紫草α‑糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法与流程

本发明属医药
技术领域：
，具体涉及一种紫草α-糖苷酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法以及它在降血糖、减肥、降血脂、治疗糖尿病等方面的医药用途。
背景技术：
：技术背景紫草lithospermumerythrorhizon为紫草科植物的干燥根，主产于辽宁、湖南、河北、新疆等地。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。生用。新疆紫草（软紫草）呈不规则的长圆柱形，多扭曲；内蒙紫草呈圆锥形或圆柱形，扭曲。紫草是一种中药材，性味甘、咸，具有清热凉血、活血、解毒透疹等功效。本品煎剂、紫草素、二甲基戊烯酰紫草素、二甲基丙烯酰紫草素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等具有抑制作用；紫草素对大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用；其乙醚、水、乙醇提取物均有一定的抗炎作用；新疆产紫草根煎剂对心脏有明显的兴奋作用；新疆紫草中提取的紫草素及石油醚部分有抗肿瘤作用；本品有抗生育、解热等作用。本发明通过大规模、系统地活性筛选，意外地发现维吾尔药紫草提取物及其部分化学组分，具有显著地α-糖苷酶抑制活性，该活性提取物及其组合物有望应用于降血糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面。技术实现要素：维吾尔药紫草经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（sio2）柱分离，上样后的硅胶柱，用石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱（石油醚-丙酮，比例见表1），各石油醚-丙酮比例混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其α-糖苷酶抑制活性，意外地发现先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:0，体积比）洗脱，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱得到的石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为α-糖苷酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位，没有α-糖苷酶抑制活性的作用。即，α-糖苷酶抑制活性的提取物，可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该紫草α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层谱色谱（tlc）分析表征如图1，tlc分析条件：gf254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1）显色方法：香草醛-硫酸显色。维吾尔药紫草经甲醇超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（sio2）柱分离，上样后的硅胶柱，用石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱（石油醚-丙酮，比例见表1），各石油醚-丙酮比例混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其α-糖苷酶抑制活性，意外地发现先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:10，体积比）洗脱，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱得到的石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为α-糖苷酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位，没有α-糖苷酶抑制活性的作用。即，α-糖苷酶抑制活性的提取物，可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该紫草α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层谱色谱（tlc）分析表征如图2，tlc分析条件：gf254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（1:1:1）显色方法：香草醛-硫酸显色。具体，发现过程如下：1、紫草经甲醇超声提取物的制备取维吾尔药紫草20g，经100ml甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物sn0128a，样品：0.7677g，留样：0.0259g，上样量：0.6856g，拌样硅胶0.7g，空白硅胶5g，石油醚-丙酮系统洗脱。2、石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱方法和结果取维吾尔药紫草20g，经100ml甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物sn0128a，0.7677g，上柱，甲醇溶解，共用甲醇15ml。上硅胶柱色谱，拌样硅胶0.7g，空白硅胶5g，玻璃柱内径1.5cm，石油醚-丙酮系统梯度洗脱（条件见表1），每个梯度洗脱100ml，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，石油醚：丙酮梯度洗脱提取物，tlc分析结果见图3，tlc分析条件：gf254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1），石油醚：乙酸乙酯：丙酮（1:1:1），显色方法：香草醛-硫酸显色。表13、抑制α-糖苷酶活性筛选方法和结果1)实验条件a、材料：dmso(二甲基亚砜)(科密欧公司)；kh2po4、k2hpo4·3h2o(广东汕头市西陇化工厂)；α-glucosidase酶(美国sigma公司)；pnpg(美国sigma公司)b、实验仪器：多功能酶标仪bio-radmodel680型(bio-radlaboratoriesinc.)2)实验方法和过程样品处理：将1mg待测样品溶于20μl二甲基亚砜(dmso)作为母液，取1μl母液加入99μl缓冲盐配成500μg·ml-1的样品溶液。在96孔板中依次加入α-glucosidase酶pbs溶液20μl使其终浓度为0.07u/ml，样品浓度为500μg·ml-1的pbs溶液10μl。冰浴5分钟，加入底物pbs溶液20μl使其终浓度为2.5mmol/l，用浓度为0.1m、ph6.84的pbs溶液补足体积为100μl。加过样的96孔板在37℃水浴30分钟。于405nm处测定反应物的吸光度，并以阿卡波糖作为阳性对照。样品抑制α-glucosidase酶活性比率用加样品较空白对照的od值的比值来表示。样品抑制百分率按以下公式计算:酶活性抑制率%=[a空白-(a样品-a背景)]/a空白×100式中a空白：不加样品反应后的吸收值；a样品：加入样品反应后的吸收值；a背景：只加样品的吸收值。3)实验结果表2结果发现：维吾尔药紫草经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:0，体积比）洗脱，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱，用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物，即为该α-糖苷酶抑制活性提取物。该α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道，其tlc分析表征如图1。维吾尔药紫草经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:10，体积比）洗脱，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱，用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物，即为该α-糖苷酶抑制活性提取物。