一种治疗癌症的药物组合物及其用途的制作方法

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及一种治疗癌症的药物组合物及其用途。

背景技术：

鬼箭锦鸡儿，又名冠毛锦鸡儿，其药用部位是豆科植物鬼箭锦鸡儿(caraganajubata(pall.)poir.)的根及枝叶。鬼箭锦鸡儿产地主要分布于西藏、青海、内蒙古、四川等地。鬼箭锦鸡儿味辛、苦、涩，性微寒，归肝、脾、肾经，具有清热解毒、祛风除湿、活血通络、消肿止痛的功效。传统用于治疗乳痈、疮疖肿痛、跌扑损伤、风湿筋骨疼痛等症。根据传统理论与临床用药经验，鬼箭锦鸡儿亦可用于治疗高血压与病毒感染等现代疾病。本发明对鬼箭锦鸡儿进行深入的研究。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种治疗癌症的药物组合物，该药物组合物中包括高丽槐素，能够用于预防和治疗癌症。

本发明的第二目的在于提供一种药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，为癌症的预防或治疗提供新的治疗手段和思路，同时也开发了高丽槐素和鬼箭锦鸡儿新的药用价值。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种治疗癌症的药物组合物，药物组合物包括高丽槐素，以及药学上可接受的载体或辅料。

一种药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，药物组合物包括高丽槐素，以及药学上可接受的载体或辅料。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明通过研究发现，高丽槐素具有优良的抗癌活性，其通过诱导癌细胞凋亡和阻滞癌细胞周期来发挥功效，可用于制备临床抗癌药物，为癌症的预防或治疗提供新的治疗手段和思路，同时也开发了高丽槐素和鬼箭锦鸡儿新的药用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中鬼箭锦鸡儿提取物的提取流程图；

图2为实施例2中高丽槐素的分离流程图；

图3为实验例一中鬼箭锦鸡儿提取物对hepg2、hep3b、hek-293细胞活力的影响；

图4为实验例一中高丽槐素对hepg2、hep3b、hek-293细胞活力的影响；

图5为实验例二中鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hepg2细胞形态的影响；

图6为实验例三中鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hepg2和hep3b细胞周期的影响；

图7为实验例四中鬼箭锦鸡儿提取物对hepg2细胞dna的影响；

图8为实验例五中鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hepg2凋亡细胞内蛋白表达的影响；

图9为实验例六中鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用；

图10为实验例六中鬼箭锦鸡儿提取物对小鼠的免疫器官及免疫指数的影响；

图11为实验例六中鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的肿瘤细胞凋亡的影响，其中图a为空白组，图b为顺铂组，图c为ma给药剂量25mg/kg组，图d为ma给药剂量50mg/kg组，图e为ma给药剂量100mg/kg组；

图12为实验例六中鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的肿瘤细胞内与凋亡相关蛋白的影响；

以上图中，normalcontrol表示正常组，cddp表示顺铂阳性药物组，cj-etoh表示鬼箭锦鸡儿提取物，ma表示高丽槐素。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包括高丽槐素，以及药学上可接受的载体或辅料。

其中，高丽槐素的结构式为：

高丽槐素可以从市场上购买得到，也可以采用从药材鬼箭锦鸡儿或者替他药材中提取的。

进一步的，该药物组合物包括鬼箭锦鸡儿提取物，鬼箭锦鸡儿提取物中含有高丽槐素。研究证明，鬼箭锦鸡儿提取物也具有抑制癌细胞的活性，尤其是抑制肝癌细胞的活性，可用于预防或者治疗各种癌症，尤其是肝癌。

