一种静电纺制备壳聚糖/寡肽生物美白面膜的方法与流程

本发明属于静电纺纳米纤维膜的制备领域，特别涉及一种静电纺制备生物多肽面膜的制备方法。

背景技术：

静电纺丝技术是指聚合物溶液或熔体被喷射拉伸成纤维的过程。它是一种制备聚合物纳米纤维的新方法，它可制备出直径为纳米级的超细纤维，最小直径可至1nm。较传统方法制备的聚合物纤维，电纺法制备聚合物纳米纤维具有设备简单、操作容易、高效且用电纺法制备的超细纤维膜具有比表面积大和孔隙率高、质轻等优点，组织工程、药物和催化剂载体、伤口敷料、过滤、传感器、模板、防护织物、纳米电子元件等众多领域具有潜在的应用价值。目前对聚合物溶液或熔体通过静电纺丝技术制备纳米纤维的例子非常多，但有关小分子多肽的研究还很少见。

七肽（ile-gln-ser-pro-his-phe-phe）是本团队研究人员以酪氨酸酶为靶向，采用噬菌体展示技术从七肽库中筛选的酪氨酸酶特异性抑制剂，具有对黑色素合成中的发挥关键作用的酪氨酸酶具有强烈的抑制作用，从而阻止黑色素的合成，达到美白的目的。自从它被发现以来，不论是在医学还是纳米科技领域都引起了人们很大的研究兴趣。如通过调剂溶剂、界面、外加磁场等来诱导短肽的自组装。但是对于七肽应用于静电纺丝，还未见报道。

壳聚糖是通过甲壳素脱乙酰基获得，是自然界中唯一的阳离子型多聚糖，有较高的结晶度，壳聚糖不溶于水，但在酸性条件下分子链上的氨基质子化后才能被溶解。壳聚糖有优良的生物相容性及抗菌、防腐、止血、促进细胞生长和伤口愈合、抑制溃疡等功能，成膜性好，机械强度高，具有生物可降解性，也是人们最感兴趣的生物材料之一。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种静电纺制备壳聚糖/寡肽生物美白面膜的方法，该方法快速、简便、廉价、高效，批量制备及规模化生产，为新型纳米生物活性材料的研发提供借鉴。

本发明的一种静电纺制备壳聚糖/寡肽生物美白面膜的方法，包括：

（1）将壳聚糖和寡肽在搅拌下缓慢加入到一定体积的溶剂中，控制温度30±2℃，搅拌2-5小时至壳聚糖完全溶解。停止搅拌，超声处理15min进行脱气，得到纺丝溶液；

（2）采用上述的纺丝溶液进行静电纺丝，得到壳聚糖纳米纤维膜；

（3）将制备的壳聚糖纳米纤维放入含有戊二醛交联剂的干燥器交联,干燥，即得。

步骤（1）所述的溶剂为质量浓度为80~90%的乙酸。

步骤（1）所述的寡肽为七肽，其分子序列为ile-gln-ser-pro-his-phe-phe。

步骤（1）得到的纺丝溶液中寡肽与壳聚糖的质量比在1:100～5:100。

步骤（2）所述的静电纺丝中注射器规格为5ml，针头内径为0.4~0.7mm，接收屏采用铝箔接地接收，针头与接收屏的距离为10～20cm。

步骤（2）所述的静电纺丝过程中喷出流速为0.5～1.5ml/h。

本发明的方法快速、简便、廉价、高效，适合批量制备壳聚糖/寡肽复合纳米纤维膜。

本发明以壳聚糖为主要纺丝材料，并掺入含有美白功效的生物活性七肽，通过七肽与壳聚糖的质量比及相关纺丝条件参数，成功的实现了壳聚糖和寡肽的混纺。

本发明得到的生物美白纳米纤维膜随美白七肽的加入量的增加，对黑素细胞增殖的抑制作用加强，具有显著的美白效果。

有益效果

（1）本发明方法操作简单，耗时较少，可获得直径和孔径在纳米级的膜材料，适用于规模化生产；

（2）本发明所使用的材料具有很好的生物降解性，具有较好的美白性能。

附图说明

图1为壳聚糖/寡肽复合纳米纤维膜交联前后的sem图：a：交联前；b：交联后；

图2为壳聚糖/寡肽复合纳米纤维膜对黑素细胞增殖率的影响；

图3为壳聚糖/寡肽复合纳米纤维膜对黑色素瘤细胞黑素生成的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

