一种艾氟康唑异构体在诱导CIK细胞提高其肿瘤杀伤力方面的应用的制作方法

本发明属于药物领域，涉及免疫治疗药物，具体涉及一种艾氟康唑异构体在诱导cik细胞提高其肿瘤杀伤力方面的应用。
背景技术：
：艾氟康唑，化学名为(2r,3r)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(4-亚甲基哌啶-1-基)-1-(1h-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇，是首个外用三唑类抗真菌药物，由加拿大valeant制药公司研发，2014年6月6日获fda批准上市，商品名jublia。该药为10％的溶液，局部涂用，主要用于治疗由红色毛癣菌、石膏样毛癣菌引起的手、足癣，其作用机制是抑制真菌14-去甲基化酶，从而干扰麦角甾醇的合成。艾氟康唑结构中存在2个手性中心，共有4种光学异构体，除具有药理活性的2r/3r构型(1)外，还有2s/3s构型(2)、2r/3s构型(3)和2s/3r构型(4)。四种不同构型的化学结构式如下所示：现有技术认为，仅有艾氟康唑(2r/3r)具有活性，其他构型的异构体没有药理活性。目前尚未发现艾氟康唑及其异构体在细胞免疫治疗方面的应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供艾氟康唑异构体在诱导cik细胞提高其肿瘤杀伤力方面的应用。本发明通过下面的技术方案得以实现：如下化学式所示的艾氟康唑异构体在制备增强cik细胞抗肿瘤活性的药物中的应用，其中，标号2和3的两个手型碳原子处的构型一个为r型，另一个为s型；优选地，所述异构体为2r/3s构型或2s/3r构型。一种药物组合物，含有上述的艾氟康唑异构体。优选地，所述药物组合物还含有药学上可以接受的辅料。上述的药物组合物在制备增强cik细胞抗肿瘤活性的药物中的应用。本发明的优点：本发明研究发现，艾氟康唑异构体中，2r/3s构型和2s/3r构型的异构体可以有效诱导cik细胞抗肿瘤，增强其对肿瘤细胞的杀伤力，而2r/3r构型(即艾氟康唑)和2s/3s构型未发现可以明显诱导增强cik细胞的抗肿瘤活性。附图说明图1为艾氟康唑及其异构体的化学结构式；图2为艾氟康唑及其异构体对cik细胞体内杀瘤活性的影响，图示为肿瘤块大小。具体实施方式下面结合具体实施例进一步介绍本发明的技术方案。一、实验材料dmem、rpmi-1640和gt-t551培养液，以及胎牛血清均为美国gibco公司产品。青霉素-链霉素溶液产自碧云天。淋巴细胞分离自健康志愿者外周血。smmc-7721肝癌细胞系于上海中科院购买，本实验室长期保存。艾氟康唑(1)及其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)异构体自制(归一化纯度大于98％)，艾氟康唑及其异构体的化学结构式如图1所示。二、实验方法1、cik细胞分离及原代培养采集健康志愿者血液20ml，平衡温度至室温。取50ml离心管若干，将血样转移至离心管，用生理盐水稀释至30ml，充分吹打均匀。将稀释后的血样缓缓加入另一管装有15ml淋巴细胞分离液的上方，形成上下两相。22℃，390g离心30min。离心后血浆层与分离液之间有白膜层可见，分别收集上层血浆和中间白膜层至新的离心管。于收集白膜层的离心管中加入rpmi-1640至45ml，混匀，22℃，1000g离心10min。重复上一步骤两次，离心速度分别改为400g和201g，最后一次离心之前取20μl混匀的细胞悬液进行台盼蓝染色计数。离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/ml加含有500μg/lcd3mab，1000u/mlil-2和10％fbs的gt-t551培养基诱导培养成cik细胞。2、肿瘤细胞培养在37℃，5％co2及90％相对湿度的细胞培养箱中用dmem完全培养液(含10％胎牛血清和100mg/l青-链霉素溶液)培养smmc-7721细胞。3、cck-8检测细胞增殖活力将培养7d的cik细胞数调整至3×105个/ml，于96孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50μl，设干预组和对照组，对照组为生理盐水组，干预组分为低、中、高浓度组，分别加入艾氟康唑(1，2r/3r)或其2s/3s(2)、2r/3s(3)、2s/3r(4)异构体终浓度为5、10、20μm的培养基各50μl，每个浓度4个平行对照孔，置于细胞培养箱中处理细胞72h，加入10μlcck-8溶液，4h后用酶联免疫检测仪检测od450值，测定各组od450值。