进一步的，从药材鬼箭锦鸡儿中分离得到高丽槐素的方法包括：

步骤s1:以醇-水混合溶液体系或醇溶液为提取剂，采用溶剂提取法提取药材鬼箭锦鸡儿，得到鬼箭锦鸡儿提取物。

其中，溶剂提取法包括浸渍法、渗漉法、加热回流法、微波振荡法或煎煮法中的任意一种。可选的，溶剂提取法为浸渍法。

其中，提取剂为醇-水混合溶剂体系，可选的，提取剂为体积分数为60～95％的乙醇溶液；或者为75～95％的乙醇溶液。

可选的，采用95％的乙醇溶液以料液比1：8～10浸渍处理鬼箭锦鸡儿2～4天。可选的，浸渍1～3次，每次2～4天。

步骤s2:用氯仿萃取所述鬼箭锦鸡儿提取物后，得到氯仿萃取物；采用硅胶色谱柱分离所述氯仿萃取物，用氯仿-乙酸乙酯混合溶剂体系进行梯度洗脱。

较为具体的，萃取步骤为：将鬼箭锦鸡儿提取物按照体积比1：10加水混悬后，用2～3倍体积的氯仿萃取，将有机相减压浓缩后，得氯仿萃取物。

用硅胶色谱柱分离氯仿萃取物，其中硅胶的目数为100～200目。洗脱剂为氯仿-甲醇混合溶剂，以氯仿：甲醇的体积比为98：2开始洗脱，逐渐增加甲醇的比例至氯仿：甲醇的体积比为6：4。

经硅胶柱分离后得到含有高丽槐素的流份，再采用凝胶色谱法对该流份进行分离，最后采用制备型高效液相色谱法制备得到高丽槐素。

本实施方式还提供一种药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，该药物组合物包括高丽槐素，以及药学上可接受的载体或辅料。

发明人研究表明，高丽槐素以及鬼箭锦鸡儿提取物均具有优良的抗癌活性，进一步研究发现，其通过促进癌细胞凋亡和阻滞癌细胞周期来起到抗癌活性的，可用于临床抗癌用药。

进一步的，发明人经细胞试验证实，高丽槐素以及鬼箭锦鸡儿提取物是通过影响线粒体凋亡信号转导通路来诱导癌细胞凋亡的。

bcl-2家族的表达和调控是影响线粒体细胞凋亡信号转导的关键因素之一，其主要作用位点在线粒体膜上。细胞受到死亡信号刺激后，bcl-2家族中的促凋亡蛋白在蛋白酶作用下发生构像变化，从细胞浆移位到细胞器膜上，尤其是线粒体外膜上，并与细胞器膜上和膜内的抗凋亡蛋白相互作用，使抗凋亡蛋白丧失对凋亡的抑制作用，引起细胞器功能丧失和各种促凋亡因子的释放，最终导致癌细胞凋亡。

bcl-2和bax分别是bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，并且bcl-2是stat3经典的靶基因表达蛋白。在正常肝组织中，bcl-2通常表达阴性，而bax表达阳性。但在如肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌和膀胱癌等恶性肿瘤中，都观察到了bcl-2的上调与bax下调，并且细胞分化程度越低，这种趋势更加明显。

发明人研究发现，高丽槐素以及鬼箭锦鸡儿提取物均能够上调bax蛋白的表达水平，略微下调bcl-2蛋白的表达水平，从而降低bcl-2/bax的比值。

bcl-2/bax比值的改变，最终导致caspase家族引起的细胞凋亡。caspase家族是一类能特异性识别天冬氨酸位点的半胱氨酸蛋白酶，参与细胞凋亡信号转导的多个过程。在线粒体细胞介导的凋亡通路中，caspase家族参与凋亡信号的放大与凋亡效应，通过酶促级联反应的方式放大凋亡信号，并催化凋亡相关效应蛋白，最终导致细胞的凋亡。如在bcl-2家族的调控下，线粒体释放凋亡活化因子1(apaf1)，apaf1结合细胞色素c(cytoc)、atp，并经过自身构象变化及自身活化，使apaf1n端形成一种表面结构，可活化caspase8/9，再进一步活化caspase3/6/7，最终caspase3/6/7催化一系列凋亡相关底物，引起细胞凋亡。

发明人研究发现，高丽槐素以及鬼箭锦鸡儿提取物能够上调caspase-3的表达水平，从而通过酶促级联反应的方式放大凋亡信号，最终导致癌细胞的凋亡。

进一步的，研究发现该药物组合物是通过阻滞癌细胞周期来预防或治疗癌症的。

细胞周期调控是机体维持细胞状态的另一重要手段。癌变细胞除了抵抗凋亡过程，往往还表现异常的增殖能力。如p53、brca1、rb、p16、p15以及p53、brca1的下游调控基因如p21、gadd45是细胞周期监测点的重要组成部分。但在多数肿瘤发生过程中，这些抑癌基因多有基因改变而失活，造成细胞周期监测点功能缺陷，最终结果是细胞获得失控性增殖能力，导致肿瘤的发生。

