔加入固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定后吸弃，加入pbs清洗两遍，每次3min，吸除液体，风干。加入hoechst33258染色液覆盖所有细胞。采用荧光倒置显微镜观察细胞形态。

结果见图5，两个空白组的hepg2细胞呈现良好的贴壁性，总数多、界限清楚、细胞分布均匀、细胞核形态正常、呈圆形或不规则椭圆形、核质分布均匀，细胞呈现均匀荧光。而hepg2细胞经紫茎泽兰提取物处理后，随剂量的增加出现不同程度的凋亡，凋亡细胞特征逐步明显。低剂量组细胞形态不统一，贴壁细胞数量减少，开始出现凋亡小体；中剂量组贴壁细胞数量进一步减少，出现少量的凋亡小体，细胞核可见致密的颗粒性荧光；高剂量组贴壁细胞数量明显减少，细胞核固缩，有较多的凋亡小体出现。

实验例三、紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞周期的影响

细胞培养及给药方法见实验二。细胞给药培养24h后贴壁细胞与漂浮细胞一起收集，采用pbs洗2次，接着加入预先冷却的75％乙醇固定制备成细胞悬浮液，放于-20℃过夜保存。固定的细胞悬液离心，采用pbs洗涤，于37℃下加入1mg/ml的rnasea共孵育1h，接着加入终浓度为50μg/ml的pi染液，过滤，采用流式细胞仪检测细胞的dna，选择氩离子激光为激发光源，激发波长设定为488nm。以顺铂(cddp)为阳性对照药物，其操作同紫茎泽兰石油醚萃取物。

结果见图6，紫茎泽兰石油醚萃取物给药组(10、30、50μg/ml)各剂量下，hepg2周期均发生了明显变化，随剂量增加在g0/g1期不断减少，g2/m期不断增加，并且g1期前出现了程度不断加大的凋亡峰(subg1)，表明紫茎泽兰提取物可以阻滞肝癌细胞g2/m期，并且能诱导这两种肝癌细胞凋亡。

实验例四、紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞dna的影响

细胞凋亡过程中，可发生特异性级联生化反应，其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活，此酶可作用于连接dna的核小体间区域,dna链被切割成180～200bp或其整倍数的片断，抽提dna,经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱。

实验取对数生长期的hepg2，以5×104个/孔的浓度接种入12孔板，培养24h，使细胞贴壁，加入不同浓度的样品液于12孔板，再培养48h，后收集细胞，按照dna提取试剂盒的操作说明提取样本中dna。分别取上述的已提取dna样品液20μl，加入4μl的loadingbuffer，5μl的marker，进行琼脂糖凝胶电泳分析，电压设置为50v，电泳1h，凝胶成像系统摄像分析结果，发射波长为530nm。以顺铂(cddp)为阳性对照药物，其操作同紫茎泽兰石油醚萃取物。

结果见图7，给药组均出现了dna梯形条带(dnaladder)，且随着紫茎泽兰提取物浓度的增加，条带越来越清晰，上述结果清楚的显示紫茎泽兰提取物能诱导hepg2细胞发生凋亡，使其细胞的dna双链发生规律性的断裂。

实验例五、紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2凋亡细胞内蛋白表达的影响

细胞凋亡时，伴随一系列蛋白酶学的改变。bcl-2家族与caspase家族活性变化参与线粒体凋亡通路的启动与执行过程。bcl-2、bax、caspase-3、caspase-9为关键的参与分子，对其进行检测可以反应药物是否诱导肝癌细胞通过线粒体途径凋亡。

细胞培养及给药方法见实验二。取对数生长期的贴壁细胞，加入一定浓度的样品作用48h后，收集细胞液，pbs洗涤，加入细胞裂解液裂解，超声粉碎，沸水浴10min，采用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。制备浓缩胶和分离胶，采用12％sds-page凝胶电泳分离总蛋白，按照免疫印迹方法将胶内蛋白转移至pvdf膜上，用5％脱脂奶粉溶液封闭过夜后，分别加入一抗anti-bax、anti-bcl-2、anti-cleaved-caspase-3、anti-caspase-9、anti-β-actin室温孵育3h，tbst洗涤三次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，tbst洗涤3次，后按照ecl的方法依次加入发光底物、曝光、显影及定影，采用image软件分析条带。

结果见图8(a)，hepg2细胞内的一些重要蛋白的表达水平发生明显变化，随着紫茎泽兰提取物给药浓度的增加，bax、caspase-3表达水平上升，bcl-2的表达水平下降，bcl-2/bax的比值明显降低。这一结果表明，紫茎泽兰提取物是通过影响线粒体凋亡通路的相关蛋白表达，发挥抗肝癌的作用。

实验例六、紫茎泽兰石油醚萃取物对hepg2细胞jak2/stat3信号通路的影响

jak/stat信号转导通路，广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、免疫调节、炎症、肿瘤等多种生理、病理过程。组成型stat3由磷酸化的stat3二聚化形成，是stat3的活化形式，其异常活化主要由其上游元件的异常活化和表达引起。多种酪氨酸激酶均可直接或间接的激活stat3，在jak2/stat3信号转导通路中jak2是stat3的主要上游元件，jak2的磷酸化能激活stat3活性，因此，检测jak2与stat3的磷酸化程度可以反应药物是否通过抑制jak2/stat3信号转导通路诱导肝癌细胞凋亡。

细胞操作与免疫印迹方法见实验五，其中一抗使用anti-jak2、anti-ptyr1007/1008-jak2、anti-stat3、anti-ptyr705-stat3与anti-β-actin。

结果见图8(b)，hepg2细胞内jak2与stat3磷酸化水平都随着紫茎泽兰提取物给药浓度的增加而降低，说明紫茎泽兰提取物诱导肝癌细胞凋亡通过影响jak2/stat3信号转导通路发挥作用，并且紫茎泽兰提取物对stat3活化的抑制作用可能是通过抑制其上游jak2活化而造成的。

综上，紫茎泽兰提取物在体外抗癌活性研究中，显示出良好的效果。紫茎泽兰石油醚提取物能有效的诱导肝癌细胞株发生凋亡，阻滞细胞周期在g2/m期，并且对正常肝细胞影响较小。在对其促凋亡的机制研究发现紫茎泽兰提取物可以增加bax的表达水平，降低bcl-2的水平，从而降低bcl-2/bax的比值，另上调caspase-9、caspase-3的水平，而导致诱导细胞凋亡。

在凋亡蛋白的实验结果中，发现bcl-2的降低，而bcl-2是jak2/stat3信号通路中典型的响应蛋白，因此，发明人以jak2/stat3信号通路为靶点，进一步探索紫茎泽兰提取物促凋亡的机制。结果发现，紫茎泽兰提取物能够呈剂量依赖性地降低jak2与stat3磷酸化水平，其抑制stat3活性可能是通过抑制上游jak2活化而造成的。由此可见，紫茎泽兰提取物极具开发成为抗癌药物的潜力。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。