本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种中药型肉鸡免疫抑制剂及其免疫抑制模型的建立方法和应用。
背景技术：
家禽的免疫抑制是由某些病毒、细菌、真菌、寄生虫感染、霉菌毒素或化学药物作用等多种原因引起的，其造成家禽免疫组织和免疫器官受损，导致机体的免疫机能下降，引起疫苗免疫失败和增加其他疾病混合感染或继发感染的几率，使死淘率大幅上升、生产性能显著下降，给养殖业造成巨大损失。因此，如何提高家禽特异或非特异免疫功能，研制高效的兽用免疫增强剂，已成为兽药研究的当务之急。但由于兽医临床上缺乏一种科学和客观评价药物免疫增强作用的实验模型，在申报兽药新证书时，均不能提供可靠的、令人信服的试验数据。因此，在兽医临床上，迄今为止尚没有一种具有免疫增强作用的药物或制剂被批准为正式药品。肉鸡免疫抑制模型的建立可以为肉鸡免疫增强药物或添加剂的研发提供理想、可靠的实验动物模型及完善的评价体系，对新兽药或功能性添加剂研发和评价具有重要意义，应用前景广阔。
目前，临床上运用的免疫抑制剂主要有糖皮质激素类，如强的松；微生物代谢产物，如环孢菌素等；抗代谢物，如6-巯基嘌呤等；多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白等；烷化剂类，如环磷酰胺等。这些药物疗效在某种程度上虽已被证实，但毒副作用大（如骨髓抑制、肝肾损伤、继发性感染等）。与化药免疫抑制剂相比，中药免疫抑制剂有以下特点:①成分多样化、药理作用广泛且复合，除免疫抑制作用外，还有抗炎、抗过敏及免疫双向调节等作用；②毒性小、副作用少，而且通常为可逆的，减量或停药即消失。另外，我们利用生物发酵技术对中药进行处理，从而达到提高中药药效、降低毒副作用目的。因此，应用发酵中药作为免疫抑制剂，诱导免疫抑制模型具有非常重要意义。据检索，在小鼠上利用激素、环磷酰胺、环孢菌素等西药建立免疫抑制模型的研究较多，但由于不同动物在生理机能等方面存在很大差异，用小鼠免疫抑制模型作为其他畜禽新兽药研发、免疫抑制机理研究和病毒感染模型建立等方面的评价，其可靠性存在极大疑问。目前尚未见到利用发酵中药诱导建立肉鸡免疫抑制模型的相关报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种中药型肉鸡免疫抑制剂及其免疫抑制模型的建立方法和应用，为新兽药或功能性添加剂研发、免疫抑制机理研究、病毒感染模型建立等提供理想、可靠的实验动物模型及完善的评价体系。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
设计一种中药型肉鸡免疫抑制剂，由下述体积份数的药物制成：发酵雷公藤提取液8～12份、发酵苏木提取液4～8份、发酵青藤提取液2～4份、发酵甘草提取液2～4份，混匀加入一定量的双抗。
优选的，所述双抗为青霉素和/或链霉素的混合液，所述青霉素和/或链霉素在中药型肉鸡免疫抑制剂中终效价为每毫升100～500iu。
各中药发酵液的制备步骤如下：
（1）取雷公藤、苏木、青藤、甘草中药分别于50～60℃下烘干2～3h，粉碎，100%过60～120目筛；
（2）将步骤（1）所得各中药调整物料含水量为45～55%，ph值为5.8～6.5，取枯草芽孢杆菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌=1∶1∶1，混匀后，按4%接种量接入各药物中，搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中，压实，封口，置于30～35℃的环境中培养70～75h，阴干，即得对应的发酵中药；
（3）将上步所得发酵中药加6～10倍70％的乙醇回流提取，提取2～4次，每次1.5～2.5h时，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至一定浓度，即得对应的发酵中药提取液。
一种中药型肉鸡免疫抑制模型的建立方法，包括以下步骤：
（1）从肉鸡5日龄开始，取所述中药型肉鸡免疫抑制剂，按20ml/kg体重的剂量，每天1次灌服，连用10天；
（2）7日龄时点眼滴鼻免疫新城疫ⅳ系疫苗；
（3）16日龄抽检，心脏采血，进行白细胞分类计数、t淋巴细胞阳性率的测定、新城疫抗体效价测定和胸腺、法氏囊和脾脏免疫器官指数测定，作为免疫状态客观量化指标。
上述中药型肉鸡免疫抑制模型在评估免疫增强的药物或添加剂中的应用，包括以下步骤：
