一种自组装式脂质‑介孔硅核/壳复合型纳米药物载体及其制备方法与流程

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种自组装式脂质-介孔硅核/壳复合型纳米药物载体及其制备方法。

背景技术：

目前，癌症仍是人类最致命的杀手之一，且发病率和死亡率不断上升。传统的抗肿瘤药物经静脉注射或口服后，只有少量的药物分子可以通过血液循环到达癌变部位，导致生物利用率低而需频繁给药。这种治疗方式不仅会促使肿瘤细胞产生耐药性，还会因药物分子缺乏特异性识别而被正常组织摄取，产生严重的组织器官毒副作用。纳米药物传递系统凭借其优良特性能够实现有效荷载抗癌药物、靶向传递及响应性释放抗癌药物，已成为抗癌纳米医学研究的前沿领域之一。

作为无机纳米粒的介孔二氧化硅(msns)具有独特的优良性质，包括理化性质稳定、比表面积大、孔径和粒度均一可控、可修饰性强以及良好的生物相容性。同时，其在体内可生物降解，降解产物硅酸能被人体吸收或经泌尿系统排泄。但是，单一的msns用作药物传递载体存在一些明显缺陷：第一，msns的表面孔隙可以有效包载药物，但必须及时使用化学基团将其完全封堵，否则易出现包埋物大量泄漏，而新基团的引入势必潜在地使msns的毒性升高；第二，msns能够快速广泛富集于网状内皮系统如肝、脾中，导致包埋物的不可控释放与损失，同时使生物毒性在一定程度上升高。

制备脂质体包裹msns，制成核/壳复合纳米粒(lmsns)新型传递系统，可有效解决以上问题。msns的平均粒径为20-80nm，单室脂质体粒径约为100-200nm，多室脂质体粒径可达300-500nm，因此，使用脂质体作为外层壳膜包裹msns具有现实可行性。lmsns用作纳米载体的优势：①msns的大比表面积和孔容积可极大提高载体对药物的负载率；②lmsns中以脂质双分子层作为msns的控制阀，为药物泄露增加了一道屏障，从msns孔隙中泄漏的药物分子仍处于脂质双层膜的包裹内，这种双重包封作用可充分减少载体到达吸收部位前的损失；③msns作为支撑骨架，能给予脂质层良好的机械稳定性，并使lmsns的粒径分布狭窄均一。总之，msns与脂质体可作为理想的组合构建复合型lmsns纳米载体。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种自组装式脂质-介孔硅核/壳复合型纳米药物载体及其制备方法，所得的纳米载体载药量高、制备简单、稳定性好，通过修饰剂peg为载体提供了空间障碍和立体稳定性，载体可实现对药物的有效转运、释放和高浓度蓄积，抑制细胞增殖并杀灭肿瘤细胞，实现抗肿瘤疗效。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种自组装式脂质-介孔硅核/壳复合型纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：

s1、使用模板剂法合成介孔硅纳米粒并进行靶向修饰，得介孔硅；

s2、将所得的介孔硅和药物在有机溶剂中混合后，清洗并干燥，得载药介

孔硅；

s3、将所得的载药介孔硅分散于溶有脂质类材料的无水乙醇溶液中，破碎并过滤除菌，灌封，即得自组装前体脂质体；

s4、将所得的自组装前体脂质体直接注入水合介质中，去除乙醇后反复挤出调整粒径大小，即得自组装成纳米级lmsns复合载体。

优选地，所述步骤s1中所得的介孔硅的粒径在30-80nm之间，孔径尺寸为5.77nm。

优选地，所述步骤s1中的介孔硅通过以下步骤合成：以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵为模板，正硅酸乙酯为硅源，在碱性条件下反应完全后，再在甲醇-hcl溶液和去离子水中回流，除去表面活性剂，即得介孔硅。

优选地，所述步骤s2中的药物为疏水性药物或多肽、蛋白质、核酸类生物大分子中的一种。

优选地，所述疏水性药物为阿霉素、紫杉醇、伊利替康或顺铂中的一种。

优选地，所述自组装前体脂质为ph敏感型脂质体。

优选地，所述自组装前体脂质体由1，2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与1，2-棕榈酰磷脂酰甘油制备得到。

优选地，介孔硅和药物的质量比为2∶1-10∶1，介孔硅与脂质的质量比为1∶2-1∶4。

本发明还提供了一种通过上述的制备方法制备的脂质-介孔硅核/壳复合型纳米药物载体，该药物载体的粒径范围在80-350nm，zeta电位为1.5-6.2mv。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明使用自组装技术将脂质膜材与msns分散并稀释后自发形成脂质体混悬液，无析出问题。且自组装脂质体属于动力学稳定体系，克服了普通脂质体的缺陷，可有效提高稳定性；