发明人研究发现，高丽槐素以及鬼箭锦鸡儿提取物能够阻断癌细胞的细胞周期，使其停滞在g2/m期，并且能够诱导这类癌细胞发生凋亡。

由此说明，该药物组合物可以用于癌症的治疗，例如肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌或膀胱癌。可选的，用于肝癌的治疗。

进一步的，为了使该药物快速、连续并在很长一段时间里释放活性成分，本发明的药物组合物可以根据公开在那些本技术领域中的常规方法制造。本实施方式的药物的给药途径可以为口服、鼻吸入、或肠胃外给药。包含该组合物的制剂可以是片剂、软胶囊、硬胶囊、口服液、丸剂、栓剂、粉末、颗粒、乳剂、糖浆、气雾剂、灭菌注射剂、和灭菌粉等。

本发明中，术语“药学上可接受的”指当化合物给人类施用时该化合物是生理上可接受的，且不会发生胃肠道紊乱、头晕等过敏反应或者类似这些过敏反应的全身过敏反应。

在本发明中，“药学上可接受的载体或辅料”包括但不限于：粘合剂(如微晶纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(如淀粉、蔗糖、葡萄糖和无水乳酸)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、和低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(硬脂酸镁、硬脂酸铝、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠)、润湿剂(如甘油)、表面活性剂(如十六烷醇)以及吸收促进剂、矫味剂、甜味剂、稀释剂、包衣剂等。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种药物组合物，其包括：鬼箭锦鸡儿提取物，以及药学上可接受的载体或辅料。

其中鬼箭锦鸡儿提取物的制备方法包括：

如图1所示，取鬼箭锦鸡儿根的干燥粉末10kg，按料液比1:8(1kg药材对应8l的溶剂)用体积浓度为95％的乙醇浸渍3天，过滤取滤液。对滤渣采用同样的操作浸提两次，过滤合并三次提取的滤液，减压浓缩得到鬼箭锦鸡儿提取物763g。

实施例2

本实施例提供一种药物组合物，其包括：高丽槐素，以及药学上可接受的载体或辅料。

其中高丽槐素的制备方法包括：

a.参照实施例1的方法制备鬼箭锦鸡儿提取物。

b.如图2所示，取300g的鬼箭锦鸡儿提取物按体积比1:10加水混悬，用3倍体积三氯甲烷萃取样品，萃取液减压浓缩，回收溶剂蒸干，得到63g三氯甲烷萃取物。

c.取60g的三氯甲烷萃取物，经硅胶色谱柱分离，以三氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂体系进行梯度洗脱，得到含有高丽槐素的流份。该流份经sephadexlh-20柱色谱分离，以含0.1％甲酸的甲醇溶液洗脱，tlc检测追踪合并，得到a、b、c、d4个部分。取b部分(1.6g)用制备型高效液相进行分离，以甲醇和水为流动性进行梯度洗脱，分离得到高丽槐素330mg。

实验例

下面结合药效试验对本发明实施例1～2中提供的鬼箭锦鸡儿提取物(cj-etoh)和高丽槐素(ma)进行药效评价。

实验例一、鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hepg2、hep3b、hek-293细胞活力的影响

取对数生长期hepg2、hep3b、hek-293三种细胞株，调节细胞浓度为5×10⁴个/ml，每孔0.2ml接种至96孔培养板，继续培养24h后，每孔分别添加由含10％小牛血清rpmi1640液配制成的待测样品0.1ml，使样品浓度分别为5、10、20、40、100、200mg/ml继续培养；每个浓度一式3孔，同时设不加测试样品的实验对照和不加样品和细胞的空白对照培养24、48、72h后，分别换液1次，培养72h后，加入5mg/ml的mtt20ml继续培养4h后，吸弃培养液，每孔加入0.15mldmso，振摇30min，充分溶解细胞内生成的紫色甲臜结晶，于550nm下测定每孔a值。计算生长抑制率(％)和半数抑制浓度(ic50)。其中，生长抑制率的计算公式为：