（1）将待评估药物或添加剂施用于所述肉鸡免疫抑制模型；
（2）观察候选药物或添加剂对肉鸡免疫抑制模型的白细胞总数、淋巴细胞数量、t淋巴细胞阳性率、免疫器官指数和新城疫疫苗免疫抗体效价的影响情况，
评估潜在的免疫增强药物或添加剂。
本发明的有益技术效果在于：
1.本发明提供的中药型肉鸡免疫抑制剂，所用药物和菌株均为生物资源，毒性小、副作用少，而且通常为可逆的，减量或停药即消失，具有廉价、绿色安全、环保无污染的优点。
2.本发明提供的模型建立方法能够诱导肉鸡出现典型免疫抑制状态，可以有效建立肉鸡免疫抑制模型，并且简单易操作，便捷易推广，具有广阔的市场前景。
3.本发明可为新兽药或功能性添加剂研发、免疫抑制机理研究、病毒感染模型建立等提供理想、可靠的、一致性好的实验动物模型及完善的评价体系，具有良好的理论价值与应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规试验方法。
实施例一：
一种中药型肉鸡免疫抑制剂，由下述步骤制成：
①将雷公藤、苏木、青藤、甘草等中药分别于50～60℃下烘干2～3h，粉碎，100%过80目筛，备用；
②取上述各中药调整物料含水量为50%，ph值为6.0，使枯草芽孢杆菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌=1∶1∶1，混匀后，按4%接种量接入各药物中，搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中，压实，封口，置于31℃的环境中培养72h，阴干，即得发酵各中药。
③将步骤②所得发酵各中药加8倍70％的乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至1g生药/ml。
④按发酵雷公藤提取液9份、发酵苏木提取液6份、发酵青藤提取液3份、发酵甘草提取液3份，混匀加入双抗（青霉素、链霉素各100iu/ml）即得中药型肉鸡免疫抑制剂。
实施例二：
一种中药型肉鸡免疫抑制模型，其建立方法包括以下步骤：
（1）从肉鸡5日龄开始，取实施例一所述中药型肉鸡免疫抑制剂，按20ml/kg体重的剂量，每天1次灌服，连续用药10天；
（2）7日龄时点眼滴鼻免疫新城疫ⅳ系疫苗；
（3）于16日龄抽检，心脏采血，进行白细胞分类计数、t淋巴细胞阳性率的测定、新城疫抗体效价测定和法氏囊、胸腺和脾脏免疫器官指数测定，以此作为免疫状态客观量化指标。
实施例三：
中药型肉鸡免疫抑制模型的指标评价：
1.材料和方法
1.1试验动物与设计
1日龄健康aa肉鸡，隔离饲养至5日龄，选取400只体重相近健康的肉鸡，随机分为4组，每组设5个重复，每个重复20只鸡，分笼饲养，自由采食和饮水，试验期间各组饲养管理条件一致。ⅰ组为空白对照组，灌服与中剂量组相同剂量的生理盐水；ⅱ、ⅲ、ⅳ组为中药型免疫抑制模型低、中、高剂量组，分别按10、20、30ml/kg体重的剂量灌服中药型免疫抑制剂。每天1次灌服，连续用药10天。免疫程序：4组鸡均在7日龄1.5倍量点眼滴鼻接种新城疫ⅳ活疫苗（lasota株）。
1.2主要试剂
鸡淋巴细胞分离液，购于天津灏洋生物制品有限公司；新城疫（nd）标准浓缩抗原、nd标准阳性血清，购于中国兽药监察所；鸡新城疫活疫苗（lasota株），购于齐鲁动物保健品有限公司。
1.3主要仪器
显微镜、恒温培养箱、离心机、微型振荡器、96孔v型反应板、微量移液器等。
1.4检测指标及测定方法
1.4.1白细胞分类计数
在16日龄，每重复随机抽取2只体重相近健康的aa肉鸡，每个处理组共选10只鸡，采血或分离血清。采用常规方法测定。
1.4.2t淋巴细胞阳性率的测定
采用酸性α-醋酸萘酯酶(anae)染色法，计算t淋巴细胞anae阳性细胞百分率。
1.4.3抗体效价测定
采用微量红细胞凝集与凝集抑制（ha-hi）试验对血清样品进行nd抗体测定，以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为抗体效价，用nlog2来表示。
1.4.4免疫器官指数测定
于16日龄，分别称重，颈静脉放血致死，迅速摘取胸腺、脾脏和法氏囊，进行称重并计算其免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重量（g）/试验阶段体重（kg）。
1.5统计分析