该α-糖苷酶抑制活性提取物从未见文献报道，其tlc分析表征如图2。具体，发现过程如下：4、α-糖苷酶抑制活性有效提取物的提取方法研究1）提取溶剂的种类研究分别用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机溶剂提取，并测试提取物的α-糖苷酶抑制活性，实验结果如下：表3研究结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂。2）提取溶剂的用量研究分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/体积比）有机溶剂提取，并测试提取物的α-糖苷酶抑制活性，结果如下：表4活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。3）干燥方法的研究分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抑制α-糖苷酶活性提取物进行干燥，以含水量、tlc、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对α-糖苷酶抑制活性提取物进行干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。表5干燥方法真空干燥法冷冻干燥法鼓风干燥法离心干燥法旋蒸干燥法含水量(%)6.66.34.53.25.4抑制率(%)78.176.672.271.575.2因此，紫草α-糖苷酶抑制活性提取物的制备方法为：维吾尔药紫草经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:0，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。以上条件最优为先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:0，体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:8，体积比）洗脱20倍柱体积。维吾尔药紫草经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:10，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。以上条件最优为先用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:10，体积比）洗脱10倍柱体积，继用石油醚：丙酮混合溶剂（石油醚：丙酮，100:100，体积比）洗脱20倍柱体积。其中，1)提取物提取用溶剂可以为甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。5.紫草抑制α-糖苷酶活性提取物的医药用途研究按优化的紫草α-糖苷酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试，其α-糖苷酶抑制活性为ic50=17.4μg/ml。由于α-糖苷酶抑制剂具有降血糖、减肥、降血脂、糖尿病等方面的医药用途。因此，我们发现的紫草α-糖苷酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。6、紫草抑制α-糖苷酶活性提取物的组合物及其制备方法研究1）固体分散体处方紫草提取物20gvc1g聚乙烯吡咯烷酮79g固体分散100g制备方法：称取紫草提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（pvp）按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入烧杯中，加入适量的无水乙醇和vc，用磁力搅拌器搅拌至紫草提取物和载体完全溶解，充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得紫草有效提取物pvp包合物。2）环糊精包合物处方：紫草提取物20gvc1gβ-环糊精79g包合物100g制备方法：将β-环糊精与1-5倍水研匀,加紫草有效提取物(水难溶性的应先溶于少量有机溶剂中)继续充分研磨至成糊状物,低温干燥即得环糊精包合物。3）分散片处方:紫草提取物100十二烷基硫酸钠1vc1预胶化淀粉10可溶性淀粉100交联聚维酮10微晶纤维素9微分硅胶0.3滑石粉1100片制备方法：1.紫草有效提取物分散体的制备，精密称取紫草提取物、vc，加入处方量的十二烷基硫酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70℃的温度下蒸干，粉碎，过100目筛；2.将第一步中的紫草有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min后，60℃烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片即得。7、紫草抑制α-糖苷酶活性提取物的检测方法研究我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示紫草α-糖苷酶抑制活性提取物的特征。见图1和图2具体条件为：gf254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（6:1:1）与石油醚：乙酸乙酯：丙酮（1:1:1）显色方法：香草醛-硫酸显色。附图说明：图1紫草α-糖苷酶抑制活性提取物的tlc色谱图图2紫草α-糖苷酶抑制活性提取物的tlc色谱图图3紫草溶剂提取物的tlc色谱图具体实例:以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。实施例1：取维吾尔药紫草20g，经100ml甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（1.5cm内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:0，体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱，洗脱20倍柱体积，用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:8，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。收率3.9%。实施例2：取维吾尔药紫草20g，经100ml甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（1.5cm内径小柱），先用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:10，体积比）洗脱，洗脱10倍柱体积，继用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱，洗脱20倍柱体积，用石油醚-丙酮混合溶剂（石油醚-丙酮，100:100，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。收率6.9%。实施例3：固体分散体称取紫草提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（pvp）按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入烧杯中，加入适量的无水乙醇和vc，用磁力搅拌器搅拌至紫草提取物和载体完全溶解，充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得紫草有效提取物pvp包合物。实施例4：环糊精包合物将β-环糊精与1-5倍水研匀,加紫草有效提取物(水难溶性的应先溶于少量有机溶剂中)继续充分研磨至成糊状物,低温干燥即得环糊精包合物。实施例5：分散片1.紫草有效提取物分散体的制备，精密称取紫草提取物、vc，加入处方量的十二烷基硫酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70℃的温度下蒸干，粉碎，过100目筛；2.将第一步中的紫草有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min后，60℃烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片即得。当前第1页12