静电纺制备壳聚糖/寡肽生物美白面膜的方法，包括如下步骤：

(1)将壳聚糖和寡肽在搅拌下缓慢加入到一定体积的溶剂中，其中，壳聚糖的质量浓度固定为4%（w/w），多肽与壳聚糖的质量比为2：100；

(2)控制温度30±2℃，搅拌2-5小时至壳聚糖完全溶解；

(3)停止搅拌，超声处理15min进行脱气，得到纺丝溶液；

(4)用5ml注射器（针头内径为0.4~0.7mm）抽取步骤（3）中的纺丝液，固定在静电纺丝装置上，固定静电压为15kv，接收距离为15cm，喷射流速为1.0ml/h，进行电纺，得到壳聚糖/寡肽复合纳米纤维膜；

(5)将步骤（4）制备的，大小为10*10cm的壳聚糖纳米纤维膜，放入含有戊二醛交联剂的干燥器交联，干燥器的底部放入20ml戊二酸溶液，然后放入支撑板和支撑钢丝网，将需要交联的样品放在钢丝网上，盖紧盖子，交联24h，得到交联后的纳米纤维膜。取出，放入60℃的真空干燥箱中，干燥24h，除去残余的交联剂，即得壳聚糖/寡肽生物美白面膜。

依照以上步骤制备的交联前后的纳米纤维膜照片分别如图1所示。

实施例2

壳聚糖/寡肽生物美白面膜的美白性能测试，分别采用对黑素细胞增殖率的影响和对黑色素瘤细胞黑色素生成影响两个方面进行美白效果评价：

(1）壳聚糖/寡肽生物美白面膜对黑素细胞活力的影响实验：细胞接种之前，空白面膜和多肽面膜都用紫外光进行杀菌消毒3小时。采用mtt法，取对数生长期细胞常规消化，调整细胞浓度为5×104个/ml，取100ul接种于96孔板，37℃co2培养箱中培养24h后，设立4个实验组，每孔分别加入1mg，2mg，4mg和10mg的生物活性多肽面膜。并设立美白对照组（培养基+空白面膜），阴性对照组（培养基+细胞）和空白对照组（单纯培养基）。置于co2培养箱中培养48h后，每孔加入5mg/ml的mtt溶液20ul，继续培养4h后，弃上清，每孔加入100uldmso，用酶标仪在492nm波长下测定吸光度（a），用增殖比例表示细胞增殖情况。即细胞增殖率=（a实验组-a美白对照组）/（a阴性对照组-a空白对照组）×100%。测定结果见图2，细胞增殖率分别为：92.6%，85.3%，76.2%，61.2%，可以看出，在质量不高于2mg情况下，对人a375黑色素瘤细胞增殖率没有显著影响，增殖率均保持在80%以上。当质量为10mg时，开始明显抑制细胞的增殖，增殖率降低至60%左右，该差异具有统计学意义（p＜0.05）；

(2）壳聚糖/寡肽生物美白面膜对黑色素瘤细胞黑色素生成影响：调整黑色素瘤细胞密度，以5×105个/孔接种于6孔板，6h后换液，每孔加入1mg，2mg，4mg和10mg的生物活性多肽面膜，对照组加入新鲜培养液代替多肽面膜，5%co2，37℃孵育48h后，弃去上清液，每孔加入0.25%胰酶1ml于室温下消化2min，每孔加入4ml培养液中止消化，吹打成单细胞悬液，取20μl作细胞计数，其余细胞悬液1500rpm离心5min，弃上清液，加人1ml浓度为1mol/l的naoh溶液，震荡5min，80℃水浴加热1h后，转移至96孔板，每孔加入100ul，选择492nm波长，以空白孔调零，在酶联免疫检测仪上测吸光度（a）。各实验组相对黑素含量=（a实验组-a美白对照组）/（a阴性对照组-a空白对照组）×100%。生物多肽面膜对黑色素瘤细胞黑素生成的影响见图3，当浓度低于2mg时，虽然不显著影响黑素细胞的增殖率，但是在1~10mg质量范围内，呈质量依赖性抑制黑色素瘤细胞黑素生成。当质量为10mg时，相对黑色含量仅为对照组的48.6%；

综合图2和图3实验结果，本发明制备的生物多肽面膜，不仅抑制了黑素细胞的增殖，且能抑制黑色素瘤细胞黑素生成，具有显著的美白效果。