(2)本发明使用亲水性长循环材料peg修饰脂质体可促进跨膜吸收。peg链共价连接在磷脂表面，可为脂质体提供空间障碍和立体稳定性，降低网状内皮系统与单核巨噬细胞的摄取，延长其体内循环时间并提高生物利用度；

(3)通过脂质膜的包覆可防止药物的提前泄露，降低全身毒副作用。同时，载体可在epr效应作用下蓄积于肿瘤组织；

(4)介孔硅纳米粒比表面积和孔隙率大，通过表面硅醇基与药物作用，载药量高；

(5)复合纳米载体经胞吞作用进入细胞，在内含体/溶酶体的偏酸性环境中，脂质双分子层结构破坏，介孔硅纳米粒泄漏；通过质子交换实现药物的快速释放和高浓度蓄积，抑制细胞增殖并杀灭肿瘤细胞，实现抗肿瘤疗效。

附图说明

图1为本发明实施例中的介孔硅的孔隙率分布图和氮气吸附-脱附图。

图2为本发明实施例中的msns(a)、lmsns(b)、msns-nh2(c)、msns-pei(d)的透射电镜图。

图3为本发明实施例中的空白脂质体与lmsns的dsc曲线。

图4为本发明实施例中的hplc测定的不同载体在mcf-7细胞内的释药情况。

图5为本发明实施例中的不同载体在倒置荧光显微镜下的荧光成像结果。

图6为本发明实施例中的不同载体转运dox进入mcf-7细胞内的荧光强度对比。

图7为本发明实施例中的体外抑瘤活性(mtt)结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种自组装式脂质-介孔硅核/壳复合型纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：

s1、使用模板剂法合成介孔硅纳米粒并进行靶向修饰，得介孔硅，该介孔硅的粒径在30-80nm之间，孔径尺寸为5.77nm；具体的，以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵为模板，正硅酸乙酯为硅源，在碱性条件下反应完全后，再在甲醇-hcl溶液和去离子水中回流，除去表面活性剂，即得介孔硅。

s2、将所得的介孔硅和药物在有机溶剂中混合后，清洗并干燥，得载药介

孔硅；所述的药物为疏水性药物或多肽、蛋白质、核酸类生物大分子中的

一种所述疏水性药物为阿霉素、紫杉醇、伊利替康或顺铂中的一种。

s3、将所得的载药介孔硅分散于溶有脂质类材料的无水乙醇溶液中，破碎并过滤除菌，灌封，即得自组装前体脂质体，介孔硅和药物的质量比为2∶1-10∶1，介孔硅与脂质类材料的质量比为1∶2-1∶4；该自组装前体脂质为ph敏感型脂质体；由1，2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与1，2-棕榈酰磷脂酰甘油制备得到。

s4、将所得的自组装前体脂质体直接注入水合介质中，去除乙醇后反复挤出调整粒径大小，即得自组装成纳米级lmsns复合载体。

本具体实施采用模板法制备具有规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米材料，使用nh2或pei对其进行修饰，再用长循环脂质体将其包裹，构建出能够在肿瘤细胞内靶向定位释放药物的复合纳米载体。在制备过程中，诸多因素会影响介孔硅纳米粒的合成，例如反应液(水)的体积、硅源(正硅酸乙酯)和表面活性剂(十六烷基三甲基溴化铵)的浓度、比例和加入次序，碱性催化剂(二乙醇胺)的加入量，洗脱液的种类、离心速度，整个反应体系的温度、搅拌速度等，不同的制备方法对最终样品的形貌、结构、粒径以及zeta电位等相关因素都有重大影响。本发明对上述的反应体系和反应条件进行了考察，结果显示，介孔硅制备的最佳反应条件为，去离子水100ml，十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯的最佳加入量为1.0g和8ml，最佳反应温度为95℃，二乙醇胺(eda)的最佳加入量为160μl。