试验数据采用spss20.0中one-wayanova过程进行单因素方差分析，并进行duncan’s多重比较，以p<0.05作为差异显著性判断标准，结果以平均值±标准差表示。
2.结果与分析
2.1中药型免疫抑制剂对aa肉鸡白细胞总数的影响
由表1可知，试验ⅱ组肉鸡血液中白细胞总数低于对照组，但二者之间无显著差异（p＞0.05）；试验ⅲ、ⅳ组均显著低于对照组（p＜0.05）。说明中、高剂量的中药型免疫抑制剂可显著降低肉鸡血液中白细胞总数。
表1中药型免疫抑制剂对aa肉鸡白细胞数量的影响(×109/l)
注：同列（行）数据右侧不同小写字母表示差异显著（p<0.05)，下表同。
2.2中药型免疫抑制剂对对aa肉鸡淋巴细胞数量的影响
表2结果表明，试验ⅱ组与对照组相比，肉鸡血液中淋巴细胞数量无显著差异（p＞0.05），试验ⅲ、ⅳ均显著低于ⅱ组和对照组（p＜0.05），试验ⅲ组与ⅳ组之间无显著差异（p＞0.05）。
说明中、高剂量的中药型免疫抑制剂可显著降低肉鸡的淋巴细胞的数量。
表2中药型免疫抑制剂对aa肉鸡淋巴细胞数量的影响(×109/l)
2.3中药型免疫抑制剂对aa肉鸡t淋巴细胞阳性率的影响
由表3结果可知，试验ⅱ组肉鸡t淋巴细胞阳性率低于对照组，但二者之间无显著差异（p＞0.05）；试验ⅲ、ⅳ组均显著低于对照组（p＜0.05）。说明中、高剂量的中药型免疫抑制剂可显著降低肉鸡t淋巴细胞阳性率。
表3中药型免疫抑制剂对aa肉鸡t-淋巴细胞阳性率的影响（%）
2.4中药型免疫抑制剂对aa肉鸡免疫器官指数的影响
由表4可知，试验ⅱ组肉鸡胸腺指数和脾脏指数均低于对照组，但二者均无显著性差异（p＞0.05）；试验ⅱ组肉鸡法氏囊指数显著低于对照组（p＜0.05）。试验ⅲ、ⅳ组肉鸡的胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数均显著低于对照组（p＜0.05）。说明中、高剂量的中药型免疫抑制剂均能显著降低肉鸡免疫器官指数。
表4中药型免疫抑制剂对aa肉鸡免疫器官指数的影响（g·kg-1）
2.5中药型免疫抑制剂对aa肉鸡新城疫疫苗免疫效果的影响
由表5可知，试验ⅱ组与对照组相比肉鸡血液中新城疫抗体效价无显著差异（p＞0.05）；试验ⅲ、ⅳ组均显著低于对照组（p＜0.05）。说明中、高剂量的中药型免疫抑制剂可显著降低新城疫疫苗的免疫抗体效价。
表5中药型免疫抑制剂对aa肉鸡新城疫疫苗免疫效果的影响（log2）
3.结论
综上所述，中药型免疫抑制剂能够显著降低aa肉鸡白细胞总数、淋巴细胞数量、t淋巴细胞阳性率、免疫器官指数和新城疫疫苗的免疫抗体效价。说明用中药型肉鸡免疫抑制剂，按20ml/kg体重的剂量，每天1次灌服，连续用药10天，能很好地建立肉鸡免疫抑制模型。
实施例四：
利用中药型肉鸡免疫抑制模型评估药物或添加剂的免疫增强作用：
1.按照实施例二的方法建立肉鸡免疫抑制模型；
2.试验分为6组，将中药黄芪、当归分别施用于前述肉鸡免疫抑制模型作为试验1组和试验2组，分别施用于健康肉鸡作为药物对照1组和药物对照2组；同时设立空白对照组和免疫抑制模型组。试验从18日龄开始，试验期10天。18日龄3倍量饮水免疫接种新城疫clone30疫苗。于28日龄测定肉鸡白细胞总数、淋巴细胞数量、t淋巴细胞阳性率、免疫器官指数和新城疫疫苗免疫抗体效价等相关指标。
3.观察黄芪、当归两种中药对肉鸡免疫指标的影响，评价其潜在的免疫增强作用。结果见表6。
表6不同中药的免疫增强作用筛选
从表6结果可知，免疫抑制模型组血液中白细胞总数、淋巴细胞总数、t淋巴细胞阳性率以及免疫器官指数和新城疫疫苗免疫抗体效价均显著低于空白对照组（p＜0.05），说明免疫抑制模型成立。
药物对照1组、药物对照2组与空白对照组相比，虽然均有一定程度的免疫增强作用，但与对照组差别均不显著（p＞0.05），说明黄芪、当归两种中药在肉鸡免疫功能正常，很难以评价其免疫增强效果。
试验1组和试验2组与免疫抑制模型组相比，试验1组各项指标显著高于免疫抑制模型组（p＜0.05），而试验2组各项指标与免疫抑制模型组差异不显著（p＞0.05），说明中药黄芪免增强疫效果显著，而中药当归免疫增强作用较弱，故利用免疫抑制模型筛选免疫增强药物时，应把黄芪作为首选药物。
综上所述，本发明公开的建模方法，诱导肉鸡出现典型免疫抑制状态，说明本发明提供的方法可以有效建立肉鸡免疫抑制模型，利用该模型筛选的药物免疫增强效果显著。
上面结合实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。