土木香内酯作为抗血管生成药物的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是土木香内酯作为抗血管生成药物的应用。

背景技术：

土木香为菊科旋覆花属植物，为多年生草本，其根供药用。在欧洲和中国西藏均有栽培。土木香在欧洲主要用于利尿、祛痰和健胃，在中国则主要用于治疗胃肠炎、支气管炎及结核性腹泻等。研究表明土木香中含有大量倍半萜内酯，其主要成分土木香内酯具有较强的抗菌和消炎作用。而近年来国内外对土木香药理活性的研究发现，土木香内酯类成分有抗肿瘤细胞增殖的作用，并对其抑制肿瘤生长的作用机制进行了研究。

土木香内酯(alantolactone)是一种萜类化合物，化学名：3a,5,6,7,8,8a,9,9a-八氢-5,8a-二甲基-3-亚甲基萘并[2,3-b]呋喃-2(3h)-酮，化学式：c15h20o2，分子量：232.32，cas号：546-43-0。

中国专利文献cn102973554a公开了土木香内酯在制备防治肠炎的药物或食品中的应用。中国专利文献cn103505454a公开了土木香内酯作为α-微管蛋白抑制剂的用途。中国专利文献cn104666295a公开了土木香内酯在制备抗微小隐孢子虫药物中的应用。中国专利文献cn103251667a公开了土木香总倍半萜内酯(含有土木香内酯和异土木香内酯，两酯的含量之和为60-90％)在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。中国专利文献cn104771430a公开了土木香总内酯(土木香内酯、异土木香内酯含量占总内酯的90％)在制备治疗肠易激综合症的药物中的应用。中国专利文献cn106496169a、cn106491592a、cn106491594a、cn106491593a等公开了土木香内酯衍生物及其医药领域的用途。但却至今尚未有关于土木香内酯抗血管生成作用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供土木香内酯的一种新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：土木香内酯在制备抑制血管生成药物中的应用。

进一步地，所述的血管生成为肿瘤血管新生。

进一步地，所述的肿瘤血管新生为肿瘤病变组织的血管新生或肿瘤导致的血管新生。

进一步地，所述的肿瘤血管新生为白血病、淋巴瘤或骨髓瘤血液癌症的血管新生。

进一步地，所述的血管生成为银屑病病变组织血管新生、paget’s疾病血管新生、良性血管增生疾病的血管新生、关节炎病变组织的血管新生、动脉粥样硬化病变处的血管新生或新生血管性眼病的血管生成，所述的新生血管性眼病为原发性或继发性新生血管性眼病。

土木香内酯作为单一成分或与其它药学上可接受的成分构成组合物在制备抑制血管生成的药物中的应用，所述的其它药学上可接受的成分是与土木香内酯没有拮抗作用的药物，或药学上允许的一种或多种辅料。

土木香内酯在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

土木香内酯作为vegfr2磷酸化的抑制剂的应用。

进一步地，所述的药物剂型为胶囊剂、片剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。

进一步地，所述的药物的给药方式为注射、口服、吸入式喷雾或透皮给药。

本发明优点在于：

1、本发明首次发现了土木香主要成分土木香内酯具有抗血管生成作用，并对其抗肿瘤作用，抗血管生成的作用机制进行了较为系统的详细研究。

2、本发明首次通过cck-8法检测huvec细胞活力、细胞运动性抑制实验、细胞迁移抑制实验、小管形成抑制实验、体内抗血管生成活性实验等发现，土木香内酯可有效抗血管生成。

3、本发明首次发现，土木香内酯对雌性balb/c裸鼠中mda-mb-231乳腺肿瘤具有抑制作用，具备治疗乳腺肿瘤的前景。

4、本发明首次通过对vegfr2及下游信号通路作用的研究发现，土木香内酯可以显著抑制vegfr2的磷酸化，显著抑制vegfr2下游信号分子包括plcγ1，fak，src，akt的磷酸化。

附图说明

附图1：土木香内酯对人脐静脉内皮细胞(huvec)及mda-mb-231人乳腺癌细胞细胞活力的影响(增殖的抑制作用)。a，土木香内酯分子结构。b,不同浓度的土木香内酯(1，3，10，30，100μm)分别孵育huvec和mda-mb-231细胞48h后，用cck8法测定huvec及mda-mb-231的细胞活力。c和d，不同浓度的土木香内酯(1，3，10，30，100μm)作用huvec细胞24h后，用calcein-am/pi活细胞/死细胞双染法测定huvec细胞的活性，拍照并统计结果。