生长抑制率＝[1-(实验组a值-空白组a值)/(对照组a值-空白组a值)]×100％。

结果见图3、图4，鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素在5-200μg/ml的浓度范围内，对hepg2、hep3b肝癌细胞均显示一定的活力抑制，也显示出明显的量效关系。鬼箭锦鸡儿提取物对这两种肿瘤细胞的ic50分别为42.7和48.2μg/ml(图3)；高丽槐素对两种肿瘤细胞的ic50分别为23.6和35.5μg/ml(图4)。在200μg/ml的浓度下鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hek-293细胞几乎不显示抑制作用。

实验例二、鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hepg2细胞形态的影响

取对数生长期的hepg2细胞，以5×10⁴个/孔的浓度接种入6孔板，培养24h，吸弃培养液，加入不同浓度的鬼箭锦鸡儿提取物(样品浓度分别为30，60，120μg/ml)，加入空白液组(生理盐水)作为阴性对照组，继续培养48h，吸弃培养液，每孔加入固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定后吸弃，加入pbs清洗两遍，每次3分钟，吸除液体，风干。加入hoechst33258染色液覆盖所有细胞。采用荧光倒置显微镜观察细胞形态。

结果见图5，两个空白组的hepg2细胞呈现良好的贴壁性，总数多、界限清楚、细胞分布均匀、细胞核形态正常、呈圆形或不规则椭圆形、核质分布均匀，细胞呈现均匀荧光。而hepg2细胞经鬼箭锦鸡儿提取物或高丽槐素处理后，随剂量的增加出现不同程度的凋亡，凋亡细胞特征逐步明显。低剂量组(30μg/ml)细胞形态不统一，贴壁细胞数量减少，开始出现凋亡小体；中剂量组(60μg/ml)贴壁细胞数量进一步减少，出现少量的凋亡小体，细胞核可见致密的颗粒性荧光；高剂量组(120μg/ml)贴壁细胞数量明显减少，细胞核固缩，有较多的凋亡小体出现。

实验例三、鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hepg2细胞周期的影响

细胞培养及给药方法见实验二。细胞给药培养24h后贴壁细胞与漂浮细胞一起收集，采用pbs洗2次，接着加入预先冷却的75％乙醇固定制备成细胞悬浮液，放于-20℃过夜保存。固定的细胞悬液离心，采用pbs洗涤，于37℃下加入1mg/ml的rnasea共孵育1h，接着加入终浓度为50μg/ml的pi染液，过滤，采用流式细胞仪检测细胞的dna，选择氩离子激光为激发光源，激发波长设定为488nm。

结果见图6，在鬼箭锦鸡儿提取物或高丽槐素给药组(60、120μg/ml)各剂量下，hepg2周期均发生了明显变化，并且在g1期前出现了凋亡峰，表明鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素不仅影响hepg2与hep3b的细胞周期，并且能诱导这两种肝癌细胞凋亡。

实验例四、鬼箭锦鸡儿提取物对hepg2细胞dna的影响

细胞凋亡过程中，可发生特异性级联生化反应，其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活，此酶可作用于连接dna的核小体间区域,dna链被切割成180～200bp或其整倍数的片断，抽提dna,经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱。

取对数生长期的hepg2，以5×10⁴个/孔的浓度接种入12孔板，培养24h，使细胞贴壁，加入不同浓度的样品液于12孔板，再培养48h，后收集细胞，按照dna提取试剂盒的操作说明提取样本中dna。分别取上述的已提取dna样品液20μl，加入4μl的上样缓冲液，5μl的标记物，进行琼脂糖凝胶电泳分析，电压设置为50v，电泳1h，凝胶成像系统摄像分析结果，发射波长为530nm。

结果见图7，给药组均出现了dna梯形条带(dnaladder)，且随着鬼箭锦鸡儿提取物浓度的增加，条带越来越清晰，上述结果清楚的显示鬼箭锦鸡儿提取物能诱导hepg2细胞发生凋亡，使其细胞的dna双链发生规律性的断裂。