实施例1

s1、介孔硅纳米颗粒的制备：在三颈瓶中加入磁石转子和1.0gctab，再加入100ml去离子水，95℃下搅拌30min。向瓶中加入160μldea液，继续搅拌15min。取8mlteos，缓慢滴加(滴加1个小时)，滴加完成后，回流3h，离心，弃去上清液。用甲醇-hcl溶液(4∶1)和去离子水交叉洗3次，去除模板剂。在50℃干燥箱中干燥12h，再真空干燥12h。即得平均粒径约为70nm的介孔硅纳米粒(msns)。图1为介孔硅的孔隙率分布图和氮气吸附-脱附图。结果表明介孔硅纳米粒内部分布有均一有序的孔道结构，有具有极大的比表面积。通过数据分析与处理，得出msns孔径尺寸约为5.77nm，比表面积约为567.32m²·g^-1，孔道总孔容为0.6815cm³·g^-1，以上结果表明合成的msns具有良好的介孔材料性能。

s2、取介孔硅颗粒于10ml离心管内，加适量pbs分散，滴加5mg/ml的阿霉素(dox)溶液，混合后定容。搅拌24h，离心，用pbs冲洗至冲洗液无颜色时即得载药介孔硅(dox@msns)。

s3、分别称取1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)50mg、胆固醇50mg、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg-2000)20mg、1，2-棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)30mg，溶于10ml无水乙醇，取10mg介孔硅分散于以上乙醇溶液中，细胞破碎仪破碎并以0.45μm滤膜过滤，灌封于充氮容器中，制成自组装前体脂质体。将其注入8ml去离子水，快速自组装成纳米级脂质体。去除乙醇后使用脂质体挤出器反复挤出调整粒径大小(200nm聚碳酸酯膜)，即得脂质体包裹的介孔硅纳米粒溶液(lmsns)。使用dox@msns重复以上制备过程，得载药脂质-介孔硅核/壳复合纳米粒(dox@lmsns)。用马尔文粒径仪测定纳米粒的粒径、pdi和zeta电位，结果见表1。

表1.纳米载体的粒径与电位测定结果

从表1中可知，所制备介孔硅纳米粒粒径小，分散度好，zeta电位为负值，脂质体包裹后纳米粒的zeta电位值增大为正值，能够防止其发生聚合，有利于溶液的稳定。图2是msns(a)与lmsns(b)的透射电镜图。在图a中可以看出介孔硅纳米粒具有清晰的孔道结构，表面特征明显，图b中则能够清晰地观察到介孔硅外包裹了一层明显的脂质体膜。

实施例2

s1、介孔硅的氨基化修饰：按照实施例1中的方法制备介孔硅msns，取0.2365gmsns于三颈瓶中，搅拌。加入23.65ml无水乙醇，滴加710μlaptes，回流24h，甲醇-hcl溶液和去离子水交替洗3次，共6次。先50℃干燥12h，再60℃真空干燥12h，得msns-nh2。

s2、介孔硅的pei化修饰：取0.5gmsns，加入50ml含有0.5gpei的去离子水，回流24h。甲醇-hcl溶液和去离子水交替洗3次。先50℃干燥12h，再真空干燥12h，得msns-pei。

以上两种修饰型msns分别与dox溶液混合处理，得dox@msns-nh2与dox@msns-pei。用马尔文粒径仪测定修饰型介孔硅的粒径、pdi和zeta电位，结果见表1，与空白纳米粒相比，两种修饰型介孔硅的粒径变大，zeta电位也有明显增加。图2(c)、(d)分别是是msns-nh2与msns-pei的透射电镜图。可以看出msns-nh2的粒径大致分布在50-110nm左右，表面仍然有介孔结构，pei修饰后的介孔硅粒径明显变大，大致在70-120nm左右。

将本发明实施例1提供的脂质-介孔硅核/壳复合型纳米载体与脂质体进行差热分析(dsc)，从而证实包裹介孔硅纳米粒后脂质体的物理性质发生变化。分别吸取空白脂质体与lmsns，干燥去除水分。预热后用微量注射器将样品逐滴加入dsc坩埚，称量样品重量，将坩埚放入仪器中，冲氮气。利用仪器软件在所需的温度范围内运行扫描，采集数据。仪器参数：样品量10mg，扫描速率5℃·min^-1，温度范围0～200℃。

图3为空白脂质体与lmsns的dsc曲线图。结果表明空白脂质体无明显相变，而lmsns有明显相变，相变峰为146.83℃，其中起始点为131.30℃，终止点为171.91℃，焓变积分为-279.84mj。证明脂质体有效包裹了msns纳米粒，并使脂质体的物理性质明显改变。