附图2：一定浓度的土木香内酯可以抑制人脐静脉内皮细胞(huvec)的运动、迁移和小管生成。a，不同浓度的土木香内酯作用20h后，根据说明用hcsreagentcellmotilityassaykit试剂盒结合高内涵仪器测定huvec的运动性(黑色运动轨迹的面积)，柱状图表示相应的统计结果。b，用transwell小室法考察加药作用8h后，土木香内酯对huvec迁移的抑制作用。实验结束拍照后，采用ipp图片处理软件统计照片中的细胞数并用柱状图表示。c,不同浓度的土木香内酯作用10h后，观察matrigel包被的96孔板中huvec形成小管的情况，拍照并统计结果。图2的a～c所附照片中的土木香内酯处理组，土木香内酯的浓度均为30μm。实验结果用mean±sd表示。**p<0.01，***p<0.001与不加药处理的空白对照组相比。

附图3：土木香内酯抑制鸡胚绒毛尿囊膜上的血管生成。将浸有不同浓度土木香内酯的无菌滤纸片放置于鸡胚绒毛尿囊膜上，作用48h后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上血管形成情况，并用mage-proplus6.0软件统计血管长度。实验结果用mean±sd表示。***p<0.001与不加药处理的空白对照组相比。

附图4：土木香内酯对雌性balb/c裸鼠中mda-mb-231乳腺肿瘤的抑制作用。土木香内酯在对荷瘤裸鼠体重无明显影响，即无明显毒副作用的情况下可以显著抑制balb/c裸鼠中乳腺肿瘤的生长。实验结果用mean±sd表示，n＝5,**p<0.01与不加药处理的空白对照组相比。mda-mb-231乳腺肿瘤免疫组织化学染色分析。以土木香内酯5mg/kg的剂量对荷瘤裸鼠腹腔隔天给药，连续给药15天，给药结束后处死荷瘤裸鼠，并取出肿瘤组织固定以进行免疫组化染色分析。肿瘤组织微血管密度，tunel的代表图片及统计分析，h&e染色，及肿瘤坏死面积的统计分析。分析结果mean±sd表示，n＝5,***p<0.001与不加药处理的空白对照组相比。一定浓度的土木香内酯可以降低肿瘤组织中的微血管密度,促进肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡、坏死。

附图5：一定浓度(30μm～100μm)的土木香内酯可以显著抑制vegfr2的磷酸化。不同浓度的土木香内酯作用0.5h后，用100ng/ml的vegf刺激4min,一定浓度的土木香内酯可以降低vegfr2的磷酸化程度。一定浓度的土木香内酯可以显著抑制vegfr2下游信号分子包括plcγ1，fak，src，akt的磷酸化。不同浓度的土木香内酯作用huvec细胞0.5h后，用100ng/ml的vegf刺激4min,用westernblot考察土木香内酯对vegfr2下游信号通路包括plcγ1，fak，src，akt磷酸化的影响。n＝3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001与不加药处理的空白对照组相比。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1cck-8法检测huvec细胞活力

huvec细胞以2.5×10⁴/ml的细胞密度接种于96孔板(每孔200ul)中。培养24h待细胞达到80％融合后，将培养液换成浓度为1，3，10，30，100μm的土木香内酯溶液。作用48h后吸出含药培养基，每孔加入与培养基1:10稀释的cck-8稀释液，并置于培养箱中继续孵育2h，然后用酶标仪在450nm处测定板中cck-8溶液的od值。同时设置加有cck-8溶液及培养基但不含细胞的孔作为空白对照，以含细胞但不加药的孔作为对照。细胞活力计算公式为：细胞活力(％)＝[(odsample–odblank)/(odcontrol–odblank)]×100％。

实施例2细胞运动性抑制实验

采用cellomicscellmotilitykit测量迁移细胞的运动轨迹来考察huvec的运动性。在用胶原蛋白-i(collagen-i)包被好的96孔板中加入蓝色的荧光微球粉，于黑暗处孵育1h。用pbs将孵育好的96孔板浸洗5遍。将huvec消化离心后重悬，调整细胞密度为5×10³/ml。用细胞悬液稀释土木香内酯终浓度分别为1，3，10，30和100μm，将100μl含药细胞悬液加入铺有蓝色微球粉的96孔板中。同时设置不加药物组作为对照。然后将培养板置于培养箱中继续培养20h后，在每孔中直接加入200μl预热好的5.5％的固定溶液，在室温下作用1h。将96孔板用pbs洗3遍，并加入透化缓冲液作用30min后，加入罗丹明-鬼丙环肽染色15min。采用高内涵药物筛选系统测定细胞运动的轨迹(罗丹明，ex:542nm，em:565nm；蓝色微球粉，ex:365nm，em:415nm)。huvec运动性抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(acontrol-asample)/acontrol×100％。