实验例五、鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素对hepg2凋亡细胞内蛋白表达的影响

细胞凋亡时，伴随一系列蛋白酶学的改变。bcl-2家族与caspase家族活性变化参与线粒体凋亡通路的启动与执行过程。bcl-2、bax、caspase-3、caspase-9为关键的参与分子，对其进行检测可以反应药物是否诱导肝癌细胞通过线粒体途径凋亡。

细胞培养及给药方法见实验例二。取对数生长期的贴壁细胞，加入一定浓度的样品作用48h后，收集细胞液，pbs洗涤，加入细胞裂解液裂解，超声粉碎，沸水浴10min，采用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。制备浓缩胶和分离胶，采用12％sds-page凝胶电泳分离总蛋白，按照免疫印迹方法将胶内蛋白转移至pvdf膜上，用5％的脱脂奶粉溶液封闭过夜后，分别加入bax、bcl-2、caspase-3、caspase-9、β-actin等抗体室温孵育3h，tbst洗涤三次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，tbst洗涤3次，后按照ecl的方法依次加入发光底物、曝光、显影及定影，采用image软件分析条带。

结果见图8，hepg2细胞内的一些重要蛋白的表达水平发生明显变化，随着鬼箭锦鸡儿提取物或高丽槐素给药浓度的增加，bax、caspase-3表达水平上升，bcl-2的表达水平下降，bcl-2/bax的比值明显降低。这一结果表明，鬼箭锦鸡儿提取物以及高丽槐素能够通过影响线粒体凋亡通路的相关蛋白表达，发挥抗肝癌的作用。

实验例六、鬼箭锦鸡儿提取物体内抗肝癌活性评价

1.实验方法

实验动物采用昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22g，从湖北省疾病预防控制中心购买，许可证号：scxk(e)2008-0005，h22腹水瘤细胞由中南民族大学药学院杨新洲老师惠赠。

取生长良好无溃破的荷h22腹水瘤小鼠，脱臼处死，在超净台中吸取呈乳黄色的腹腔瘤液，于显微镜下观察分理出状态良好的细胞，用无菌生理盐水稀释至1×106个/ml的细胞悬液。再用无菌氯化钠注射液稀释(1:3)成细胞悬液，在小鼠又前肢腋窝皮下接种200μl。24h后，将小鼠随机分组，每组10只，分别设置空白对照组(注射生理盐水)，样品对照组(注射顺铂(cddp)，5mg/kg)，鬼箭锦鸡儿提取物高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg)。按20g体重最大给药体积0.4ml的量腹腔注射给药，每日1次，连续给药10d。

10日后，处死小鼠，解剖剥取腋下实体瘤，称重并记录，肿瘤抑制率按照以下公式计算：肿瘤抑制率ir(％)＝(空白组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白组瘤重。

对第10日处死的小鼠，解剖，剥取胸腺、脾脏和肝脏，每个脏器均称重。免疫器官指数按以下公式计算：免疫器官指数＝免疫器官重量(mg)/小鼠重量(g)。

对处死的小鼠，采取摘取眼球取血的方法收集给药组的小鼠血液，经edta抗凝，检测白细胞数(wbc)、红细胞数(rbc)、血红蛋白(hgb)、血小板数(plt)；经肝素抗凝的血再离心，取上清测定肝肾功能指数，包括转氨酶(ast、alt)、尿素氮(bun)、尿酸(ua)及肌酐(cre)。

对处死的小鼠，剥取给药组的荷瘤小鼠的瘤块，每组瘤块剪取相同质量，置于匀浆器中放在冰上匀浆，加入100mmnacl，50mmherps，0.1％chaps，1mmdtt及0.1mmedta。所得匀浆混悬液在4℃下高速离心10min。按照实验例六所述的westernblotting方法检测与凋亡的蛋白。

2.实验结果

结果采用平均值±标准差(mean±sem)来表示，所有的统计分析采用graphpadprism5.0进行分析，^*p<0.05表明具有显著性差异，^**p<0.01表明具有极显著性差异。