4、肿瘤体外杀伤实验将培养9d的cik细胞均分为两组，分别为对照组和干预组(包括2r/3r干预组、2s/3s干预组、2r/3s干预组和2s/3r干预组)，对照组为生理盐水组，干预组为培养基终浓度为10μm的药物，置于细胞培养箱中处理细胞72h(至12d)。另外，在cik细胞培养11d时，将培养至对数生长期的smmc-7721细胞调整细胞密度为2×105个/ml，于96孔板中铺板每孔100μl细胞悬液，培养箱中培养24h。cik培养至第12天进行cik杀伤肿瘤细胞实验，弃去smmc-7721旧的培养液，分别按n(效应细胞)/n(靶细胞)为10:1调整两组cik细胞至相应数目加入smmc-7721细胞孔中，每个比例3个复孔，同时设单独靶细胞和单独效应细胞对照组，于细胞培养箱中培养4h。4h后每孔加入10μlcck-8溶液，细胞培养箱中孵育4h，酶标仪测定od450值a。按下式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[1-(实验组a值-单独效应细胞组a值)/单独靶细胞组a值]×100％。5、对裸鼠肝癌移植瘤生长的抑制作用裸鼠先经3gy60co照射后，随机分成对照组及干预组(包括2r/3r干预组、2s/3s干预组、2r/3s干预组和2s/3r干预组)，每组雌雄各半。每只裸鼠于左肩胛部皮下接种处于对数生长期的smmc-7721肝癌细胞2×105。次日，对照组裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射5×107个常规诱导培养12d的cik细胞，干预组裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射5×107个经艾氟康唑或其异构体诱导培养12d的cik细胞(将培养9d的cik细胞用含10μm艾氟康唑或其异构体的培养基继续培养3d)，体积均为0.25ml，连续注射6d。观察肿瘤生长情况，5周后裸鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤块并称重，用游标卡尺测量肿瘤的大小，并计算肿瘤的体积。6、统计分析数据以均数±标准差表示，采用spss19.0统计软件及graphpad软件进行方差及显著性分析，检验水准(p)设为0.05。三、实验结果1、艾氟康唑及其异构体对cik细胞增殖的影响结果可见，低、中、高浓度2r/3s干预组和2s/3r干预组od450值显著高于对照组，低、中、高浓度2r/3r干预组和2s/3s干预组od450值与对照组无显著性差异。该结果证明，2r/3s、2s/3r构型的艾氟康唑异构体对cik细胞的增殖具有促进作用，且呈一定的浓度依赖关系；2r/3r、2s/3s构型的艾氟康唑异构体对cik细胞的增殖没有明显的促进作用。各组od450值如表1所示。表1艾氟康唑及其异构体对cik细胞增殖(od450值)的影响2、艾氟康唑及其异构体对cik细胞体内外杀瘤活性的影响体外杀伤试验结果可见，10μm的2r/3s异构体和2s/3r异构体干预后的cik细胞比常规培养的cik细胞具有更强的杀灭肿瘤细胞活性，杀伤率显著高于对照组，2r/3r异构体和2s/3s异构体干预后的cik细胞与常规培养的cik细胞对肿瘤细胞的杀灭活性无显著差异；体内杀瘤试验结果可见，10μm的2r/3s异构体和2s/3r异构体干预后的cik细胞比常规培养的cik细胞具有更强的体内杀瘤活性，肿瘤块的重量和体积均小于对照组，2r/3r干预组和2s/3s干预组肿瘤块的重量和体积与对照组无显著差异。结果如表2和图2所示。表2艾氟康唑及其异构体对cik细胞体内外杀瘤活性的影响体外杀伤率(％)肿瘤块重量(g)肿瘤块体积(cm3)对照组46.38±4.721.61±0.421.18±0.352r/3r干预组45.72±5.361.58±0.451.13±0.412s/3s干预组48.33±5.121.53±0.411.15±0.322r/3s干预组73.57±4.960.92±0.350.55±0.302s/3r干预组75.12±5.030.89±0.310.57±0.34本发明研究发现，艾氟康唑异构体中，2r/3s构型和2s/3r构型的异构体可以有效诱导cik细胞抗肿瘤，增强其对肿瘤细胞的杀伤力，而2r/3r构型(即艾氟康唑)和2s/3s构型未发现可以明显诱导增强cik细胞的抗肿瘤活性。2r/3s构型和2s/3r构型的异构体可以用于制备诱导cik细胞抗肿瘤的药物制剂，如粉针剂、靶向制剂等。上述实施例仅用于解释本发明技术方案，但本发明保护范围不局限于上述实施例。当前第1页12