实施例3细胞迁移抑制实验

将corning的transwell24孔板的下室中加入600μl含20ng/ml的vegf165的培养液。消化离心huvec细胞，用细胞浓度为2×10⁴/ml的细胞悬液稀释土木香内酯终浓度分别为1，3，10，30和100μm，将100μl含药细胞悬液加入上室。同时设置不加药物组为对照组。将培养板置于细胞培养箱，继续培养8h后，吸出孔中培养液，加入600μl4％多聚甲醛固定已迁移的huvec细胞15min，用棉签轻轻擦掉上室表面未迁移的细胞，然后在下室加入300μl0.1％结晶紫溶液染色25min。最后，用pbs浸洗五次。在zeiss倒置显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。细胞迁移抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(细胞迁移数control–细胞迁移数sample)/细胞迁移数control×100％。

实施例4小管形成抑制实验

在冰水浴中过夜融化matrigel胶，用预冷的枪头取50μlmatrigel于预冷的96孔板中，在室温放置5min使matrigel液面水平，然后在37℃的环境下孵育1h，使胶固化。将huvec消化离心后重悬，并调整huvec细胞密度为1×10⁴/ml。用细胞悬液稀释土木香内酯终浓度分别为1，3，10，30和100μm，将100μl含药细胞悬液加入铺有matrigel的96孔板中。同时设置不加药物组作为对照组。然后将培养板置于培养箱中培养。10h后在evos显微镜下观察小管形成情况。采用ipp6.0图像分析软件(image-proplus6.0)统计各组细胞形成小管的长度，记作l。huvec小管形成抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(lcontrol-lsample)/lcontrol×100％。

实施例5土木香内酯体内抗血管生成活性研究

将购得的受精蛋用75％酒精擦洗消毒，气室朝上，置于(37±0.5)℃恒温箱中孵化培养。恒温箱中放置湿盘，以保持其相对湿度在60％左右，每天翻蛋2次。孵育培养3d后，置于投射灯下观察受精蛋发育情况，剔除未发育蛋，并将已发育蛋随机分组，每组7枚。继续孵育3d后，用砂轮及镊子在受精蛋钝端磨切打开一个1～2cm²的窗口(磨切时，用力要轻，以免伤及软壳膜引起绒毛尿囊膜血管破裂出血)，然后用牙科镊掀开已打开的孔壳，掀起并撕去软壳膜后将浸润有不同浓度(10μm，30μm，100μm)土木香内酯溶液的圆形滤纸片放置在鸡胚绒毛尿囊膜上。用无菌封口膜封口后，置于恒温培养箱中继续孵育。设置生理盐水组作为对照组(control)。48h后，打开窗口观察不同处理组鸡胚绒毛尿囊膜上血管形成情况，并拍照统计。

实施例6土木香内酯治疗mda-mb-231人乳腺癌肿瘤的药效学研究

取对数期生长的mda-mb-231人乳腺癌细胞消化并稀释为2×10⁷/ml密度的细胞悬液，然后接种于balb/c裸鼠右腋皮下(200μl/只)。每天观察肿瘤的生长情况，待肿瘤体积达到～60mm³后，将荷瘤小鼠随机分为2组，并开始给药。治疗组，按照土木香内酯的量5mg/kg隔天腹腔给药，连续给药15天。对照组(control)用生理盐水做相同处理。从第一次给药开始，每次给药时随即对荷瘤裸鼠称重，游标卡尺测量肿瘤的长和宽并记录。同时观察肿瘤的生长状况及裸鼠的健康状况。肿瘤体积(tumorvolume)计算公式：v＝(length×width²)/2给药结束后，处死所有治疗组及对照组荷瘤裸鼠，剥离出mda-mb-231乳腺癌肿瘤，称重并记录。cd31染色，tunel以分别考察肿瘤组织坏死面积，肿瘤组织内微血管密度和肿瘤组织内细胞凋亡情况。在显微镜下观察切片染色结果并拍照。用ipp6.0图像分析软件分析治疗组及对照组裸鼠的mda-mb-231肿瘤坏死面积，微血管密度和肿瘤细胞凋亡阳性比率。

实施例7土木香内酯对vegfr2及下游信号通路作用的研究

取对数生长期的huvec细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并制成浓度为0.5×10⁵/ml的单细胞悬液，以2ml/孔的量接种于6孔板中，置于37℃，5％co2恒温细胞培养箱中培养过夜。待板中细胞生长至70％～80％后，分成不同处理组并用不同浓度的土木香内酯溶液分别处理0.5h。最后加入终浓度为100ng/ml的vegf刺激4min。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。