2.1鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用

结果见图9，鬼箭锦鸡儿提取物各剂量组对h22荷瘤小鼠肿瘤生长均具有明显的抑制作用(^*p<0.05)，且具有一定量效关系，药物浓度与肿瘤抑制率显示出明显的相关性，且鬼箭锦鸡儿提取物高剂量组显示出最好的活性。

2.2鬼箭锦鸡儿提取物对小鼠的免疫器官及免疫指数的影响

结果见图10，鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的免疫器官，如胸腺和脾脏的脏器指数影响不大，与空白组比较并无较大差异(p>0.05)；而顺铂组的脏器指数相较空白组则显著下降(^**p<0.01)。这一结果说明鬼箭锦鸡儿提取物对小鼠免疫能力的损坏不大。

2.3鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的血液指标的影响

结果见表1，阳性药顺铂组明显降低h22荷瘤小鼠血液中白细胞数，而红细胞数、血红蛋白、血小板数有略微提高；而相对于顺铂组，鬼箭锦鸡儿提取物各个剂量组均显著提高小鼠血液中的白细胞数，并没有顺铂组出现的免疫系统功能低下的问题。

表1鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的血液指标的影响

2.4鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的肝肾功能的影响

尿素氮(bun)、尿酸(ua)、尿肌酐(cre)是检测肾功能的重要指标，谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)是检测肝功的重要指标。发明人测试了以上评价肝功、肾功能的5个重要的临床指标，结果见表2，经鬼箭锦鸡儿提取物治疗的h22荷瘤小鼠的肝肾功能指标均较空白组的有一定改善，而顺铂对小鼠的肝肾功能具有明显的降低，这一结果表明鬼箭锦鸡儿提取物不同于顺铂对小鼠的肝肾器官具有较大的毒性，反而对小鼠的肝肾功能有一定的改善作用。

表2mh22荷瘤小鼠的肝肾功能的影响

2.5鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的肿瘤细胞凋亡的影响

按照前面描述的实验操作，我们取出瘤块，进行hoechst染色，结果见图11，与顺铂组类似，2个鬼箭锦鸡儿提取物治疗组(中、高剂量组)的肿瘤组织切片经荧光显微镜观察，均不同程度出现核固缩和核断裂的典型细胞凋亡现象。

2.6鬼箭锦鸡儿提取物对h22荷瘤小鼠的肿瘤细胞内与凋亡相关蛋白的影响

结果见图12，与鬼箭锦鸡儿提取物对hepg2细胞内与凋亡相关的蛋白的影响相似，鬼箭锦鸡儿提取物给药组中，h22瘤块中细胞内的一些重要蛋白的表达水平发生明显变化，随着给药浓度的增加，bax、caspase-3表达水平上升，bcl-2的表达水平下降，bcl-2/bax的比值明显降低。这一结果表明，鬼箭锦鸡儿提取物在体内同样通过影响线粒体凋亡通路的相关蛋白表达，发挥抗肝癌的作用。

综上，鬼箭锦鸡儿提取物不论是在体外还是在体内抗肝癌活性研究，均显示良好的效果。在体外抗肝癌活性活性研究中，鬼箭锦鸡儿提取物能有效的诱导两种肝癌细胞株发生凋亡，阻断细胞周期在g2/m期。在对其凋亡的机制研究发现鬼箭锦鸡儿提取物可以增加bax蛋白的表达水平，略微降低bcl-2的水平，从而降低bcl-2/bax的比值，另上调caspase-3的水平，而导致诱导细胞凋亡。体内抗肝癌动物实验显示，鬼箭锦鸡儿提取物中、高剂量能显著抑制h22荷瘤小鼠肿瘤的生长，且对动物的免疫器官、肝肾、造血系统并不显示很强的毒副作用，对其体内抗肝癌活性研究发现，鬼箭锦鸡儿提取物也可以增加bax蛋白的表达水平，略微降低bcl-2的水平，从而降低bcl-2/bax的比值，另上调caspase-3的水平，通过诱导h22细胞凋亡来发挥抗癌活性。体内外抗肝癌实验的结果可以相互验证，证明鬼箭锦鸡儿提取物是一个潜在的值得开发的抗肝癌药物。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。