定量测定不同纳米载体(msns、msns-nh2、msns-pei、lmsns)在细胞内的药物释放速率，并绘制经时动力学曲线。将mcf-7细胞以1×10⁵个/孔接种，每孔加入2ml10％的dmem培养液，放入37℃的co2培养箱中培养24h后，弃去培养基，加入pbs洗涤2-3次，分别以dox@msns、dox@msns-nh2、dox@msns-pei、dox@lmsns孵育液代替培养液，振摇使混合均匀后，立即取出，作为0h时间点，继续培养并分别在0.5、1、2、4、6、8、12h弃去各组内弃去孵育液，pbs洗涤，ripa裂解液裂解细胞。置于离心管中并加入甲酸20μl，暗处反应30min，加入甲醇适量，涡旋5min，12000rpm离心15min，取上清液进样，hplc法测定dox浓度。计算各载体在细胞内不同时间点的释药百分比。图4为不同载体在mcf-7细胞内的释药速率对比图。结果表明空白msns的释药速度最快，说明dox分子能够自由地从介孔硅孔道内脱离，msns-nh2与msns-pei的释药速度相比空白msns明显降低，说明修饰基团对药物从介孔硅孔道内的释放有一定影响，lmsns在各个时间点的释药速度均最低，证实了脂质体膜可有效控制dox分子从载体内释放，起到了明显的屏障作用，具有显著的缓释效果。

实施例3

考察并测定不同纳米载体(msns、msns-nh2、msns-pei、lmsns)携载dox被细胞摄取的量，验证lmsns的细胞转运能力。

将mcf-7细胞以1×10⁵个/孔接种，每孔加入2ml10％的dmem培养液，放入37℃的co2培养箱中培养24h后，弃去培养基，加入pbs洗涤2-3次，分别按比例加入含有dox@msns、dox@msns-nh2、dox@msns-pei、dox@lmsns的培养液，同时以dox溶液作空白对照，继续培养2h后染色(为观察2h的时间点)。弃去培养基，pbs冲洗后加入染色剂，胰酶消化收集细胞，继续培养30min。取出后离心、洗涤并以pbs悬浮，使用流式细胞仪(fcm)测定细胞荧光阳性率及平均荧光强度，同时使用荧光显微镜进行观察。12h的时间点同上述步骤。

图5与图6分别是不同载体在显微镜下的荧光成像结果与转运dox进入mcf-7细胞内的荧光强度对比，其中红色荧光表示dox，即dox与各载体在细胞内的摄取情况。结果表明各载体均能有效转运进入细胞，msns与lmsns的细胞传递效能明显高于游离药物，荧光强度从高到低依次为lmsns、msns-nh2、msns-pei、msns，2h与12h结果无明显差异。lmsns转运dox进入细胞的荧光强度值为dox溶液的3.14倍，为空白msns的1.53倍，均有显著差异(p值分别＜0.001与0.05)，同时高于msns-nh2与msns-pei组，但无显著差异。

实施例4

以mtt法检测不同纳米载体(msns、msns-nh2、msns-pei、lmsns)载药进入细胞后的体外细胞毒性，检验体外抗肿瘤效果。

将细胞密度达到80％-90％融合的mcf-7细胞用胰酶/edta消化，吹散使细胞分散均匀。以1×10⁵个/孔接种于96孔板中，加入dmem培养液，放入37℃的co2培养箱中培养48h后，将系列浓度(dox浓度分别为10、20、30、40μg/ml)的药物载体加入到96孔板中，继续培养48h。孵育培养结束后，每孔加入20μl的mtt溶液继续孵育4h。弃去孔中液体，每孔加入100μl二甲基亚砜溶解生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜，将96孔板在气浴振荡器中振摇30min，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度。

图7为mtt实验结果，由结果可知各纳米载体载药后均能抑制肿瘤细胞生长，且均有明显的浓度依赖性，载药浓度越高，抑瘤效果越好。msns-nh2与msns-pei的抑瘤效果略高于空白msns，这是由于肿瘤组织由于高糖酵解速率及高co2浓度而呈现出明显的偏酸性(ph6.0-7.0)，在细胞内涵体(ph5.5)、溶酶体(ph＜5.5)等细胞器中具有更强的酸性环境。nh2与pei基团的修饰可使纳米粒对肿瘤细胞具有更强的亲和力。

lmsns的肿瘤抑制效果最强，明显高于其余三组载体，随着载药浓度升高，mcf-7细胞的成活力分别下降至42.2％、33.7％、25.3％、20.3％。其原因为：一方面脂质体膜的屏障作用使药物释放缓慢，从而表现出较持久的抑瘤作用，这在高载药浓度条件下更为明显；另一方面，本发明制得的脂质体具有一定的ph敏感性，在偏酸性条件脂质膜快速被降解破坏，药物分子从msns空隙中泄漏，提高了药物的靶向释放率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。